專利名稱：Cd25結(jié)合分子在類固醇耐受型患者中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及CD25結(jié)合分子在類固醇耐受型患者中治療選自下列的疾病的用途，所述疾病選自自身免疫性肝炎、哮喘、濕疹、脈管炎、一過性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、白血病、腎小球腎炎、多發(fā)性硬化癥、潰瘍性結(jié)腸炎、結(jié)節(jié)病和局限性回腸炎。
潰瘍性結(jié)腸炎對大多數(shù)患有潰瘍性結(jié)腸炎的患者來說，類固醇是一種有效的治療方式。然而，30％-50％的潰瘍性結(jié)腸炎患者對類固醇治療無效，這些患者的內(nèi)科治療還不理想，大多數(shù)患者需要手術(shù)治療。在將類固醇用于嚴重的潰瘍性結(jié)腸炎治療之前，該病的死亡率約為50％(Truelove SC & Witts LJ，BMJ 1955；ii1041-8)。目前，臨床做法是對在5-7天類固醇治療后不見效的嚴重潰瘍性結(jié)腸炎患者立即實施外科手術(shù)(Jewell DP等，Gastroenterol Int 1991；4161-4)。盡管外科手術(shù)可以完全治愈，但是由于涉及到回腸造口術(shù)(至少是暫時性的)，因而患者常常不愿意接受外科手術(shù)。然而推遲手術(shù)對于那些內(nèi)科治療無效的患者是非常危險的，因為可能發(fā)生手術(shù)前穿孔，并由此導致增加死亡的機率(Ritchie JK，BMJ 1974；i264-268)。作為手術(shù)的替代療法，免疫抑制藥環(huán)孢菌素已經(jīng)應用于治療類固醇耐受型的潰瘍性結(jié)腸炎患者(Lichtiger S等，N Engl J Med 1994；3301841-5)。然而，長期結(jié)果是令人失望的，患者初始可以會有效，但仍需要在六個月內(nèi)進行手術(shù)治療，部分患者則由于免疫抑制而引起如卡式肺囊蟲肺炎之類的致命的機會感染以及腎功能衰竭和高血壓(Smith M B，N Engl J Med 1992；327497-8；Sandborn WJ，Inflamm Bowel Dis 1995；148-63)。硫唑嘌呤對慢性活動性類固醇耐受型或者類固醇依賴型的潰瘍性結(jié)腸炎是一種有效治療方法，然而它的起效周期長(3-4個月)，所以意味著它不適合那些急需治療的嚴重潰瘍性結(jié)腸炎患者(Ardixxone S等，JClin Gastroenterol 1997；25330-3)。因此，類固醇耐受型潰瘍性結(jié)腸炎的治療仍很困難，經(jīng)常需要導致傷口的外科手術(shù)。所以，需要另外的治療類固醇耐受型潰瘍性結(jié)腸炎的方法，并需要理解為什么一些潰瘍性結(jié)腸炎患者對類固醇治療無效的原因，對個別的患者來說，要預見其是否對類固醇治療產(chǎn)生反應是很困難的，因此需要手術(shù)治療或者另外的內(nèi)科治療方法。在嚴重的潰瘍性結(jié)腸炎中，疾病的最初嚴重程度與最后的結(jié)果(類固醇治療效果)關(guān)系不大(Lindgren SC等，Eur J Gastrenterol Hepatol，1998；10831-5)，因此，那些對類固醇治療無效的患者不一定是最嚴重的病人。
哮喘目前，治療哮喘的方法為給予類固醇類藥物，如糖腎上腺皮質(zhì)激素。盡管大部分患者通常反應良好，但是總會有一些患者對類固醇療法無效。這些患者被稱為患有“類固醇耐受型哮喘”，并在1968年首次被發(fā)現(xiàn)。隨后，類固醇耐受型哮喘的定義如下在以每天20mg的劑量給予強的松7天后，不能將每秒用力呼氣體積(FEV1；哮喘時肺功能降低的指標)，提高15％(Carmichael J等，BMJ 1981；2821419-22)。將類固醇耐受型哮喘患者和類固醇敏感型哮喘患者進行比較，發(fā)現(xiàn)他們的基礎肺功能試驗結(jié)果以及他們對支氣管擴張藥物的反應性并無顯著性差異，這表明類固醇耐受型哮喘無并無更嚴重的疾病。根據(jù)植物凝血素(PHA)刺激淋巴細胞增生受糖腎上腺皮質(zhì)激素抑制，可以測定類固醇耐受型哮喘患者外周血淋巴細胞的淋巴細胞對類固醇的敏感性(Poznansky MC等，Clin Sci 1984；67639-45)(Alvarez等，J Allergy Clin Immunol 1992；89714-21)(CorriganCJ等，Am Rev Respir Dis 1991；1441026-32)(Hackzu等，J Allergy ClinImmunol 1994；93510-9)(Spahn JD等，J Allergy Clin Immunol 1996；981073-9)。所有這些研究都表明，類固醇對類固醇耐受型哮喘患者的淋巴細胞抑制顯著地低于對類固醇敏感型哮喘患者的淋巴細胞的抑制，表明類固醇耐受型哮喘患者具有類固醇耐受型淋巴細胞。在進一步研究中包括八個類固醇耐受型哮喘患者，發(fā)現(xiàn)他們均具有耐受型淋巴細胞，用氨甲蝶呤對其進行治療(Vrugt B等，Eur Respir J 2000；15478-85)。八周后，發(fā)現(xiàn)支氣管的粘膜炎癥減少，淋巴細胞對類固醇敏感性增加。氨甲蝶呤在治療類固醇敏感型哮喘患者支氣管粘膜中的良好療效是由于其提高了類固醇的敏感性所致這一觀點尚有爭議。這是藥物作為“類固醇增強劑”、增加淋巴細胞對類固醇的敏感性并且有臨床療效的一個例子?！半y治”型哮喘中大約25％的患者(指一個三發(fā)性中心(a tertiary referral centre)被發(fā)現(xiàn)有類固醇耐受型淋巴細胞(Chan MTS等，J Allergy clin Immunol 1998；101594-601)。
自身免疫性肝炎自身免疫性肝炎是以進行性肝細胞炎癥為特征的一種慢性肝病形式，用皮質(zhì)類固醇治療時通常有效。然而，仍有10％的自身免疫性肝炎患者對皮質(zhì)類固醇治療無效，進而發(fā)展成進行性肝病和肝硬化。這些類固醇耐受型患者疾病的治療是困難的，可能需要移植。環(huán)孢菌素已經(jīng)被用作治療類固醇耐受型自身免疫性肝炎的藥物(Fernandes NF等，Am J Gastroenterol1999；94241-8)。在對5個患者進行的試驗中，4個患者治療成功。不幸的是，這唯一一例對環(huán)孢菌素治療無效的患者發(fā)展為進行性肝衰竭，經(jīng)過常位肝移植，最后死于播散性巨細胞病毒感染。據(jù)估計類固醇耐受型自身免疫性肝炎患者有類固醇耐受型淋巴細胞。
濕疹濕疹是由例如接觸性過敏原和刺激物、感染因子和特異性變態(tài)反應等多種外部環(huán)境或者內(nèi)部因素所引起或?qū)е碌木哂刑卣餍螒B(tài)的皮膚炎癥。大部分濕疹患者癥狀較輕，只需要間歇局部治療。然而，部分患者則表現(xiàn)為更嚴重的病變，因此，需要系統(tǒng)性的類固醇治療(Hoare C等，HealthTechnol Assess 2000；41-191)(Heddle RJ等，BMJ(Clin Res Ed)1984；289651-4)。對類固醇無效的患者需要用免疫抑制藥物如環(huán)孢菌素作為替代療法(Granlund H等，Acta derm.Venereol.1996；76371-6)。據(jù)估計，對類固醇治療無效是由于類固醇耐受型患者有類固醇耐受型淋巴細胞所致。
脈管炎脈管炎是一組以動脈炎癥為特征的病變。這些病變中的一部分也引起腎小球腎炎(包括韋格納肉芽腫病、古德帕斯丘綜合征和結(jié)節(jié)性多動脈炎節(jié))。類固醇仍是這些病變的一線治療藥物(Bosch X等，Lupus 1999；8258-62)(Guillevin L nephrol.Dial.Transplant 199；142077-9)(Reinhold-Keller E等，Arthritis Rheum.2000；431021-32)。免疫抑制劑療法通常與類固醇療法一起使用，如果這種聯(lián)合療法無效，將是致命的。據(jù)認為，大量治療無效的患者有類固醇耐受型淋巴細胞。
一過性關(guān)節(jié)炎一過性關(guān)節(jié)炎也是血管炎的一種形式。其并發(fā)癥為失明，是由動脈炎癥干擾眼睛的血液供應引起的，大約15％的患者對一線藥物類固醇的治療無效(Chevalet P等，J Rheumatol 2000；271484-91)。這些患者通常給予長療程無效的類固醇治療，替代療法如氨甲蝶呤已經(jīng)被用于治療這類類固醇耐受型疾病(Krall PL等，Cleve Clin J Med 1989；56253-7)。據(jù)估計，對類固醇治療無效是由于類固醇耐受型患者有類固醇耐受型淋巴細胞所致。
結(jié)節(jié)病結(jié)節(jié)病是一種不明原因的系統(tǒng)性肉芽腫紊亂。結(jié)節(jié)病是由于對未知抗原產(chǎn)生T細胞介導的過度免疫反應而引起。類固醇仍是一線治療藥物(Barnard J等，Curr Opin Rheumatol 2001；1384-91)。由于類固醇的不耐受性或者意圖減少類固醇的劑量和副作用，常常采用類固醇的替代物。
系統(tǒng)性紅斑狼瘡系統(tǒng)性紅斑狼瘡是包括T淋巴細胞異常以及產(chǎn)生自身抗體的B細胞反應性過度的一種自身免疫系統(tǒng)紊亂。若不進行治療，該病可導致末期腎病和死亡。
糖腎上腺皮質(zhì)激素是治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的首選藥物。然而，一些患者對類固醇治療無效。
淋巴細胞類固醇敏感性與臨床類固醇治療的有效性之間的相關(guān)性已體外在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者中測定(Seki M等，Arthritis Rheum 1998；41823-30)。研究27名了口服強的松(每天50-60mg，持續(xù)一個月)的日本婦女。根據(jù)類固醇的臨床療效，將19名患者劃為類固醇敏感型，8名患者劃為類固醇耐受型。通過測定體外類固醇誘導的外周血淋巴細胞細胞程序死亡(細胞死亡)測定淋巴細胞對類固醇敏感性。系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的淋巴細胞在高濃度的強的松龍中，類固醇耐受型組相對于類固醇敏感型組有顯著低的細胞死亡百分比(分別為44.8％和68.8％，p＜0.05)。因此，盡管檢測淋巴細胞對類固醇敏感性的方法不同于檢測糖腎上腺皮質(zhì)激素抑制植物凝血素刺激淋巴細胞增生的方法，然而仍發(fā)現(xiàn)對類固醇治療無效的患者有類固醇耐受型淋巴細胞。
白血病白血病是以白細胞前體樣增生和不分化為特征的惡性白細胞紊亂。盡管白血病不是炎性病變，但是，糖腎上腺皮質(zhì)激素還是被包括在治療這種病變的化學治療方案中。糖腎上腺皮質(zhì)激素誘導原淋巴細胞凋亡，這可以用作檢測急性原淋巴細胞白血病(ALL)對類固醇敏感性的指標。體外高的細胞凋亡率與好的臨床療效有關(guān)。相反，新診斷的原淋巴細胞白血病病例中大約30％發(fā)生類固醇耐受性，類固醇耐受性是一個嚴重的臨床問題(Kaspers GJL，等，Leuk Lymphoma 1994；13187-201)。在體外進行的兩項研究中，不僅比較了淋巴細胞對類固醇(地塞米松和強的松龍)敏感性，而且也比較了對左旋—門冬酰胺酶和長春新堿的敏感性(KaspersGJL，等，Blood 1997；902723-9)(Hongo T等，Blood 1997；89295965)。以淋巴細胞對這些藥物的敏感性作為指標，將患者分為敏感型(對所有藥物敏感)，中等型(對兩或三種藥物敏感)和耐受型(無一藥物敏感或?qū)σ环N藥物敏感)。在敏感型患者中，三年不患病時的存活率是最高的(85-100％)，而耐受型患者最低(43-55％)。因此，在急性原淋巴細胞白血病患者中，原淋巴細胞的體外敏感性和體內(nèi)疾病的敏感性不僅與對類固醇的敏感性有關(guān)而且與其它化學治療劑也有關(guān)。
腎小球腎炎腎小球腎炎以腎臟炎癥為特征，通常是自身免疫性疾病。類固醇是重要的治療藥物(Austin HA，等N Engl J Med 1986；314614-9)，類固醇治療無效，該病變會導致腎衰竭。對用類固醇治療無效的類固醇耐受型腎病的患者現(xiàn)已嘗試使用免疫抑制類藥物(如在潰瘍性結(jié)腸炎部分所述)(McCauley J等，Nephrol Dial Transplant 1993；81286-90)。一項在16名腎小球腎炎患者中進行的研究表明淋巴細胞對類固醇敏感性存在差異(Briggs WA，等，J Clin Pharmacol 1996；36707-14)。盡管在對淋巴細胞對類固醇敏感性的差異與對類固醇治療的療效不同的解釋上存在爭議，然而在這項研究中卻沒有將臨床療效與淋巴細胞對類固醇敏感性加以對照。局灶性節(jié)段性腎小球硬化癥(FSGS)是腎小球腎炎的一種形式，它也可以用類固醇治療，盡管對部分患者沒有療效(Ingulli E，等，J Am SocNephrol 1995；51820-5)。在這種疾病，將淋巴細胞對類固醇敏感性與臨床療效相對照，顯示出在用類固醇治療時，腎臟功能得以改善。淋巴細胞最敏感型的患者用類固醇治療的療效最好，而那些有類固醇耐受型淋巴細胞的患者用類固醇療效最差。
多發(fā)性硬化癥多發(fā)性硬化癥是中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘的炎癥病變，與髓磷脂蛋白發(fā)生相互作用的T淋巴細胞在致病中起著重要的作用?？梢圆捎锰悄I上腺皮質(zhì)激素治療多發(fā)性硬化癥(Brusaferri F，等，J Neurol.2000；247435-42)。類固醇治療對加速多發(fā)性硬化癥患者的短期內(nèi)康復有效，也可以有效減少復發(fā)的可能性。然而，在不同患者中，臨床療效明顯不同。在多發(fā)性硬化癥患者中，也測定了淋巴細胞對類固醇敏感性(Wei T等，Acta NeurologicaScandinavica 1997；9628-33)，發(fā)現(xiàn)淋巴細胞敏感性差距很大。還沒有研究將類固醇治療多發(fā)性硬化癥的臨床療效與淋巴細胞對類固醇敏感性加以對照，但是對體外淋巴細胞對類固醇敏感性的差異可以部分解釋為什么類固醇療效存在差異有爭議。
淋巴細胞對類固醇的敏感性如上所述，淋巴細胞在體外能夠被促有絲分裂劑植物凝血素刺激而增生(Lindahl Kiessling K，Peterson RD.Exp Cell Res 1969；5585-7)。向培養(yǎng)基中加入類固醇可以抑制淋巴細胞增生(Walker KB等，Transplant1985；171676-8)。在部分情況下，淋巴細胞是類固醇敏感型的，加入微量類固醇產(chǎn)生明顯的增生抑制作用，而在部分情況下，淋巴細胞是類固醇耐受型的，即使加入大量的類固醇也只產(chǎn)生微小的增生抑制作用。發(fā)明人以前已經(jīng)研究了一組嚴重潰瘍性結(jié)腸炎患者的淋巴細胞類固醇敏感性與類固醇治療的臨床療效之間的相關(guān)性(Hearing SD等，Gut 1999；45382-8)。所有患者均靜脈內(nèi)給予標準劑量的類固醇，根據(jù)地塞米松抑制植物凝血素刺激的外周血淋巴細胞增生來測定患者淋巴細胞對類固醇的敏感性。證明在臨床療效和淋巴細胞類固醇敏感性之間存在顯著相關(guān)性。所有那些具有類固醇敏感型淋巴細胞的患者均對類固醇治療效果好，而所有那些具有類固醇耐受型淋巴細胞患者則對類固醇治療效果差。因此，在潰瘍性結(jié)腸炎中，淋巴細胞對類固醇的敏感性和類固醇臨床療效之間具有相關(guān)性，具有類固醇耐受型淋巴細胞預示著臨床療效差。
白細胞介素是在免疫反應中由激活的巨噬細胞和淋巴細胞產(chǎn)生的一組細胞因子。它們作用于淋巴細胞和其它的白細胞，刺激它們的增生和分化。白細胞介素2(IL-2)是白細胞介素的一種，它是由激活的T細胞最先產(chǎn)生的細胞因子之一，它以自分泌的方式刺激產(chǎn)生它的T細胞增生和分化。在潰瘍性結(jié)腸炎中，激活的T淋巴細胞產(chǎn)生的白細胞介素2在使粘膜發(fā)炎的過程中起了重要的作用，其是通過激活其它炎性細胞產(chǎn)生更多的細胞因子，從而產(chǎn)生更多的炎性細胞的募集和激活所致(Kirman I等，J.Dig DisSci 1995；40291-5)。假設一名患者對類固醇治療有效，那么類固醇的重要作用是抑制白細胞介素2的產(chǎn)生和阻止淋巴細胞增生及相關(guān)炎癥的發(fā)生(類固醇有多種作用，抑制白細胞介素2只是其一)。然而，如果患者是類固醇耐受型，那么類固醇則既不能抑制白細胞介素2的產(chǎn)生，也不能抑制炎癥過程。
鑒于大量患有自身免疫性肝炎、哮喘、濕疹、脈管炎、一過性動脈炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、白血病、腎小球腎炎、多發(fā)性硬化癥、潰瘍性結(jié)腸炎、結(jié)節(jié)病、局限性回腸炎的患者用類固醇治療無效，所以需要一種有效的治療方法替代緊急的、侵入性的手術(shù)治療方法。
更具體而言，在第一個方面，本發(fā)明提供CD25結(jié)合分子或其等價物在治療自身免疫性肝炎、哮喘、濕疹、脈管炎、一過性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、白血病、腎小球腎炎、多發(fā)性硬化癥、潰瘍性結(jié)腸炎、結(jié)節(jié)病和局限性回腸炎中的用途，CD25結(jié)合分子包括至少一個抗原結(jié)合位點，該結(jié)合位點包含至少一個結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域依次包括高變區(qū)CDR1、CDR2和CDR3；所述CDR1的氨基酸序列為Arg-Tyr-Trp-Met-His，所述CDR2的氨基酸序列為Ala-Ile-Tyr-Pro-Gly-Asn-Ser-Asp-Thr-Ser-Tyr-Asn-Gln-Lys-Phe-Glu-Gly，所述CDR3的氨基酸序列為Asp-Tyr-Gly-Tyr-Tyr-Phe-Asp-Phe。如下面實施例1和實施例2的研究中顯示，本發(fā)明的CD25結(jié)合分子可以調(diào)節(jié)淋巴細胞對類固醇的敏感性，以使類固醇耐受型患者轉(zhuǎn)變成類固醇敏感型患者。因此，本發(fā)明的CD25結(jié)合分子可以用于治療類固醇耐受型患者的自身免疫性肝炎、哮喘、濕疹、脈管炎、一過性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、白血病、腎小球腎炎、多發(fā)性硬化癥、潰瘍性結(jié)腸炎、結(jié)節(jié)病和局限性回腸炎。
而且，本發(fā)明的CD25結(jié)合分子也可以用于改善類固醇敏感性患者對類固醇治療的療效。盡管預期類固醇敏感型患者對類固醇治療有效，但是無論如何，用本發(fā)明的CD25結(jié)合分子進行治療可以使此類患者見效更快，或者可以選用更低劑量的類固醇，因而可以顯著降低類固醇治療的副作用。因此，根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，還提供預防、緩解/預防復發(fā)及治療類固醇敏感型患者下列疾病的方法慢性活動性肝炎、哮喘、濕疹、脈管炎、一過性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、白血病、腎小球腎炎、多發(fā)性硬化癥、潰瘍性結(jié)腸炎、結(jié)節(jié)病、局限性回腸炎，所述方法包括給予所述患者有效量的本發(fā)明的CD25結(jié)合分子，并且在必要時給予類固醇。
“CD25結(jié)合分子”是指任何能夠結(jié)合CD25抗原本身或與其它分子結(jié)合的CD25抗原從而形成高度親合性白細胞介素2受體的分子。
優(yōu)選采用包括至少一個抗原結(jié)合位點的CD25結(jié)合分子或其直接的等價物，該結(jié)合位點包括a)依次包含CDR1、CDR2和CDR3超變區(qū)的第一結(jié)構(gòu)域；所述CDR1的氨基酸序列為Arg-Tyr-Trp-Met-His，所述CDR2的氨基酸序列為Ala-Ile-Tyr-Pro-Gly-Asn-Ser-Asp-Thr-Ser-Tyr-Asn-Gln-Lys-Phe-Glu-Gly，所述CDR3的氨基酸序列為Asp-Tyr-Gly-Tyr-Tyr-Phe-Asp-Pheb)依次包含CDR1’、CDR2’和CDR3’超變區(qū)的第二結(jié)構(gòu)域，所述CDR1的氨基酸序列為Ser-Ala-Ser-Ser-Ser-Ile-Ser-Tyr-Met-Gln，所述CDR2’的氨基酸序列為Asp-Thr-Ser-Lys-Leu-Ala-Ser，所述CDR3’的氨基酸序列為His-Gln-Arg-Ser-Ser-Tyr-Thr；除特別指明外，在此描述的任何多肽鏈均指以N-末端開始、以C-末端結(jié)束的氨基酸序列。
當抗原結(jié)合位點包含第一和第二結(jié)構(gòu)域時，這些結(jié)構(gòu)域可以位于同一個多肽分子，或者最好每一個結(jié)構(gòu)域位于不同的肽鏈上，第一結(jié)構(gòu)域作為免疫球蛋白重鏈或其片段的一部分，第二結(jié)構(gòu)域作為免疫球蛋白輕鏈或片段的一部分。
因此，本發(fā)明也提供包括至少一個抗原結(jié)合位點的CD25結(jié)合分子的用途，所述結(jié)合位點包括第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域，第一結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與EP 449,769B1中示出的Seq.Id.No.1相同或基本相同，由1位氨基酸開始并以117位氨基酸結(jié)束或者第一結(jié)構(gòu)域是如上文所述的第一結(jié)構(gòu)域，第二結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與EP 449,769B1中示出的Seq.Id.No.2相同或基本相同，由1位氨基酸開始并以104位氨基酸結(jié)束，EP 449,769B1的內(nèi)容在此并入本文中作參考。
根據(jù)本發(fā)明，更優(yōu)選的CD25結(jié)合分子選自于嵌合的抗CD25抗體和其直接等價物，該抗體至少包括a)一條免疫球蛋白重鏈或其片段，包括(i)依次包括CDR1、CDR2和CDR3超變區(qū)的可變結(jié)構(gòu)域，和(ii)人重鏈恒定部分或其片段；所述CDR1的氨基酸序列為Arg-Tyr-Trp-Met-His，所述CDR2的氨基酸序列為Ala-Ile-Tyr-Pro-Gly-Asn-Ser-Asp-Thr-Ser-Tyr-Asn-Gln-Lys-Phe-Glu-Gly，所述CDR3的氨基酸序列為Asp-Tyr-Gly-Tyr-Tyr-Phe-Asp-Phe，和b)一條免疫球蛋白輕鏈或其片段，包括(i)依次包括CDR1’、CDR2’和CDR3’超變區(qū)的可變結(jié)構(gòu)域，和(ii)人輕鏈的恒定部分或其片段；所述CDR1’的氨基酸序列為Ser-Ala-Ser-Ser-Ser-Ile-Ser-Tyr-Met-Gln，所述CDR2’的氨基酸序列為Asp-Thr-Ser-Lys-Leu-Ala-Ser，所述CDR3’的氨基酸序列為His-Gln-Arg-Ser-Ser-Tyr-Thr。
根據(jù)本發(fā)明，CD25結(jié)合分子也可選自包含一個抗原結(jié)合位點的單鏈結(jié)合分子和其直接等價物，所述結(jié)合位點包括a)依次包含CDR1、CDR2和CDR3超變區(qū)列的第一結(jié)構(gòu)域，所述超變區(qū)的氨基酸序列與EP 449,769B1中示出的Seq.Id.No.1相同，EP449，769B1的內(nèi)容在此并入本文中作參考，b)依次包含CDR1’、CDR2’和CDR3’超變區(qū)的第二結(jié)構(gòu)域，超變區(qū)的氨基酸序列與EP 449,769B1中示出的Seq.Id.No.2相同，EP449,769B1的內(nèi)容在此并入本文中作參考，和c)與第一結(jié)構(gòu)域的N-末端和第二結(jié)構(gòu)域的C-末端連接的或者與第一結(jié)構(gòu)域的C-末端和第二結(jié)構(gòu)域的N-末端連接的肽接頭。
根據(jù)本發(fā)明，CD25結(jié)合分子也可選自包括抗原結(jié)合位點的單鏈結(jié)合分子，所述抗原結(jié)合位點含有人源化抗體。如達珠單抗，在EP 451,216B1中公開了該抗體及其制備方法，EP 451,216B1的內(nèi)容在此并入本文中作參考。
眾所周知，氨基酸序列的微小改變?nèi)缛毕?、添加或者替換一個、多個或幾個氨基酸均可以導致形成原始蛋白質(zhì)的等位形式，這些形式與原始蛋白質(zhì)具有相同或基本相同的特征，例如抗原結(jié)合性。因此，術(shù)語“直接的等價物”是指任何單一結(jié)構(gòu)域的CD25結(jié)合分子(分子X)(i)其中所述CDR1、CDR2和CDR3超變區(qū)作為一個整體與EP449,769B1中示出的Seq.Id.No.1的超變區(qū)或者EP451,216B1中圖3和4中示出的超變區(qū)至少有80％是同源的，優(yōu)選至少有90％是同源的，更優(yōu)選至少有95％是同源的，這些專利文獻的內(nèi)容在此并入本文中作參考；和(ii)與構(gòu)架區(qū)與分子X相同、但超變區(qū)CDR1、CDR2和CDR3與E P449,769B1中示出的Seq.Id.No.1或EP451,216B1中的圖3和4示出的相同的對照分子相比，該結(jié)合分子對白細胞介素2(IL-2)與其受體結(jié)合的抑制程度基本相同，這些專利文獻的內(nèi)容在此并入本文中作參考；或者指每一個結(jié)合位點具有至少兩個結(jié)構(gòu)域的任何CD25結(jié)合分子(分子X’)(i)其中所述CDR1、CDR2、CDR3、CDR1’、CDR2’和CDR3’超變區(qū)作為一個整體與EP449,769B1中示出的Seq.Id.No.1和2的超變區(qū)或者EP451,216B1中圖3和4中示出的超變區(qū)至少有80％是同源的，優(yōu)選至少有是90％同源的，這些專利文獻的內(nèi)容在此并入本文中作參考；(ii)與構(gòu)架區(qū)與分子X’相同、但超變區(qū)CDR1、CDR2和CDR3與EP449,769B1中示出的Seq.Id.No.1和2或EP451,216B1中的圖3和4示出的相同的對照分子相比，該結(jié)合分子對IL-2與其受體結(jié)合的抑制程度基本相同，這些專利文獻的內(nèi)容在此并入本文中作參考。
最后一項標準在不同試驗中可以很便利檢驗，如EP449,769B1或者EP451,216B1中所述，這些專利文獻的內(nèi)容在此并入本文中作參考。根據(jù)本發(fā)明，更優(yōu)選的CD25結(jié)合分子是嵌合的CD25的抗體，特別是包括至少一個下面的鏈的嵌合的CD25抗體a)包括可變結(jié)構(gòu)域和人重鏈恒定部分的重鏈，所述可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與EP449,769B1中Seq.Id.No.1所示序列相同或基本相同，該專利文獻的內(nèi)容在此并入本文中作參考，由1位氨基酸起始，由117位氨基酸終止；和b)包括可變結(jié)構(gòu)域和人輕鏈恒定部分的輕鏈，所述可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與EP449,769B1中Seq.Id.No.2所示序列相同或基本相同，該專利文獻的內(nèi)容在此并入本文中作參考，起始于1位的谷氨酸，終止于104位的谷氨酸。
人的重鏈的恒定部分可以是γ1、γ2、γ3、γ4、μ、α1、α2、δ或者ε型，優(yōu)選為γ型，更優(yōu)選為γ1型，而人的輕鏈的恒定部分可以是κ或λ型(包括λ1、λ2和λ3亞型)，優(yōu)選為κ型。所有這些恒定部分的氨基酸序列均由Kabat等在Sequences of Proteins of Immunological Interest，US Department of Health and Human Services，Public Health Service，NIH給出。
根據(jù)本發(fā)明，最優(yōu)選的CD25結(jié)合分子是嵌合抗體巴利昔單抗(basiliximab)，以SIMULECT的商品名得自Novartis AG和人源化抗體達珠單抗，以ZENAPX的商品名得自Roche。
根據(jù)本發(fā)明，適合的CD25結(jié)合分子可以參照EP449,769B1和EP451,216B1公開的生產(chǎn)方法生產(chǎn)，這些專利文獻的內(nèi)容在此并入本文中作參考。
如EP-B-449,769B1和EP451,216B1中所述，在如淋巴細胞類固醇敏感性(Lymphocyte Steroid Sensitivity)測定中可觀察到CD25結(jié)合分子活性的基礎上，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CD25結(jié)合分子適用于預防和治療類固醇敏感型患者或耐受型患者的自身免疫性肝炎、哮喘、濕疹、脈管炎、一過性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、白血病、腎小球腎炎、多發(fā)性硬化癥、潰瘍性結(jié)腸炎、結(jié)節(jié)病、局限性回腸炎。
因此，本發(fā)明也提供(i)預防和治療類固醇敏感型患者或類固醇耐受型患者的自身免疫性肝炎、哮喘、濕疹、脈管炎、一過性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、白血病、腎小球腎炎、多發(fā)性硬化癥、潰瘍性結(jié)腸炎、結(jié)節(jié)病或局限性回腸炎的方法，該方法包括給予所述患者有效量的上述的CD25結(jié)合分子。
(ii)預防和治療類固醇敏感型患者或類固醇耐受型患者的自身免疫性肝炎、哮喘、濕疹、脈管炎、一過性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、白血病、腎小球腎炎、多發(fā)性硬化癥、潰瘍性結(jié)腸炎、結(jié)節(jié)病或局限性回腸炎的方法，該方法包括給予(例如同時或依次)所述患者有效量的下列物質(zhì)a)如上所述的CD25結(jié)合分子，和b)有效預防和治療自身免疫性肝炎、哮喘、濕疹、脈管炎、一過性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、白血病、腎小球腎炎、多發(fā)性硬化癥、潰瘍性結(jié)腸炎、結(jié)節(jié)病或局限性回腸炎的另外的藥物。
(iii)用于(i)及(ii)所述方法中的藥物組合物，該組合物包括如上所述的CD25結(jié)合分子和藥學上可接受的載體或稀釋劑。
(iv)用于生產(chǎn)(i)或(ii)所述方法中使用的藥物的前述的CD25結(jié)合分子。
(v)用于(i)或(ii)所述方法中的治療組合，如藥盒或藥用包裝，所述組合包括上面所述的包括CD25結(jié)合分子的藥物組合物，還包括至少一種包括有效量的另外一種治療類固醇敏感型患者或耐受型患者下述疾病的藥物的藥物組合物自身免疫性肝炎、哮喘、濕疹、脈管炎、一過性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、白血病、腎小球腎炎、多發(fā)性硬化癥、潰瘍性結(jié)腸炎、結(jié)節(jié)病或局限性回腸炎。
根據(jù)本發(fā)明使用時，適當?shù)膭┝慨斎粦鶕?jù)以下因素進行變化，如所用的具體的CD25結(jié)合分子、患者自身情況、給藥方式、病情的嚴重程度和所需的效果。從約0.1mg到約100mg的藥物劑量通常都可獲得滿意的療效?？梢詥蝿┝拷o藥，也可以在一段時間內(nèi)分多個劑量給藥，只要在臨床效果明顯或能夠預防疾病復發(fā)即可，例如約5mg到約100mg的劑量，可以在一天至五周內(nèi)給藥，如每3到6天給藥一次直到疾病得到控制或者改善。優(yōu)選的給藥方案為，在第0天給予CD25結(jié)合分子20mg(如巴利昔單抗)，第4天再給予20mg。最好將CD25結(jié)合分子腸胃外給藥，如靜脈給藥，譬如通過肘前或其它外周靜脈血管給藥。另外的一個示例性給藥方案為，每28天靜脈給藥40mg，直到疾病得到控制或改善。
靜脈輸注射液可以如下制備將凍干的抗體混合并分散于100ml無菌的緩沖鹽溶液中，其內(nèi)含有重量為4.5％人白蛋白?？梢詫⒃擕}分散液通過靜脈大劑量(bolus)注射或在15分鐘內(nèi)靜脈輸注給患者。
到目前為止的研究表明，在所述的劑量范圍內(nèi)給予CD25結(jié)合分子沒有不能接受的副作用。具體而言，優(yōu)選的藥物巴利昔單抗或達珠單抗是安全的，已被美國聯(lián)邦藥品管理局(FDA)批準，可商業(yè)應用。
根據(jù)EP449,769B1或EP451,216B1中所述的方法，可以制備本發(fā)明的藥物組合物，這些專利文獻的內(nèi)容在此并入本文中作參考。
CD25結(jié)合分子可以作為單獨活性成分或與其它免疫調(diào)節(jié)或抗炎藥物一同使用。例如，根據(jù)本發(fā)明，CD25結(jié)合分子可以與各種治療如上所述的各種疾病的有效藥物組合物聯(lián)合用藥，例如環(huán)孢菌素、雷帕霉素或者子囊霉素或者它們的抑制類似物，如環(huán)孢菌素A、環(huán)孢菌素G、FK-506(普樂可復)、西羅莫司、everolimus；糖皮質(zhì)類固醇類，如強的松；環(huán)磷酰胺；硫唑嘌呤；氨甲蝶呤；金鹽；柳氮磺胺吡啶，抗瘧藥物，布列奎鈉；來氟米特；咪唑立賓；霉酚酸；霉酚酸酯mofetil；15-脫氧精瓜素(15-deoxyspergualine)；其他免疫抑制性單克隆抗體，如抗白細胞受體的單克隆抗體如MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD28、B7、CD40、CD45或CD58或它們的配體；或者其他免疫調(diào)節(jié)化合物如CTLA41g。
如果將CD25結(jié)合分子與另外的藥物聯(lián)合用藥，兩種藥物可以單獨包裝、然后置于同一容器內(nèi)，并在容器內(nèi)放入關(guān)于混合或同時給藥的說明書。藥盒的示例包括如多腔室注射器或包括獨立的劑型的雙包裝。
下面的實施例用于說明本發(fā)明。
實施例1本實驗的研究對象為4男和4女。研究對象的平均年齡是52歲(從34歲到70歲)，其中兩位研究對象是健康志愿者，另外六位研究對象是前期診斷為潰瘍性結(jié)腸炎的患者。其中5位患者因內(nèi)科治療無效先前已要求手術(shù)治療，現(xiàn)沒有服用任何抗炎或者免疫抑制藥。第六位研究對象是UC(潰瘍性結(jié)腸炎)靜止期患者，他已經(jīng)服用了5-氨基水楊酸，雖然不是在取樣當天，因此，取樣時具有抑制白細胞介素2作用的5-氨基水楊酸可能已經(jīng)代謝了。(用于體外的巴利昔單抗的商用名為SIMLECT，由Novartis提供)測定淋巴細胞對類固醇敏感性外周血淋巴細胞對糖腎上腺皮質(zhì)激素的敏感性可以在功能試驗中測定，也就是植物凝血素(PHA)刺激、地塞米松抑制的體外增生試驗(Hearing SD等，Gut 1999；45382-8；Hearing SD等，J Clin Endocrinol Metab 1999；844149-54)。外周血樣在9:00采集，用浮力離心法分離外周血單核細胞(PBMC)。浮力離心包括通過Ficol梯度離心從血樣中分離淋巴細胞。Ficol使紅細胞濾過，而阻止淋巴細胞通過。從ficol/血漿界面處收集外周血單核細胞(淋巴細胞和巨紅細胞)。在10-6-10-10mol/l即10-6、10-7、10-8、10-9和10-10mol/l之間以連續(xù)10倍數(shù)的稀釋液稀釋植物凝血素和地塞米松，前者刺激外周血單核細胞，后者抑制外周血單核細胞。通過測定氚化的胸腺嘧啶脫氧核苷的吸收量測定細胞增生，也就是將放射性同位素標記的胸腺嘧啶脫氧核苷(3H-胸腺嘧啶脫氧核苷)加入淋巴細胞培養(yǎng)液中，經(jīng)過2天的溫育，其摻入增生淋巴細胞的DNA中。6小時后，將細胞移出培養(yǎng)箱，用細胞采集器收集在過濾墊上。然后將這些細胞從孔中洗出。摻入胸腺嘧啶脫氧核苷的淋巴細胞DNA殘留在濾紙上。當測定放射性時，存有大量活性增生的淋巴細胞(并因此有大量的胸腺嘧啶脫氧核苷摻入DNA中)的孔中將有很高的放射性。因此，用放射性水平(以每分鐘放射數(shù)CPM表示)作為淋巴細胞增生的指標。結(jié)果以三份培養(yǎng)物的平均每分鐘計數(shù)(CPM)計算。將每一個濃度的地塞米松的胸腺嘧啶脫氧核苷摻入數(shù)與無地塞米松抑制的植物凝血素刺激的T淋巴細胞的摻入數(shù)加以比較，并以未抑制的陽性對照的百分數(shù)表示。也研究了不同濃度的巴利昔單抗對淋巴細胞增生的影響。另外，在含有不同濃度的地塞米松的每一個細胞培養(yǎng)液中均加入相同濃度的巴利昔單抗，測定其抑制細胞增生的效果。
SIMULECT對淋巴細胞增生的作用0.2mg/l的巴利昔單抗血清濃度占據(jù)了多于90％的白細胞介素2受體。為了測定巴利昔單抗的體外抗增生效果，將濃度范圍為0.01-10mg/l的不同濃度的巴利昔單抗與淋巴細胞在無類固醇存在下一起培養(yǎng)。這些試驗證實，巴利昔單抗在體外產(chǎn)生作用的濃度為0.1-0.3mg/l。對這些對象進行的另外的研究中，采用1mg/l的濃度。共有總之，在每一個試驗中都研究了總數(shù)為8名的相同對象。在無類固醇存在的情況下，濃度為1mg/l的巴利昔單抗作用于植物凝血素誘導細胞增生的結(jié)果顯示于表1中表1
因此在無類固醇存在的情況下，添加巴利昔單抗產(chǎn)生了一個平均為37.8％的增生抑制。然而，這個抑制水平仍與該項研究中潰瘍性結(jié)腸炎患者的臨床療效差有關(guān)(＜60％)。
SIMULECT對類固醇敏感性的作用在地塞米松濃度遞增(10-10-10-6mol/l)的培養(yǎng)液中將植物凝血素刺激的淋巴細胞進行培養(yǎng)，將對8名研究對象分為兩組，加入巴利昔單抗(1mg/l)組和不加巴利昔單抗組。在先前發(fā)明者所做的潰瘍性結(jié)腸炎的研究中，最大抑制(Imax)＜60％時類固醇的療效較差(臨床類固醇耐受性)。Imax的確切值是無法測定的，因為它是地塞米松無限高水平時所產(chǎn)生的抑制作用。因此，將在所用地塞米松最大濃度(10-6mol/l)時測定的增生抑制的百分數(shù)作為Imax值。實際應用中，由藥效曲線估算到的最大抑制漸進值和Imax很好地相符(Hearing SD等(1999)Clin.Endoctrinol.Metab 844149-54)。以糖皮質(zhì)激素的活性來說，10-7mol/l的地塞米松濃度大約相當于標準藥物劑量下靜脈注射在血清中所達到的氫化可的松的濃度。因此，為了比較巴利昔單抗在體內(nèi)的潛在效果，人們對該濃度下的地塞米松對巴利昔單抗的類固醇敏感作用也非常感興趣。表2顯示了每一個研究對象在淋巴細胞增生實驗中的結(jié)果，該結(jié)果表明巴利昔單抗在淋巴細胞類固醇敏感性中的作用。研究對象以類固醇敏感性遞減的順序排列(左邊為最敏感)。
表2
4個研究對象為類固醇敏感型(最大抑制＞60％，第1-4名)，4個為類固醇耐受型(最大抑制＜60％，第5-8名)。從所有類固醇耐受型研究對象的最大抑制效果來看，巴利昔單抗可以調(diào)節(jié)淋巴細胞對類固醇的敏感性，所有的均變?yōu)轭惞檀济舾行?。而且在濃度?0-7mol/l的地塞米松中，也能看到對淋巴細胞抑制百分比的效果。
巴利昔單抗調(diào)節(jié)淋巴細胞類固醇敏感性，同樣也可用于改變下列疾病的類固醇耐受型患者的類固醇敏感性自身免疫性活動性肝炎、哮喘、濕疹、脈管炎、一過性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、白血病、腎小球腎炎、多發(fā)性硬化癥、潰瘍性結(jié)腸炎、結(jié)節(jié)病或局限性回腸炎，上述疾病患者類固醇治療無效很可能是因其有類固醇耐受型淋巴細胞。巴利昔單抗對淋巴細胞類固醇敏感性的調(diào)節(jié)，使類固醇耐受型淋巴細胞變?yōu)轭惞檀济舾行约毎?，這種調(diào)節(jié)使患者由先前對類固醇治療無效到類固醇治療有效。另外，那些被認為對類固醇治療有效的類固醇敏感型患者，如果使用巴利昔單抗治療，將使類固醇治療的起效更快。
實施例2用浮力密度離心法，分41次從32名研究對象(25名健康志愿者，7名靜止期潰瘍性結(jié)腸炎患者)中分離外周血淋巴細胞。在植物凝血素刺激的淋巴細胞增生的情況下，通過測定地塞米松(DEX)的抗增生作用果，測定淋巴細胞對類固醇的敏感性。類固醇誘導的最大抑制作用以對照組淋巴細胞增生的百分比表示(Imax)。分別在有和無巴利昔單抗(1mg/l)存在的兩組中，測定Imax。添加了巴利昔單抗一組明顯增強了地塞米松抗增生作用。
(Wilcoxon signed-rank檢驗，p＜0.0001)
通過添加巴利昔單抗所有8名類固醇耐受型研究對象(在體外)均被調(diào)節(jié)為類固醇敏感型(Imax＜60％)。因此，巴利昔單抗在體外有明顯的類固醇增強效果。
權(quán)利要求
1.在預防或治療類固醇敏感型或耐受型患者自身免疫性肝炎、哮喘、濕疹、脈管炎、一過性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、白血病、腎小球腎炎、多發(fā)性硬化癥、潰瘍性結(jié)腸炎、結(jié)節(jié)病或局限性回腸炎中使用的CD25結(jié)合分子或其直接等價物，該結(jié)合分子包括至少一個抗原結(jié)合位點，該結(jié)合位點包括至少一個結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域依次包括高變區(qū)CDR1、CDR2和CDR3；所述CDR1的氨基酸序列為Arg-Tyr-Trp-Met-His，所述CDR2的氨基酸序列為Ala-Ile-Tyr-Pro-Gly-Asn-Ser-Asp-Thr-Ser-Tyr-Asn-Gln-Lys-Phe-Glu-Gly，且所述CDR3的氨基酸序列為Asp-Tyr-Gly-Tyr-Tyr-Phe-Asp-Phe。
2.權(quán)利要求1所定義的CD25結(jié)合分子，該結(jié)合分子用于生產(chǎn)預防或治療類固醇敏感型或耐受型患者自身免疫性肝炎、哮喘、濕疹、脈管炎、一過性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、白血病、腎小球腎炎、多發(fā)性硬化癥、潰瘍性結(jié)腸炎、結(jié)節(jié)病或局限性回腸炎的藥物。
3.預防或治療類固醇敏感型或耐受型患者自身免疫性肝炎、哮喘、濕疹、脈管炎、一過性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、白血病、腎小球腎炎、多發(fā)性硬化癥、潰瘍性結(jié)腸炎、結(jié)節(jié)病或局限性回腸炎的藥物組合物，該組合物包括權(quán)利1要求所定義的CD25結(jié)合分子和藥學上可接受的載體或稀釋劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2的CD25結(jié)合分子，該結(jié)合分子是巴利昔單抗或達珠單抗。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的組合物，其中所述CD25結(jié)合分子是巴利昔單抗或達珠單抗。
6.預防或治療類固醇敏感型或耐受型患者自身免疫性肝炎、哮喘、濕疹、脈管炎、一過性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、白血病、腎小球腎炎、多發(fā)性硬化癥、潰瘍性結(jié)腸炎、結(jié)節(jié)病或局限性回腸炎的方法，該方法包括給予所述患者有效量的權(quán)利要求1所定義的CD25結(jié)合分子。
7.預防或治療類固醇敏感型或耐受型患者自身免疫性肝炎、哮喘、濕疹、脈管炎、一過性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、白血病、腎小球腎炎、多發(fā)性硬化癥、潰瘍性結(jié)腸炎、結(jié)節(jié)病或局限性回腸炎的方法，該方法包括給予所述患者治療有效量的下列物質(zhì)a)權(quán)利要求1所定義的CD25結(jié)合分子，和b)有效預防或治療自身免疫性肝炎、哮喘、濕疹、脈管炎、一過性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、白血病、腎小球腎炎、多發(fā)性硬化癥、潰瘍性結(jié)腸炎、結(jié)節(jié)病或局限性回腸炎的另外一種藥物。
8.在權(quán)利要求7的方法中使用的治療組合，所述組合包括含有權(quán)利要求1所定義的CD25結(jié)合分子的藥物組合物，并且還包括至少一種含有另外一種有效預防或治療自身免疫性肝炎、哮喘、濕疹、脈管炎、一過性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、白血病、腎小球腎炎、多發(fā)性硬化癥、潰瘍性結(jié)腸炎、結(jié)節(jié)病或局限性回腸炎的藥物的藥物組合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求6或7的方法，其中所述CD25結(jié)合分子是巴利昔單抗或達珠單抗。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的治療組合，其中所述CD25結(jié)合分子是巴利昔單抗或達珠單抗。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療類固醇敏感型或耐受型患者選自下列的疾病的方法自身免疫性肝炎、哮喘、濕疹、脈管炎、一過性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、白血病、腎小球腎炎、多發(fā)性硬化癥、潰瘍性結(jié)腸炎、結(jié)節(jié)病和局限性回腸炎，所述方法包括給予所述患者治療有效量的CD25結(jié)合分子。
文檔編號A61P17/02GK1527840SQ02807480
公開日2004年9月8日 申請日期2002年4月5日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月6日
發(fā)明者S·D·希爾林, C·M·達揚, M·R·諾曼, S D 希爾林, 諾曼, 達揚 申請人:布里斯托爾大學