專利名稱：一種藥物組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藥物組合物及其制備方法，特別是涉及一種治療前列腺增生癥的藥物組合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
前列腺增生癥(BPH)是泌尿科臨床常見病。近年來前列腺增生癥發(fā)病率呈上升趨勢，其治療方法有藥物、熱療、手術(shù)等，但患前列腺增生癥為老年患者，合并癥較多，探索理想的治療藥物十分必要。同時，關(guān)于蜣螂治療的前列腺增生癥的文獻(xiàn)報道很少，其中的有效成分尚不明確，未見其治療前列腺增生癥的藥理實(shí)驗(yàn)研究，及有效浸出物及其制備工藝的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的藥物組合物；本發(fā)明的目的還在于提供一種藥物組合物的制備方法；本發(fā)明的目的還在于提供該藥物組合物的新用途。
本發(fā)明目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
本發(fā)明藥物組合物是按如下重量配比的原料藥制成補(bǔ)骨脂1～5重量份蜣螂1～5重量份；本發(fā)明藥物組合物的優(yōu)選配比為補(bǔ)骨脂1重量份 蜣螂1重量份；本發(fā)明藥物組合物的優(yōu)選配比為補(bǔ)骨脂1重量份 蜣螂4重量份；本發(fā)明藥物組合物的優(yōu)選配比為補(bǔ)骨脂2重量份 蜣螂3重量份；取上述本發(fā)明藥物組合物，按藥劑學(xué)常規(guī)工藝，直接或加入常規(guī)輔料制備成臨床可接受的任何劑型，包括但不限于如下劑型當(dāng)中的一種片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、滴丸等。
本發(fā)明藥物組合物的制備方法為稱取補(bǔ)骨脂、蜣螂；補(bǔ)骨脂加70％～90％的乙醇回流提取2～3次，每次提取時間1.0～2.0小時，每次乙醇用量按體積重量比為6～10倍藥材量，濾過；合并濾液，回收乙醇，濃縮至60℃時相對密度為1.05～1.10；蜣螂加85％～95％的乙醇回流提取1～3次，每次提取時間1.0～3.0小時，每次乙醇用量按體積重量比為6～10倍藥材量，濾過，合并濾液，回收乙醇，濃縮至60℃時相對密度為1.10～1.15，冷藏，除去表面脂肪，與補(bǔ)骨脂濃縮液合并；噴霧干燥，得本發(fā)明藥物組合物干燥浸膏粉；取干燥浸膏粉按常規(guī)工藝制備成任何臨床可接受的固體制劑片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、滴丸等。
上述制備方法中的噴霧干燥工藝可按如下條件進(jìn)行藥液溫度50℃；進(jìn)液速度200-300ml/min；進(jìn)風(fēng)溫度135～145℃；出風(fēng)溫度80-90℃。
本發(fā)明膠囊劑的制備按上述制備方法制備干燥浸膏粉末，取干燥浸膏粉末，以95％的乙醇為潤濕劑制軟材，過40目篩，50～60℃熱風(fēng)干燥，再以40目篩整粒，以15％的歐巴代溶液進(jìn)行流化床包衣，得干燥包衣顆粒，填充1號膠囊，即得。
上述本發(fā)明膠囊劑的制備方法中流化床包衣可按如下條件進(jìn)行進(jìn)液速度40-50ml/min；噴霧壓力0.3(MPa)；蒸汽壓力0.5(MPa)；物料溫度55～50(℃)；進(jìn)風(fēng)溫度78～68(℃)；出風(fēng)溫度40～35(℃)。
本發(fā)明膠囊劑的質(zhì)量控制方法含有如下鑒別方法和/或含量測定方法中的一種或幾種。
鑒別A.取本發(fā)明膠囊劑內(nèi)容物0.5g，加醋酸乙酯20ml，超聲15分鐘，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)哟姿嵋阴?ml溶解，作為供試品溶液；另取補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素對照品，加醋酸乙酯制成每1ml各含2mg的混合溶液，作為對照品溶液；照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各4μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以比例為4∶1的正己烷-醋酸乙酯或比例為9∶1的苯-醋酸乙酯為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10％氫氧化鉀甲醇溶液，置365nm紫外燈下檢視；供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)；B.取本發(fā)明膠囊劑內(nèi)容物0.5g，另取蜣螂對照藥材細(xì)粉1g，分別加50ml蒸餾水超聲提取30分鐘，濾過，濾液用鹽酸調(diào)PH2-3后，通過2×10cm的強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂柱，先用200ml蒸餾水洗，流速1ml/min，棄去水洗液，再用100ml濃度為1mol/L的氫氧化鈉溶液洗脫，流速1ml/min，收集堿洗脫液，用鹽酸調(diào)PH4-5，濃縮至10ml，加等體積的乙醇沉淀，冷藏24小時，過濾，濾液蒸干，殘?jiān)?0％的乙醇溶解，過濾，定容至2ml，作供試品和對照藥材溶液液；照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述溶液各5μl，點(diǎn)樣于同一硅膠G薄層板上，以比例為75∶15∶10的正丁醇-甲酸-水或比例為70∶20∶10的正丁醇-乙酸-水為展開劑，展開，取出，晾干，噴以吲哚醌試液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰；供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；含量測定照高效液相色譜法《中國藥典》2000年(一部)附錄VID測定；色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)C18(250mm×4.6mm，5μm)柱；流動相比例為60∶40的甲醇-水；流速0.8ml/min柱溫35℃；檢測波長245nm；對照品溶液的制備稱取補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素對照品，加甲醇制成濃度各為0.03mg/ml的混合對照品溶液；供試品溶液的制備取裝量差異項(xiàng)下本發(fā)明膠囊劑內(nèi)容物10g，研勻，稱取0.5g置于一錐形瓶中，精密加入甲醇50ml，稱定重量，超聲40min，放冷，再次稱定重量，補(bǔ)充損失甲醇，濾過，取續(xù)濾液，用0.45μm微孔濾膜濾過，即得；測定法吸取供試品溶液和對照品溶液各10μl，照高效液相色譜法試驗(yàn)，測定峰面積，計(jì)算，即得；本發(fā)明膠囊劑含補(bǔ)骨脂素不得低于0.39mg/粒，異補(bǔ)骨脂素不得低于0.42mg/粒。
本發(fā)明藥物組合物的制備方法成本低、操作方便、制成的顆粒劑吸濕性弱，適于工業(yè)化大生產(chǎn)。本發(fā)明對蜣螂進(jìn)行關(guān)于治療前列腺增生癥的藥理實(shí)驗(yàn)研究，確定了有效浸出物，并對其提取工藝進(jìn)行了研究。
本發(fā)明膠囊是由補(bǔ)骨脂、蜣螂組成，具有補(bǔ)腎溫陽、活血化瘀、通利水道之功能，主治前列腺增生癥，腎虛血瘀證候。
藥效學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明膠囊能明顯對抗實(shí)驗(yàn)大鼠、小鼠前列腺增生；能抑制前列腺腺細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)前列腺細(xì)胞調(diào)亡而縮小前列腺體積；增加前列腺間質(zhì)細(xì)胞iNOS的表達(dá)而降低其平滑肌張力；能改善血液流變性和微循環(huán)障礙；能延長醋酸所致小鼠疼痛發(fā)作的潛伏期并減少腹痛的扭體次數(shù)。
綜上所述，本發(fā)明膠囊劑膠囊治療前列腺增生癥療效肯定。臨床結(jié)果表明本發(fā)明膠囊有明顯改善排尿困難癥狀，提高尿流率，減少殘余尿量等作用，具有療效肯定，安全可靠、服用方便等優(yōu)點(diǎn)。
下述實(shí)驗(yàn)例用于進(jìn)一步說明但不限于本發(fā)明。
實(shí)驗(yàn)例1蜣螂有效浸出物的研究1.樣品的制備采用不同溶劑對蜣螂進(jìn)行提取，取蜣螂藥材100g(共4份)，分別用500ml的石油醚、氯仿、乙醇、水加熱回流1小時，濾過，回收溶媒，濃縮，得石油醚提取物(樣A)、氯仿提取物(樣B)、乙醇提取物(樣C)、水提取物(樣D)將上述樣A、B、C、D進(jìn)行藥效學(xué)研究。
2.蜣螂的藥效學(xué)試驗(yàn)表1蜣螂各提取部分對NE誘發(fā)的兔膀胱三角肌收縮的影響(X±S)

*P＜0.05 **P＜0.01與蒸餾水、吐溫-80組比較統(tǒng)計(jì)結(jié)果蜣螂各提取部位中，B(氯仿提取物)、C(乙醇提取物)部位對NE誘發(fā)膀胱三角肌收縮的抑制率與空白組、吐溫組比較有顯著差異.A(石油醚提取物)、D(水提取物)兩部分與空白組及吐溫-80組比較無顯著差異，說明蜣螂的氯仿提取部位、乙醇提取部位為有效提取物，根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果及實(shí)際生產(chǎn)的可行性，選用乙醇來提取蜣螂，為保證制劑的有效性，對蜣螂的不同濃度乙醇提取物進(jìn)行藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)。
3.蜣螂不同濃度乙醇提取物的藥效學(xué)試驗(yàn)稱取蜣螂100g(共三份)，分別加95％、85％、75％的乙醇500ml回流提取1小時，濾過，回收乙醇，濃縮得浸膏，按上述實(shí)驗(yàn)方法考察蜣螂不同濃度乙醇提取物對NE誘發(fā)的兔膀胱三角肌的影響，結(jié)果見表2
表2蜣螂不同濃度乙醇提取物對NE誘發(fā)的兔膀胱三角肌收縮的影響(X±S)

*P＜0.05 **P＜0.01與蒸餾水、吐溫-80組比較結(jié)果表明，蜣螂的95％、85％的乙醇提取物對腎上腺素誘發(fā)的家兔膀胱三角肌有顯著的抑制作用，而75％的乙醇無顯著的抑制作用，95％、85％的乙醇提取物的抑制作用無顯著性差異。
4.蜣螂脂肪部位與非脂肪部位藥效學(xué)試驗(yàn)樣品的制備取蜣螂100g，加500ml濃度為85％的乙醇回流提取1小時，濾過，濾液回收乙醇至100ml，靜置，冷藏24小時，分離表面脂肪，得樣F，水溶液濃縮成稠浸膏得樣E。
樣品E和F的藥效學(xué)試驗(yàn)表3除脂部位(E)和脂肪部位(F)對NE誘發(fā)的兔膀胱三角肌收縮的影響(X±S)

*P＜0.05 **P＜0.01與蒸餾水、吐溫-80組比較結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，E(除脂部分)與空白組、吐溫-80組及F(脂肪部分)有顯著性差異，與高特靈無顯著性差異，效果最好F(脂肪部分)與空白組、吐溫-80無顯著性差異，無藥理活性，為了便于浸膏的干燥和成型，將脂肪除去。
實(shí)驗(yàn)例2補(bǔ)骨脂提取工藝條件的研究1.乙醇回流提取工藝條件的優(yōu)化試驗(yàn)稱取補(bǔ)骨脂20克(共9份)，按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表中工藝條件進(jìn)行提取，濾過，合并濾液，定容于1000ml量瓶中。
采用乙醇回流提取，以補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素含量為評價指標(biāo)，綜合評分分別為50和50，對影響乙醇回流提取的主要因素乙醇濃度、加醇量、提取時間和提取次數(shù)進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)篩選。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、安排見表4、表5。
表4乙醇提取因素水平表

表5 L9(34)正交試驗(yàn)安排、結(jié)果及分析表

表6方差分析表

F0.05(2，2)＝19.00；F0.01(2，2)＝99.00
由正交試驗(yàn)結(jié)果直觀分析，四個因素對提取影響的程度為D(提取次數(shù))最大，其次為C(提取時間)、B(加醇量)、和A(醇濃度)，最佳提取工藝是A1B2C3D3。
由方差分析可知，D(提取次數(shù))有顯著性差異，但提取兩次與提取三次無顯著性差異，其它三個因素影響無顯著性，為降低生產(chǎn)成本，確定最后提取工藝為A1B1C1D2，即加6倍量70％的乙醇回流提取兩次，每次1小時。
2.驗(yàn)證試驗(yàn)為確保提取工藝的合理可行，對最佳工藝條件進(jìn)行三次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果如下。
表7乙醇提取最優(yōu)工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

由上表可見，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性好，說明提取工藝條件基本穩(wěn)定。
實(shí)驗(yàn)例3蜣螂提取工藝條件的研究1.乙醇回流提取工藝條件優(yōu)化試驗(yàn)稱取蜣螂100g(共9份)，按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表進(jìn)行回流提取，濾過，濾液回收乙醇至100ml，靜置，冷藏24小時，分離表面脂肪，溶液定容至200ml，各取20ml，水浴蒸干，殘?jiān)?0ml氯仿超聲30分鐘，過濾，濾液置已恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，殘?jiān)?05℃烘3小時，置于干燥器中冷卻0.5小時，迅速稱重。
采用乙醇回流提取，以氯仿浸出物為指標(biāo)，對影響乙回流提取的主要因素乙醇濃度、加醇量、提取時間、提取次數(shù)進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)篩選。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、安排見表8、表9。
表8乙醇提取因素水平表

表9 L9(34)正交試驗(yàn)安排、結(jié)果及分析表

表10方差分析表

F0.05(2，2)＝19.00；F0.01(2，2)＝99.00由正交試驗(yàn)結(jié)果直觀分析，四個因素對提取影響的程度為A(醇濃度)最大，其次為C(提取次數(shù))、B(加醇倍數(shù))和D(提取時間)，最佳提取工藝是A2B1C3D3。
由方差分析可知，D(提取時間)、B(加醇量)無顯著性差異，A(醇濃度)、C(提取次數(shù))有顯著性差異，為降低生產(chǎn)成本，確定最后提取工藝為A2B1C3D1，即加6倍量85％的乙醇回流提取3次，每次1小時。
2.驗(yàn)證試驗(yàn) 為確保提取工藝的合理可行，對最佳工藝條件進(jìn)行三次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果如下。
表11乙醇提取最優(yōu)工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

由上表可見，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性好，說明提取工藝條件基本穩(wěn)定。
實(shí)驗(yàn)例4本發(fā)明膠囊劑的顆粒的包衣研究為改善顆粒的吸濕性，采用歐巴代防潮型包衣材料對顆粒進(jìn)行包衣。
1.包衣液濃度的考察包衣液中固形物濃度對包衣膜的形成有較大的影響，為此對不同的包衣液的固形物濃度進(jìn)行篩選，結(jié)果見表12。
表12不同包衣液的固形物濃度對包衣后顆粒吸濕性的影響

從上表可知，當(dāng)包衣液中固形物濃度為15％時，包衣操作方便，顆粒吸濕性較弱。
2.包衣材料用量的考察包衣材料的用量直接影響包衣膜的厚度，從而影響顆粒防潮的效果，為減少服用量及降低生產(chǎn)成本，在保證防潮效果的前提下，應(yīng)盡量減少包衣材料的用量，為此對包衣材料的用量(與顆粒重量的百分比)進(jìn)行考察，結(jié)果見表13。
表13包衣材料用量對包衣后顆粒吸濕性的影響

從上表可知，當(dāng)包衣材料用量為顆粒的5％時，顆粒的吸濕性能得到改善，吸濕性較弱。
3.包衣顆粒的吸濕率考察為考查制劑質(zhì)量的穩(wěn)定，對薄膜包衣后的顆粒進(jìn)行吸濕率的測定，方法同浸膏粉吸濕率測定。結(jié)果見表14。
表14包衣顆粒的吸濕率考察

從上表可以看出，包衣顆粒的吸濕性大大改善，吸濕性較弱。
實(shí)驗(yàn)例5本發(fā)明膠囊劑中試研究根據(jù)篩選出的工藝條件，在四川恩威中醫(yī)藥研究所中試車間進(jìn)行放大生產(chǎn)，連續(xù)試制三批中試樣品，結(jié)果見下表。
表15中試生產(chǎn)數(shù)據(jù)

結(jié)果表明，該工藝連續(xù)生產(chǎn)的穩(wěn)定性好，工藝條件易控制可行。設(shè)備通用制藥設(shè)備，適合工業(yè)生產(chǎn)。
實(shí)驗(yàn)例6本發(fā)明膠囊對丙酸睪丸酮致大鼠前列腺增生模型的影響1.受試藥物本發(fā)明膠囊，由四川恩威中醫(yī)藥研究所中試車間提供，批號990601，規(guī)格0.36g/粒，1.67g原生藥/粒；用量及服法臨床上60kg體重成人每次口服4粒，一日3次，即成人日用藥量為(4粒/次×3次/日×1.67g原生藥/粒)÷60kg體重＝0.33g原生藥/kg體重；30天為一療程。試驗(yàn)時配制方法臨用時用蒸餾水配成所需濃度藥液供實(shí)驗(yàn)用，見表16。
保列治，每片含4一氮甾體激素化合物5mg，由美國默沙東公司生產(chǎn)，批號990541，臨床成人每日服用量為5mg(5mg/片，每日1次，每次1片)，即0.083mg/Kg，實(shí)驗(yàn)中大鼠給藥劑量為1.67mg/Kg，相當(dāng)于人用量的20倍。各種藥物臨用前均按其給藥劑量以蒸餾水配制成混懸液，按10ml/Kg給藥。
表16本發(fā)明膠囊的配制方法與給藥劑量計(jì)算

2.實(shí)驗(yàn)方法BPH動物模型的制備及給藥方法 空白組大鼠經(jīng)3‰戊巴比妥鈉以10ml/Kg劑量腹腔注射麻醉后，無菌手術(shù)切開下腹部，游離睪丸，但不切除睪丸，術(shù)后5天自然恢復(fù)后作為空白組。治療組及模型組大鼠經(jīng)3‰戊巴比妥鈉以10ml/Kg劑量腹腔注射麻醉后，無菌切除雙側(cè)睪丸，經(jīng)5天自然恢復(fù)后，按體重隨機(jī)分為5組。其中，丙酸睪丸酮加本發(fā)明膠囊高劑量組、丙酸睪丸酮加本發(fā)明膠囊中劑量組、丙酸睪丸酮加本發(fā)明膠囊低劑量組、丙酸睪丸酮加保列治組每日均經(jīng)皮下注射丙酸睪丸酮0.5mg，并按照表16所列給藥劑量給藥，1次/d；模型組每日經(jīng)皮下注射丙酸睪丸酮0.5mg，并灌胃給予蒸餾水10ml/Kg，1次/d；空白組每日經(jīng)皮下注射注射用水0.1ml，并灌胃給予蒸餾水10ml/Kg，1次/d。連續(xù)給藥30d(中間每周稱重1次以調(diào)整給藥量)，于末次給藥24h后，稱大鼠體重后經(jīng)股動脈放血處死，摘取前列腺，稱重量，并測量前列腺體積(水取代法)及前列腺指數(shù)(每100g體重前列腺重)。

3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1對大鼠前列腺重量、體積的影響結(jié)果見表17。
表17本發(fā)明膠囊對大鼠前列腺重量、體積、指數(shù)的影響(X±SD)

注經(jīng)t檢驗(yàn)，與模型組相比，△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001由表17可見，造模后各組大鼠體重?zé)o顯著性差異。模型組大鼠前列腺重量、體積、前列腺指數(shù)明顯高于空白組(P＜0.001)，表明造模成功。本發(fā)明膠囊6.66g生藥/kg，3.33g生藥/kg組，及保列治組與模型組比較，可極顯著降低前列腺重量，縮小前列腺體積，降低前列腺指數(shù)(P＜0.001)。本發(fā)明膠囊1.67g生藥/kg組可顯著降低前列腺重量，縮小前列腺體積，降低前列腺指數(shù)(P＜0.01)。
3.2對大鼠前列腺組織結(jié)構(gòu)的影響取相同部位前列腺組織。以10％福爾馬林浸泡3d。常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，切片厚度4μm，其中第一張切片作常規(guī)HE染色，觀察前列腺組織結(jié)構(gòu)變化。模型組與空白組相比腺體排列密集，腺體腔變大，腺上皮變厚，部分腺體擴(kuò)張，部分呈乳頭狀突向腔內(nèi)，腔內(nèi)分泌物增多，上皮細(xì)胞部分呈復(fù)層，細(xì)胞核圓或呈卵園型，可見核仁，間質(zhì)小血管擴(kuò)張充血；間質(zhì)平滑肌增多。本發(fā)明膠囊各劑量組及保列治組可見腺腔直徑及腺腔壁厚度較模型組小，腔內(nèi)分泌物減少，間質(zhì)組織平滑肌較疏松。
3.3對大鼠前列腺腺體、間質(zhì)面積，腺上皮厚度等的影響在40×鏡下隨機(jī)選取5個視野，用MIAS-2000型圖形圖像分析系統(tǒng)計(jì)算5個視野內(nèi)腺體數(shù)目，測量每個腺體周長，測量腺體、間質(zhì)面積，腺體壁面積、腺體壁核度。再計(jì)算腺體與間質(zhì)面積比(腺體面積/間質(zhì)面積)，腺體總體積，間質(zhì)總體積。統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表18、19、20、21所示。


表18本發(fā)明膠囊對大鼠前列腺腺體數(shù)目、周長、面積的影響(X±SD)

注經(jīng)t檢驗(yàn)，與模型組相比△P＜0.05，△△P＜0.01。
由表18可見，模型組腺體平均周長、面積均較空白組明顯增大，5個視野內(nèi)腺體數(shù)目較空白組明顯減少。本發(fā)明膠囊6.66g生藥/kg，3.33g生藥/kg，1.67g生藥/kg組及保列治組與模型組相比，均可顯著降低腺體平均面積、平均周長，并顯著增加5個視野內(nèi)腺體總數(shù)目(P＜0.01)。
表19本發(fā)明膠囊對5個視野內(nèi)腺體、間質(zhì)總面積，腺體間質(zhì)比的影響(X±SD)

注經(jīng)t檢驗(yàn)，與模型組相比，△P＜0.05，△△P＜0.01由表19可見，模型組大鼠前列腺5個視野內(nèi)腺體總面積較空白組明顯增大(P＜0.01)，而間質(zhì)總面積較空白組顯著減小，故腺體間質(zhì)面積比明顯大于空白組。本發(fā)明膠囊各劑量組及保列治組腺體總面積、腺體間質(zhì)面積比與模型組相比有降低的趨勢，間質(zhì)總面積與模型組相比有增高的趨勢，但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
表20本發(fā)明膠囊對前列腺腺體、間質(zhì)總體的影響(X±SD)

注經(jīng)t檢驗(yàn)，與模型組相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。
由表20可見，模型組大鼠前列腺腺體、間質(zhì)總體積均明顯大于空白組。本發(fā)明膠囊各劑量組及保列治組與模型組相比，可明顯降低前列腺腺體及間質(zhì)總體積(P＜0.01，P＜0.05)。
結(jié)合表19及表20，模型組大鼠腺體面積高于空白組而間質(zhì)面積低于空白組，但模型組大鼠前列腺腺體及間質(zhì)總體積均高于空白組而以腺體面積更為明顯。說明由睪酮導(dǎo)致的前列腺增生，腺體及間質(zhì)組織均出現(xiàn)增生而以腺體增生為主。本發(fā)明膠囊各劑量組及保列治組均可降低前列腺腺體及間質(zhì)組織的體積，對腺體間質(zhì)面積比無影響。
表21本發(fā)明膠囊對大鼠前列腺腺體壁核度、面積、積分光密度的影響(X±SD)

注經(jīng)t檢驗(yàn)，與模型組相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。
腺體壁核度及積分光密度代表腺上皮細(xì)胞的密集程度。由表21可見，模型組腺體壁面積、核度及積分光密度均較空白組明顯增高。本發(fā)明膠囊各劑量組及保列治組腺壁面積及積分光密度均較模型組降低，表明本發(fā)明膠囊各劑量組及保列治組腺體壁面積及腺上皮細(xì)胞密集程度均較模型組降低。
3.4本發(fā)明膠囊對前列腺組織結(jié)構(gòu)影響的體視學(xué)研究在40×鏡下隨機(jī)選取5個視野，用MIAS-2000型圖形圖像分析系統(tǒng)計(jì)算腺體及腺體腔的單位體積粒子平均直徑(D)、平均曲率(K)、粒子表面積/粒子體積(Rsv)、數(shù)密度(Nv)、體積密度(Vv)、單位體積粒子平均表面積(S)、單位體積粒子平均體積(V)、表面積密度(Sv)、球形因子(S.g)等指標(biāo)。
①本發(fā)明膠囊對大鼠前列腺腺體體視學(xué)的影響(1)本發(fā)明膠囊對腺體密度參數(shù)的影響，結(jié)果如表22所示。
表22本發(fā)明膠囊對Vv、Sv及Nv的影響(X±SD)

注經(jīng)t檢驗(yàn)，與模型組相比，△P＜0.05，△△P＜0.01數(shù)密度(Nv)指單位參照體積中含有的某相粒子數(shù)，表面積密度(Sv)指單位參照體積中某相所占的表面積多少，體積密度(Vv)指單位參照體積中某相所占的體積。由表22可見，模型組腺體Nv較空白組減少，本發(fā)明膠囊各劑量組及保列治Nv組較模型組均明顯增多。模型組腺體Vv和Sv與空白組相比，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本發(fā)明膠囊各劑量組及保列治組Nv和Sv均較模型組增加(P＜0.01)，但Vv與模型組相比無顯著性差異。
說明，本發(fā)明膠囊各劑量組及保列治組單位體積內(nèi)腺體數(shù)目、腺體表面積增加，但單位體積內(nèi)腺體體積無明顯變化。
(2)本發(fā)明膠囊對腺體形狀參數(shù)的影響，結(jié)果如表23所示。
表23本發(fā)明膠囊對Rsv、S.g、S、K的影響(X±SD)

注經(jīng)t檢驗(yàn)，與模型組相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。
粒子表面積/粒子體積(Rsv)指某相結(jié)構(gòu)的表面積與其體積之比，即比表面，平均曲率(K)反應(yīng)表面彎曲的程度，單位體積粒子平均表面積(S)指單位體積內(nèi)某項(xiàng)粒子表面積大小的平均值，球形因子(S.g)表示粒子形狀與球形的接近程度，S.g越接近1，粒子形態(tài)越接近球形。
由表23可見，各組間腺體與球形的接近程度無差異。模型組腺體比表面及腺體彎曲程度較空白組降低，而單位體積內(nèi)腺體表面積較空白組增大。本發(fā)明膠囊各劑量組及保列治組腺體比表面及腺體彎曲程度較模型組顯著增大(P＜0.01)，而單位體積內(nèi)腺體平均表面積較模型組顯著降低(P＜0.01)。
說明，本發(fā)明膠囊各劑量及保列治治療后可使單位體積內(nèi)腺體平均表面積顯著降低，而使彎曲程度及比表面顯著增大。
(3)本發(fā)明膠囊對腺體尺寸參數(shù)的影響，結(jié)果見表24。
表24本發(fā)明膠囊對腺體D、V的影響(X±SD)

注經(jīng)t檢驗(yàn)，與模型組相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。
單位體積粒子平均直徑(D)指單位體積內(nèi)某三維粒子的平均直徑、單位體積粒子平均體積(V)指單位體積內(nèi)某類粒子的平均體積。由表24可見，模型組D和V均較空白組明顯增高，本發(fā)明膠囊各劑量組及保列治組D和V均較模型組降低。說明，給予本發(fā)明膠囊及保列治后，腺體平均體積縮小，腺體平均直徑變小(P＜0.01)。
綜合表22、23、24可見，經(jīng)本發(fā)明膠囊各劑量及保列治治療后，腺體平均體積、平均直徑及平均表面積縮小，單位體積內(nèi)腺體數(shù)目及表面積增大，腺體彎曲程度及比表面增大。
②本發(fā)明膠囊對大鼠前列腺腺體壁體視學(xué)的影響。
(1)本發(fā)明膠囊對大鼠前列腺腺體壁密度參數(shù)的影響，結(jié)果如表25所示。
表25本發(fā)明膠囊對腺體壁Sv、Vv及Nv的影響(X±SD)

注經(jīng)t檢驗(yàn)，與模型組相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。
由表25可見，模型組腺體壁Sv和Nv較空白組減少，Vv較空白組增加。本發(fā)明膠囊各劑量組及保列治組Sv較模型組明顯增多(P＜0.01)，而Nv與模型組相比有增多的趨勢，Vv與模型組相比有降低的趨勢，但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
說明，給予本發(fā)明膠囊各劑量及保列治后，單位體積內(nèi)腺體壁表面積增加。
(2)本發(fā)明膠囊對腺體壁形狀參數(shù)的影響，結(jié)果如表26所示。
表26本發(fā)明膠囊對腺體壁Rsv、S.g、S、K的影響(X±SD)

注經(jīng)t檢驗(yàn)，與模型組相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。
由表26可見，各組間腺體壁與球形的接近程度無差異。模型組腺體壁比表面及腺體壁彎曲程度較空白組降低，而單位體積內(nèi)腺體壁平均表面積較空白組增大。本發(fā)明膠囊小劑量組及保列治組腺體壁比表面較模型組顯著增大，本發(fā)明膠囊各劑量組及保列治組單位體積內(nèi)腺體壁平均表面積較模型組降低(P＜0.01)。而腺體壁彎曲程度與模型組相比無差異。
說明，經(jīng)本發(fā)明膠囊各劑量及保列治治療后可使單位體積內(nèi)腺體壁平均表面積降低，而使腺體壁比表面增大，但對腺體壁彎曲程度及與球形的接近程度無影響。
(3)本發(fā)明膠囊對腺體尺寸參數(shù)的影響，結(jié)果見表27。
表27本發(fā)明膠囊對腺體壁D、V的影響(X±SD)

注經(jīng)t檢驗(yàn)，與模型組相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。
由表27可見，模型組D和V均較空白組明顯增高，本發(fā)明膠囊各劑量組及保列治組D和V均較模型組降低(P＜0.01)。說明，本發(fā)明膠囊及保列治治療后，腺體壁平均體積縮小，腺體壁平均直徑變小。
綜合表25、26、27可見，經(jīng)本發(fā)明膠囊各劑量及保列治治療后，腺體壁平均體積及平均表面積縮小，而單位體積內(nèi)腺體壁表面積增大。但本發(fā)明膠囊小劑量及保列治紐腺體壁比表面增大。
4結(jié)論4.1動物模型的評價 本實(shí)驗(yàn)采用公認(rèn)的BPH造模方法(大鼠去勢后注射睪酮導(dǎo)致BPH造模法)。結(jié)果表明，模型組大鼠前列腺重量、體積、指數(shù)均較空白組增加，光鏡及體視學(xué)研究結(jié)果均與上述結(jié)論相符。模型動物給予保列治后，上述各項(xiàng)指標(biāo)均得以不同程度的恢復(fù)。人類BPH間質(zhì)增生較明顯，本模型大鼠的間質(zhì)也明顯增生，說明本模型與人BPH符合，模型是成功的。
4.2本發(fā)明膠囊的療效評價 模型動物給予本發(fā)明膠囊各劑量組及保列治均可縮小前列腺體積，降低前列腺重量及指數(shù)。鏡下觀察及計(jì)算可知本發(fā)明膠囊各劑量組及保列治組可縮小腺體及間質(zhì)總體積，縮小腺體面積、周長，腺體壁面積，降低腺體上皮細(xì)胞的密集程度。體視學(xué)研究表明，腺體及腺體壁的平均體積、平均直徑、平均表面積縮小，單位體積內(nèi)腺體及腺體壁面積、數(shù)目、比表面增大。說明本發(fā)明膠囊對于丙酸睪丸酮所致的大鼠前列腺增生模型具有明顯的對抗作用。
實(shí)驗(yàn)例7本發(fā)明膠囊對丙酸睪丸酮致大鼠前列腺增生模型前列腺細(xì)胞增殖的影響
1.實(shí)驗(yàn)方法1.1BPH動物模型的制備及給藥方法見實(shí)驗(yàn)例6。
1.2免疫組化染色SP法染色，按試劑盒說明書操作，以試劑盒中提供的陽性片為陽性對照，以PBS液替代一抗、二抗作為陰性對照。200×鏡下觀察，每張切片取5個視野，細(xì)胞胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為Ki-67陽性細(xì)胞，每個標(biāo)本上數(shù)100個細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)，算出相應(yīng)指數(shù)；陽性細(xì)胞著色面積及著色深淺以MIAS-2000型圖形圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。
2.結(jié)果Ki-67陽性著色為細(xì)胞核著棕黃色。在正常大鼠前列腺組織中Ki-67陽性著色于腺上皮細(xì)胞；在模型組Ki-67陽性主要著色于上皮全層及間質(zhì)組織，染色較深；去勢組腺上皮及間質(zhì)組織Ki-67陽性著色面積較少，染色較淺；本發(fā)明膠囊6.66g生藥/kg，3.33g生藥/kg，1.67g生藥/kg組及保列治組Ki-67陽性主要著色于腺上皮細(xì)胞，但染色較淺，明顯低于模型組。如表28所示。
表28 本發(fā)明膠囊對大鼠前列腺組織Ki-67的影響(X±SD)

注經(jīng)t檢驗(yàn)，與空白組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組比較，※P＜0.05，※※P＜0.01。
由上表可見，模型組Ki-67指數(shù)、陽性細(xì)胞核平均面積、Ki-67染色黑度、積分光密度均高于空白組；本發(fā)明膠囊6.66g生藥/kg，3.33g生藥/kg，1.67g生藥/kg組及保列治組上述各項(xiàng)指標(biāo)均低于模型組。表明模型動物給予各劑量的本發(fā)明膠囊及保列治后能縮小前列腺體積的機(jī)理與其能抑制前列腺細(xì)胞增殖有關(guān)。
3結(jié)論本研究以免疫組化結(jié)合計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析的結(jié)果表明，本發(fā)明膠囊6.66g生藥/kg，3.33g生藥/kg，1.67g生藥/kg組均明顯抑制了前列腺組織中Ki-67的表達(dá)(P＜0.01)，進(jìn)而抑制了前列腺上皮及間質(zhì)細(xì)胞的增殖。
實(shí)驗(yàn)例8本發(fā)明膠囊對丙酸睪丸酮致大鼠前列腺增生模型前列腺組織bcl-2蛋白表達(dá)的影響1.實(shí)驗(yàn)方法1.1BPH動物模型的制備及給藥方法 見實(shí)驗(yàn)例6。
1.2免疫組化染色SP法染色，按試劑盒說明書操作，以試劑盒中提供的陽性片為陽性對照，以PBS液替代一抗、二抗作為陰性對照。20倍鏡下觀察，每張切片取10個視野，細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為bcl-2陽性細(xì)胞。以MIAS-2000型圖形圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。
2.結(jié)果bcl-2蛋白陽性著色為細(xì)胞漿著棕黃色。在正常大鼠前列腺組織中bcl-2蛋白陽性著色沿腺上皮基底細(xì)胞層分布；在模型組大鼠前列腺組織中bcl-2蛋白陽性著色于上皮全層及間質(zhì)組織，染色較深；在本發(fā)明膠囊各劑量組及保列治組bcl-2蛋白陽性主要著色于腺上皮細(xì)胞，但染色較淺，明顯低于模型組。各組前列腺組織中bcl-2蛋白表達(dá)情況如表29所示。
表29本發(fā)明膠囊對大鼠前列腺組織bcl-2的影響(X±SD)

注經(jīng)t檢驗(yàn)，與空白組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組比較，※P＜0.05，※※P＜0.01。
3.結(jié)論本研究以免疫組化結(jié)合計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析的結(jié)果表明，本發(fā)明膠囊6.66g生藥/kg，3.33g生藥/kg，1.67g生藥/kg組均明顯抑制了前列腺組織中bcl-2蛋白的表達(dá)(P＜0.01)，進(jìn)而誘導(dǎo)了前列腺上皮及間質(zhì)細(xì)胞的凋亡。
實(shí)驗(yàn)例9本發(fā)明膠囊對丙酸睪丸酮致大鼠前列腺增生模型前列腺平滑肌組織的影響1.實(shí)驗(yàn)方法1.1BPH動物模型的制備及給藥方法 見實(shí)驗(yàn)例6。
1.2免疫組化染色SP法染色，按試劑盒說明書操作，以試劑盒中提供的陽性片為陽性對照，以PBS液替代一抗、二抗作為陰性對照。20倍鏡下觀察，每張切片取10個視野，細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為α-SMA陽性細(xì)胞。以MIAS-2000型圖形圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。
2.結(jié)果α-SMA陽性著色為細(xì)胞漿著棕黃色。在正常大鼠前列腺組織中α-SMA蛋白陽性著色于間質(zhì)平滑肌細(xì)胞；在模型組大鼠前列腺組織中α-SMA陽性著色于間質(zhì)平滑肌細(xì)胞及腺上皮基底細(xì)胞，染色較深在本發(fā)明膠囊各劑量組及保列治組α-SMA陽性主要著色于間質(zhì)平滑肌細(xì)胞及腺上皮基底細(xì)胞，但染色較淺，明顯低于模型組。各組前列腺組織中α-SMA表達(dá)情況如表30所示。
表30 本發(fā)明膠囊對大鼠前列腺組織a-SMA的影響(X±SD)

注經(jīng)t檢驗(yàn)，與空白組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組比較，※P＜0.05，※※P＜0.01。
3.結(jié)論本研究表明，睪酮致大鼠前列腺增生模型的前列腺平滑肌組織明顯增生，給予本發(fā)明膠囊6.66g生藥/kg，3.33g生藥/kg，1.67g生藥/kg平滑肌成分明顯減少(P＜0.01)，說明本發(fā)明膠囊可抑制前列腺平滑肌細(xì)胞的增生，進(jìn)而緩解BPH的靜力性因素。
實(shí)驗(yàn)例10本發(fā)明膠囊對丙酸睪丸酮致大鼠前列腺增生模型前列腺間質(zhì)組織誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)表達(dá)的影響1.實(shí)驗(yàn)方法1.1BPH動物模型的制備及給藥方法 見實(shí)驗(yàn)例6。
1.2免疫組化染色SP法染色，按試劑盒說明書操作，以試劑盒中提供的陽性片為陽性對照，以PBS液替代一抗、二抗作為陰性對照。20倍鏡下觀察，每張切片取10個視野，細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為iNOS陽性細(xì)胞。以MIAS-2000型圖形圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析；2.結(jié)果iNOS陽性著色為細(xì)胞漿著棕黃色。實(shí)驗(yàn)各組間質(zhì)組織中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)均有表達(dá)。各組前列腺組織中iNOS表達(dá)情況如下表所示。
表31 本發(fā)明膠囊對大鼠前列腺間質(zhì)組織iNOS的影響(X±SD)

注經(jīng)t檢驗(yàn)，與空白組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組比較，※P＜0.05，※※P＜0.01。
如上表所示，空白組大鼠前列腺間質(zhì)組織中iNOS陽性著色較淺，著色面積較小；而模型組大鼠前列腺間質(zhì)組織中iNOS陽性著色黑度較空白組淺，著色面積較空白組小，積分光密度較空白組低；本發(fā)明膠囊各劑量組及保列治組iNOS陽性著色黑度、面積與積分光密度均顯著高于模型組。
3.結(jié)論本研究以免疫組化結(jié)合計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析的結(jié)果表明，本發(fā)明膠囊6.66g生藥/kg，3.33g生藥/kg，1.67g生藥/kg組均可增加前列腺間質(zhì)組織中iNOS的表達(dá)，說明本發(fā)明膠囊治療BPH的作用機(jī)理之一是通過增加對前列腺平滑肌松弛有介導(dǎo)作用的NOS而緩解BPH的動力性因素。
實(shí)驗(yàn)例11本發(fā)明膠囊對丙酸睪丸酮致大鼠前列腺增生模型前列腺上皮組織誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)表達(dá)的影響1.實(shí)驗(yàn)方法1.1 BPH動物模型的制備及給藥方法見實(shí)驗(yàn)例6。
1.2免疫組化染色SP法染色，按試劑盒說明書操作，以試劑盒中提供的陽性片為陽性對照，以PBS液替代一抗、二抗作為陰性對照。20倍鏡下觀察，每張切片取10個視野，細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為iNOS陽性細(xì)胞。以MIAS-2000型圖形圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。
2.結(jié)果iNOS陽性著色為細(xì)胞漿著棕黃色。實(shí)驗(yàn)各組iNOS均陽性著色于腺上皮全層，各組前列腺上皮組織中iNOS表達(dá)情況如下表所示。
表32 本發(fā)明膠囊對大鼠前列腺組織iNOS的影響(X±SD)

注經(jīng)S-N-K檢驗(yàn)，與空白組比較，△AP＜0.05，△△P＜0.01；與模型組比較，※P＜0.05，※※P＜0.01。
如上表所示，模型組前列腺上皮組織染色較淺，著色面積較小，積分光密度較小。本發(fā)明膠囊各劑量組及保列治組iNOS染色平均黑度明顯高于模型組；本發(fā)明膠囊6.66g生藥/Kg、3.33g生藥/Kg組及保列治組陽性細(xì)胞總面積較模型組大。本發(fā)明膠囊6.66g生藥組及保列治組積分光密度較模型組大，本發(fā)明膠囊3.33g生藥、1.67g生藥組積分光密度與模型組相比無顯著性差異。
3.結(jié)論本研究以免疫組化結(jié)合計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析的結(jié)果表明，本發(fā)明膠囊明顯抑制了前列腺上皮組織中iNOS的表達(dá)。說明本發(fā)明膠囊治療BPH的作用機(jī)理之一是增加前列腺上皮組織中iNOS的表達(dá)，誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡，而縮小前列腺體積，進(jìn)而緩解BPH的靜力性因素。
實(shí)驗(yàn)例12本發(fā)明膠囊對丙酸睪丸酮致小鼠前列腺增生模型的影響1.實(shí)驗(yàn)方法選用健康合格的全雄昆明種小鼠110只，按體重隨機(jī)分成模型組和空白組，模型組84只，空白組26只。模型組每日皮下注射10mg/kg丙酸睪丸酮，空白組于皮下注射等容積注射用水，共注射10天。10天后將模型組及正常組各隨機(jī)抽取12只小鼠處死，取下前列腺，稱量并計(jì)算前列腺重及前列腺指數(shù)以確定造模成功。然后將剩余模型組小鼠再隨機(jī)分成5組，分別為本發(fā)明膠囊大、中、小劑量組，模型組及保列治對照組。各試藥組按表33所示灌胃(模型組灌胃等容生理鹽水)并每日于皮下按10mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)注射丙酸睪丸酮?？瞻捉M于皮下注射等容積注射用水并同時灌胃給予等容積生理鹽水。連續(xù)20天。20天后處死全部動物，稱量并記錄每只小鼠的體重及前列腺重量，計(jì)算前列腺指數(shù)。

表33 本發(fā)明膠囊的配制方法與給藥劑量計(jì)算

取相同部位前列腺組織，以10％福爾馬林浸泡3d。常規(guī)石蠟包埋、切片，切片厚度4μm，作常規(guī)HE染色，在40×鏡下觀察前列腺組織結(jié)構(gòu)變化。并用MIAS-2000型圖形圖像分析系統(tǒng)計(jì)算1個視野內(nèi)每個腺體周長、面積、等效圓直徑、最大直徑。再測量整個視野內(nèi)全部腺體面積(腺體總面積)、全部間質(zhì)面積(間質(zhì)總面積)，并計(jì)算腺體與間質(zhì)面積比(腺體面積/間質(zhì)面積)。
2.結(jié)果2.1本發(fā)明膠囊對小鼠前列腺重量及指數(shù)的影響結(jié)果見表34、35表34 造模10天后小鼠前列腺重、前列腺指數(shù)的比較(X±SD)

注經(jīng)t檢驗(yàn)，與模型組相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。
如上表所示，造摸后模型組與空白組相比體重?zé)o顯著差別；模型組造模10天后前列腺重、前列腺指數(shù)均顯著高于空白組，說明造模型成功。
表35 本發(fā)明膠囊對小鼠前列腺重、前列腺指數(shù)的影響(X±SD)

注經(jīng)t檢驗(yàn)，與模型組相比，△P＜0.05，△△P＜0.01如上表所示，模型組小鼠前列腺重量、前列腺指數(shù)明顯高于空白組，說明造模型成功。本發(fā)明膠囊6.66g生藥/kg，3.33g生藥/kg，1.67g生藥/kg組及保列治組可明顯降低前列腺重量、前列腺指數(shù)(P＜0.05，0.01)。
2.2本發(fā)明膠囊對小鼠前列腺組織結(jié)構(gòu)的影響模型組與空白組相比腺體排列密集，腺體腔變大，腺上皮變厚，部分腺體擴(kuò)張，部分呈乳頭狀突向腔內(nèi)，腔內(nèi)分泌物增多，上皮細(xì)胞部分呈復(fù)層，細(xì)胞核圓或呈卵園型，間質(zhì)小血管擴(kuò)張充血；間質(zhì)平滑肌增多。本發(fā)明膠囊各劑量組及保列治組可見腺腔直徑及腺腔壁厚度較模型組小，腔內(nèi)分泌物減少，間質(zhì)組織平滑肌較疏松。
2.3本發(fā)明膠囊對小鼠前列腺腺體平均面積、周長的影響結(jié)果見表36表36本發(fā)明膠囊對小鼠前列腺腺體平均面積和周長的影響(X±SD)

注經(jīng)t檢驗(yàn)，與模型組相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。
如上表所示，模型組腺體平均面積、周長均較空白組大(P＜0.01)，說明模型是成功的。本發(fā)明膠囊各劑量組及保列治組與模型組相比，可顯著降低腺體平均面積、平均周長(P＜0.01)。說明本發(fā)明膠囊各劑量組與保列治組均可縮小腺體及腺腔面積。
2.4本發(fā)明膠囊對小鼠前列腺腺體等效圓直徑及最大直徑的影響結(jié)果見表37表37本發(fā)明膠囊對小鼠前列腺腺體等效圓直徑和最大直徑的影響(X±SD)

注經(jīng)t檢驗(yàn)，與模型組相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。
如上表所示，模型組腺體等效園直徑及最大直徑均明顯高于空白組(P＜0.01)，說明模型是成功的。本發(fā)明膠囊各劑量組及保列治組與模型組相比，均可顯著降低腺體平均等效圓直徑和最大直徑(P＜0.05，0.01)。
2.5本發(fā)明膠囊對小鼠前列腺腺體總面積、間質(zhì)總面積及腺體間質(zhì)面積比的影響結(jié)果見表38表38本發(fā)明膠囊對腺體總面積、間質(zhì)總面積、腺體間質(zhì)面積比的影響(X±SD)

注經(jīng)t檢驗(yàn)，與模型組相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。
如表所示模型組大鼠前列腺視野內(nèi)腺體總面積較空白組增大，而間質(zhì)總面積較空白組顯著減小，故腺體間質(zhì)面積比明顯大于空白組。本發(fā)明膠囊各劑量組及保列治組腺體總面積、腺體間質(zhì)面積比與模型組相比有降低的趨勢，間質(zhì)總面積與模型組相比有增高的趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
3.結(jié)論本發(fā)明膠囊6.66g生藥/kg，3.33g生藥/kg，1.67g生藥/kg組及保列治組均可降低小鼠前列腺重量及指數(shù)。鏡下觀察及計(jì)算可知本發(fā)明膠囊各劑量組及保列治組可縮小腺體面積、周長、等效園直徑、最大直徑，同時可使間質(zhì)組織平滑肌疏松。本發(fā)明膠囊各劑量組及保列治組對視野內(nèi)腺體、間質(zhì)總面積以及腺體間質(zhì)面積比無顯著影響，提示本發(fā)明膠囊各劑量組及保列治組在縮小前列腺腺體的同時對間質(zhì)也有一定的縮小。表明本發(fā)明膠囊對丙酸睪丸酮致小鼠前列腺增生模型具有顯著的對抗作用。
實(shí)驗(yàn)例14本發(fā)明膠囊對“血瘀”大鼠血液流變性的影響體重140～180g的SD大鼠60只，雌雄各半，在本實(shí)驗(yàn)室喂養(yǎng)一周后，按性別、體重隨機(jī)分為6組。按表39所列劑量灌胃給藥，每日一次，連續(xù)給藥7天，給藥容積為1ml/100g，模型組與對照組灌服等容積4％淀粉溶液。末次給藥后1小時，自尾靜脈快速推注10％高分子右旋糖酐0.7ml/kg，1小時后從大鼠眼眶靜脈叢取血于肝素抗凝管中，用R-80A血液流變儀測定血液流變學(xué)多項(xiàng)指標(biāo)。
表39 本發(fā)明膠囊及丹參片的配制方法與給藥劑量計(jì)算

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表40、41。
表40本發(fā)明膠囊對“血瘀”大鼠血漿粘度、紅細(xì)胞壓積的影響(X±SD)

△△△表示與空白組比較p＜0.01。***表示與模型組比較p＜0.01。
表41本發(fā)明膠囊對“血瘀”大鼠全血粘度的影響(X±SD)

△△△表示與空白組比較p＜0.01。***表示與模型組比較p＜0.01。
結(jié)果表明大鼠注射高分子右旋糖酐后，出現(xiàn)血液流變學(xué)特性的明顯改變，全血粘度、血漿粘度、紅細(xì)胞壓積均顯著增高(P＜0.01)。本發(fā)明膠囊6.66g生藥/kg，3.33g生藥/kg，1.67g生藥/kg均可以顯著降低“血瘀”大鼠的血漿粘度(P＜0.01)。
實(shí)驗(yàn)例15本發(fā)明膠囊對小鼠腸系膜微循環(huán)的影響昆明種小鼠60只，雌雄各半，按性別、體重隨機(jī)分為5組，每組12只。按表42所列劑量值灌胃給藥，給藥容積為0.2ml/10g，對照組灌服等容積4％淀粉懸浮液。每天給藥一次，連續(xù)給藥7天，末次給藥1小時后，用戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔注射小鼠，使之麻醉，剖腹，輕輕拉出腸系膜放在有機(jī)玻璃觀察臺上，滴入適量臺氏液(37℃恒溫)。用WX-6型多部位微循環(huán)儀先觀察毛細(xì)血管開放數(shù)，測量第三級分枝細(xì)動脈(A3)和細(xì)靜脈(V3)的管徑，觀察血液流態(tài)(采用田氏定量法，分七個等級及相應(yīng)的權(quán)分線流0、線粒流0.2、粒線流0.4、粒流0.8、粒緩流1.6、粒擺流4、停滯6，按權(quán)分計(jì)量)。隨即于同一部位滴加1∶10000腎上腺素(Adr)15μl，鏡下觀察滴Adr后1、5、10、15分鐘后A3、V3管徑變化。
表42 本發(fā)明膠囊及丹參片的配制方法與給藥劑量計(jì)算

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表43、表44、表45、表46。
表43 本發(fā)明膠囊對毛細(xì)血管開放數(shù)的影響(X±SD)

與對照組比較，*P＜0.05表44 本發(fā)明膠囊對血液流態(tài)的影響(X±SD)

與對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01。
表45 本發(fā)明膠囊對A3管徑的影響(X±SD)

與對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01。
表46 本發(fā)明膠囊對V3管徑的影響(X±SD)

結(jié)果表明本發(fā)明膠囊6.66g生藥/kg，3.33g生藥/kg，1.67g生藥/kg均能顯著減輕Adr對血管的收縮作用(P＜0.05)，改善血液狀態(tài)，拮抗Adr對A3的收縮作用(P＜0.01)，并增加毛細(xì)血管開放數(shù)。
實(shí)驗(yàn)例16本發(fā)明膠囊對醋酸所致小鼠疼痛的影響取昆明種小鼠50只，按體重隨機(jī)分成5組，每組10只。分別為本發(fā)明膠囊大、中、小劑量組，陽性對照組及空白組。按表47所列劑量灌胃給藥。連續(xù)三天。末次灌胃1小時后，將室溫恒定在20℃左右，于每只受試動物的腹腔注射0.6％的醋酸溶液0.2ml/只，觀察小鼠扭體反應(yīng)，指標(biāo)為小鼠出現(xiàn)腹部內(nèi)凹，軀干與后肢伸張，臀部高起。觀察每只小鼠扭體反應(yīng)的潛伏期(注藥完畢到出現(xiàn)第一次扭體的時間)，30分鐘內(nèi)每只小鼠的扭體次數(shù)，并按下式計(jì)算扭體抑制率。結(jié)果見表47。
表47 本發(fā)明膠囊的配制方法與給藥劑量計(jì)算


表48 本發(fā)明膠囊對醋酸溶液所致小鼠扭體的影響(X±SD)

注經(jīng)t檢驗(yàn)，與空白組相比，△P＜0.05，△△P＜0.01如表所示，本發(fā)明膠囊6.66g生藥/kg，3.33g生藥/kg，1.67g生藥/kg組與空白組相比其扭體潛伏期均有顯著差異(P＜0.01)。本發(fā)明膠囊6.66g生藥/kg組30分鐘內(nèi)扭體次數(shù)與空白組相比有顯著差異(P＜0.05)。
結(jié)果表明本發(fā)明膠囊各劑量組能明顯延長醋酸所致小鼠疼痛發(fā)作的潛伏期；本發(fā)明膠囊6.66g生藥/kg組還能減少醋酸所致小鼠腹痛的扭體次數(shù)。
實(shí)驗(yàn)例16本發(fā)明膠囊臨床研究為評估本發(fā)明膠囊對良性前列腺增生癥(BPH)的療效和安全性，于1999年9月至2000年3月對30例BPH進(jìn)行了臨床觀察。治療觀察1月。病例選擇標(biāo)準(zhǔn)、前列腺增生診斷標(biāo)準(zhǔn)均參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》(1997)。臨床試驗(yàn)結(jié)果如下。
1.總療效顯效11例(36.67％)，進(jìn)步15例(50％)，無效4例(13.33％)。
2.I-PSS、生活質(zhì)量指數(shù)(QOL)的變化表49 I-PSS及QOL變化

注*表示與治療前比較p＜0.05，**表示與治療前比較p＜0.01(下同)。
3.尿流率的變化表50 最大尿流率(Qmax)、平均尿流率(AFR)比較

注p值表示同上。
4.殘余尿量(PVR)的變化表51殘余尿量(PVR)比較

注p值表示同上。
5.前列腺體積變化表52 前列腺體積(ml)比較

6.中醫(yī)癥狀變化表53 治療前后中醫(yī)癥狀積分比較(分)

注P值表示同上從上表可看出，克癃膠囊對中醫(yī)主要癥狀夜尿頻數(shù)，排尿困難，小腹癥狀有明顯改善作用。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明病人主觀癥狀明顯改善，I-PSS評分降低62.0％，生活質(zhì)量指數(shù)(QoL)下降31.9％(p＜0.01)；最大尿流率(MRF)和平均尿流率(AFR)分別提高63.7％、75.1％(p＜0.01)；24例殘余尿(PVR)下降46.8％(p＜0.01)。10病人于治療前和治療結(jié)束時檢測了其血、尿、大便常規(guī)，以及肝功、腎功、心電圖。均無明顯變化。治療期間未出現(xiàn)不良反應(yīng)。認(rèn)為本發(fā)明膠囊治療BPH安全有效。
本發(fā)明下述實(shí)施例均能達(dá)到上述實(shí)驗(yàn)例的效果。
實(shí)施例1取補(bǔ)骨脂1千克、蜣螂4千克，加入輔料，按藥劑學(xué)常規(guī)制備工藝制成片劑。
實(shí)施例2取補(bǔ)骨脂5千克、蜣螂1千克，加入輔料，按藥劑學(xué)常規(guī)制備工藝制成丸劑。
實(shí)施例3取補(bǔ)骨脂2千克、蜣螂3千克，加入輔料，按藥劑學(xué)常規(guī)制備工藝制成膠囊劑，每粒0.36克，每日3次，每次4粒。
實(shí)施例4本發(fā)明膠囊劑的制備稱取補(bǔ)骨脂836g、蜣螂836g、歐巴代17.1g；補(bǔ)骨脂加70％的乙醇回流提取2次，第一次加7倍量，提取1小時，濾過；第二次加6倍量，提取1小時，濾過；合并濾液，回收乙醇，濃縮至相對密度1.05(60℃)；蜣螂加85％的乙醇回流提取3次，第一次加7倍量，提取1小時，濾過；第二次加6倍量，提取1小時，濾過；第三次再加6倍量，提取1小時，濾過；合并濾液，回收乙醇，濃縮至相對密度1.10(60℃)；冷藏24小時，除去表面脂肪，與補(bǔ)骨脂濃縮液合并，加入乙醇，使乙醇濃度達(dá)40％；按以下條件進(jìn)行噴霧干燥，藥液溫度50℃；進(jìn)液速度200-300ml/min；進(jìn)風(fēng)溫度135～145℃；出風(fēng)溫度80-90℃；收集干燥浸膏粉末，以95％的乙醇為潤濕劑制軟材，過40目篩，50～60℃熱風(fēng)干燥，再以40目篩整粒；以15％的歐巴代溶液按以下條件對顆粒進(jìn)行流化床包衣，進(jìn)液速度40-50ml/min；噴霧壓力0.3(MPa)；蒸汽壓力0.5(MPa)物料溫度55～50(℃)；進(jìn)風(fēng)溫度78～68℃)；出風(fēng)溫度40～35℃)；得干燥包衣顆粒，填充1號膠囊，即得膠囊1000粒(0.36g/粒)。口服，一次4粒，一日3次。
實(shí)施例5本發(fā)明片劑的制備取補(bǔ)骨脂1千克、蜣螂4千克；補(bǔ)骨脂加90％的乙醇回流提取3次，第一次提取時間1.0小時，乙醇用量按體積重量比為10倍藥材量，第二次提取時間1.0小時，乙醇用量按體積重量比為8倍藥材量，第三次提取時間2.0小時，乙醇用量按體積重量比為6倍藥材量，濾過；合并濾液，回收乙醇，濃縮至60℃時相對密度為1.05；蜣螂加95％的乙醇回流提取1次，提取時間3.0小時，乙醇用量按體積重量比為8倍藥材量，濾過；合并濾液，回收乙醇，濃縮至60℃時相對密度為1.10；冷藏24小時，除去表面脂肪，與補(bǔ)骨脂濃縮液合并；按以下條件進(jìn)行噴霧干燥，藥液溫度50℃；進(jìn)液速度200-300ml/min；進(jìn)風(fēng)溫度135～145℃；出風(fēng)溫度80-90℃，得本發(fā)明藥物組合物干燥浸膏粉；取干燥浸膏粉，按常規(guī)工藝制備成片劑。
實(shí)施例6本發(fā)明丸劑的制備取補(bǔ)骨脂2千克、蜣螂3千克；稱取補(bǔ)骨脂、蜣螂，補(bǔ)骨脂加80％的乙醇回流提取2次，每次提取時間2.0小時，每次乙醇用量按體積重量比為8倍藥材量，濾過；合并濾液，回收乙醇，濃縮至60℃時相對密度為1.10；蜣螂加90％的乙醇回流提取2次，每次提取時間2小時，按體積重量比第一次乙醇用量為10倍藥材量，第二次乙醇用量為8倍藥材量，濾過；合并濾液，回收乙醇，濃縮至60℃時相對密度為1.10；冷藏，除去表面脂肪，與補(bǔ)骨脂濃縮液合并；按以下條件進(jìn)行噴霧干燥，藥液溫度50℃；進(jìn)液速度200-300ml/min；進(jìn)風(fēng)溫度135～145℃；出風(fēng)溫度80-90℃，得本發(fā)明藥物組合物干燥浸膏粉；取干燥浸膏粉，按常規(guī)工藝制備成丸劑。
權(quán)利要求
1.一種藥物組合物，其特征在于該藥物組合物是由如下重量配比的原料藥制成補(bǔ)骨脂1～5重量份蜣螂1～5重量份。
2.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物是由如下重量配比的原料藥制成補(bǔ)骨脂1重量份 蜣螂4重量份。
3.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物由如下重量配比的原料藥制成補(bǔ)骨脂2重量份 蜣螂3重量份。
4.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物由如下重量配比的原料藥制成補(bǔ)骨脂1重量份 蜣螂1重量份。
5.如權(quán)利要求1、2、3或4所述的藥物組合物，其特征在取該藥物組合物，直接或加入常規(guī)輔料，按藥劑學(xué)常規(guī)工藝制備成臨床可接受的固體制劑片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑或滴丸。
6.如權(quán)利要求1、2、3或4所述的藥物組合物的制備方法，其特征在于該方法為稱取補(bǔ)骨脂、蜣螂；補(bǔ)骨脂加70％～90％的乙醇回流提取2～3次，每次提取時間1.0～2.0小時，每次乙醇用量按體積重量比為6～10倍藥材量，濾過；合并濾液，回收乙醇，濃縮至60℃時相對密度為1.05～1.10；蜣螂加85％～95％的乙醇回流提取1～3次，每次提取時間1.0～3.0小時，每次乙醇用量按體積重量比為6～10倍藥材量，濾過；合并濾液，回收乙醇，濃縮至60℃時相對密度為1.10～1.15；冷藏，除去表面脂肪，與補(bǔ)骨脂濃縮液合并；噴霧干燥，得本發(fā)明藥物組合物干燥浸膏粉；取干燥浸膏粉按常規(guī)工藝制備成臨床可接受的固體制劑片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑或滴丸。
7.如權(quán)利要求6所述的藥物組合物的制備方法，其特征在于該方法為稱取補(bǔ)骨脂、蜣螂；補(bǔ)骨脂加90％的乙醇回流提取3次，第一次提取時間1.0小時，乙醇用量按體積重量比為10倍藥材量，第二次提取時間1.0小時，乙醇用量按體積重量比為8倍藥材量，第三次提取時間2.0小時，乙醇用量按體積重量比為6倍藥材量，濾過；合并濾液，回收乙醇，濃縮至60℃時相對密度為1.05；蜣螂加95％的乙醇回流提取1次，提取時間3.0小時，乙醇用量按體積重量比為8倍藥材量，濾過；合并濾液，回收乙醇，濃縮至60℃時相對密度為1.10；冷藏，除去表面脂肪，與補(bǔ)骨脂濃縮液合并；噴霧干燥，得本發(fā)明藥物組合物干燥浸膏粉；取干燥浸膏粉按常規(guī)工藝制備成片劑。
8.如權(quán)利要求6所述的藥物組合物的制備方法，其特征在于該方法為稱取補(bǔ)骨脂、蜣螂，補(bǔ)骨脂加80％的乙醇回流提取2次，每次提取時間2.0小時，每次乙醇用量按體積重量比為8倍藥材量，濾過；合并濾液，回收乙醇，濃縮至60℃時相對密度為1.10；蜣螂加90％的乙醇回流提取2次，每次提取時間2小時，按體積重量比第一次乙醇用量為10倍藥材量，第二次乙醇用量為8倍藥材量，濾過；合并濾液，回收乙醇，濃縮至60℃時相對密度為1.15；冷藏，除去表面脂肪，與補(bǔ)骨脂濃縮液合并；噴霧干燥，得本發(fā)明藥物組合物干燥浸膏粉；取干燥浸膏粉按常規(guī)工藝制備成丸劑。
9.如權(quán)利要求6所述的藥物組合物的制備方法，其特征在于該方法為稱取補(bǔ)骨脂、蜣螂；補(bǔ)骨脂加70％的乙醇回流提取2次，第一次加7倍量，提取1小時，濾過；第二次加6倍量，提取1小時，濾過；合并濾液，回收乙醇，濃縮至60℃時相對密度為1.05；蜣螂加85％的乙醇回流提取3次，第一次加7倍量，提取1小時，濾過；第二次加6倍量，提取1小時，濾過；第三次再加6倍量，提取1小時，濾過，合并濾液，回收乙醇，濃縮至60℃時相對密度為1.10，冷藏，除去表面脂肪，與補(bǔ)骨脂濃縮液合并；進(jìn)行噴霧干燥，收集干燥浸膏粉末，以95％的乙醇為潤濕劑制軟材，過40目篩，50～60℃熱風(fēng)干燥，再以40目篩整粒；以15％的的歐巴代溶液對顆粒進(jìn)行流化床包衣，得干燥包衣顆粒，填充1號膠囊，即得。
10.如權(quán)利要求1、2、3或4所述的藥物組合物在制備治療前列腺增生癥藥物中的應(yīng)用。
11.如權(quán)利要求10所述的藥物組合物在制備治療前列腺增生癥腎虛血瘀證藥物中的應(yīng)用。
12.如權(quán)利要求1、2、3或4所述的藥物組合物在制備具有抑制前列腺上皮及間質(zhì)細(xì)胞的增殖作用的藥物中的應(yīng)用。
13.如權(quán)利要求12所述的抑制前列腺上皮及間質(zhì)細(xì)胞的增殖是指抑制前列腺組織中Ki-67的表達(dá)。
14.如權(quán)利要求1、2、3或4所述的藥物組合物在制備具有抑制前列腺組織中bcl-2蛋白的表達(dá)或誘導(dǎo)前列腺上皮及間質(zhì)細(xì)胞凋亡作用的藥物中的應(yīng)用。
15.如權(quán)利要求1、2、3或4所述的藥物組合物在制備具有抑制前列腺平滑肌細(xì)胞的增生作用的藥物中的應(yīng)用。
16.如權(quán)利要求1、2、3或4所述的藥物組合物在制備具有增加前列腺間質(zhì)組織中iNOS的表達(dá)作用的藥物中的應(yīng)用。
17.如權(quán)利要求1、2、3或4所述的藥物組合物在制備具有降低血漿粘度作用的藥物中的應(yīng)用。
18.如權(quán)利要求1、2、3或4所述的藥物組合物在制備具有減輕Adr對血管的收縮作用或拮抗Adr對A3受體的收縮作用的藥物中的應(yīng)用。
19.如權(quán)利要求1、2、3或4所述的藥物組合物在制備具有鎮(zhèn)痛作用的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種藥物組合物及其制備方法，本發(fā)明公開的藥物組合物以補(bǔ)骨脂、蜣螂為原料制成。補(bǔ)骨脂、蜣螂分別經(jīng)乙醇回流提取，濃縮，得濃縮液；蜣螂濃縮液冷藏除脂，與補(bǔ)骨脂濃縮液合并；噴霧干燥，制粒，以歐巴代溶液進(jìn)行流化床包衣，得干燥包衣顆粒，填充1號膠囊，即得本發(fā)明膠囊。本發(fā)明膠囊具有補(bǔ)腎溫陽、活血化淤、通利水道之功能，主治前列腺增生癥，腎虛血淤癥候。
文檔編號A61P13/08GK1785234SQ200410096969
公開日2006年6月14日 申請日期2004年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月7日
發(fā)明者張蜀武 申請人:陳永泰