專利名稱：用于競爭性調(diào)節(jié)二肽基肽酶iv催化的肽結(jié)構(gòu)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明在主題內(nèi)涉及二肽基肽酶IV(DP IV，同義詞DPP IV、CD26，EC3.4.14.5)和DP IV樣酶和它們對促胰島素肽抑胃多肽1-42(GIP1-42)和胰高血糖素樣肽酰胺-1(GLP-17-36)和(GLP-17-37)或它們的類似物的血漿水平的生物學(xué)作用。本發(fā)明還涉及葡萄糖耐量低減、糖尿病、糖尿和代謝性酸中毒的治療，所述治療通過以下進行由于使用藥理學(xué)劑量的二肽基肽酶IV地三、四和五肽底物而選擇性調(diào)節(jié)DP IV樣酶的活性，以抑制內(nèi)源肽激素的生理學(xué)翻轉(zhuǎn)。
背景技術(shù)：
二肽基肽酶IV(DP IV)為切割肽鏈的N-末端二肽的絲氨酸蛋白酶，所述肽鏈優(yōu)選在倒數(shù)第二位含有脯氨酸殘基。
DP IV樣酶與DP IV是在結(jié)構(gòu)上相關(guān)的酶(Blanco等人，1998)，它們可能與DP IV序列具有某些序列同源性，但是即使它們結(jié)構(gòu)不相關(guān)(通過趨同進化)，它們也具有DP IV通過在倒數(shù)第二位的脯氨酸殘基后切割而從多肽的N-末端除去二肽的底物特異性。這種酶-一方面包括DP IV、DP II，另一方面包括吸誘素(attractin)(Fukasawa等人，2001)-還能夠從多肽的N-末端除去具有倒數(shù)第二位的丙氨酸(或絲氨酸或甘氨酸殘基)的二肽，但通常其催化效率比脯氨酸后切割小(Yaron&Naider，1993)。它們表現(xiàn)出共同的特征，即在靶蛋白的Pro位置還容納(accomotate)Ala、Ser、Thr和其它具有小疏水側(cè)鏈的氨基酸如Gly或Val。水解效力等級為Pro＞Ala＞＞Ser，Thr＞＞Gly、Val。雖然蛋白DPIV、DP II、FAPα(Seprase)、DP6、DP8和DP9在結(jié)構(gòu)上相關(guān)并表現(xiàn)出高序列同源性，但吸誘素是一種特別的功能性DPIV樣酶(Sedo&Malik，2001)。
在WO 01/19866、WO 02/04610、WO 02/34900和WO 02/31134中公開了其它DPIV樣酶。WO 01/19866公開了一種與DPIV和成纖維細胞激活蛋白(FAP)結(jié)構(gòu)和功能類似的新的人二肽基氨基肽酶(DPP8)。WO 02/04610的二肽基肽酶IV樣酶在本領(lǐng)域中是已知的。在GENE BANK數(shù)據(jù)庫中，這種酶注冊為KIAA1492(2001年2月注冊，2000年4月4日提交，AB040925)并在MEROPS數(shù)據(jù)庫中注冊。WO 02/34900公開了一種與DPIV和DPP8的氨基酸序列具有顯著同源性的二肽基肽酶9(DPP9)。WO 02/31134公開了三種DPIV樣酶，DPRP1、DPRP2和DPRP3。序列分析揭示，DPRP1與WO 01/19866中公開的DPP8相同，DPRP2與DPP9相同，而DPRP3與WO 02/04610公開的KIAA1492相同。
最近，已證明DP IV負責(zé)切割胰高血糖素樣肽-1和抑胃肽，從而縮短GLP-1和GIP的半衰期和它們在循環(huán)中的生理反應(yīng)。從血清DPIV的抑制已證明腸降血糖素的生物活性顯著增加。由于腸降血糖素是胰腺胰島素分泌的主要刺激物并對葡萄糖處理具有直接的有益作用，DP IV抑制代表用于治療葡萄糖耐量低減和非胰島素依賴性糖尿病(NIDDM)和相關(guān)疾病如糖尿和代謝性酸中毒的有吸引力的方法(參見DE 196 16 486和WO 97/40832)。
酶二肽基肽酶IV的底物特異性可以以下方式概述
1.當(dāng)?shù)箶?shù)第二位殘基為脯氨酸、羥脯氨酸、脫氫脯氨酸、2-哌啶
酸或丙氨酸時，二肽基肽酶IV從N-末端水解寡肽和蛋白質(zhì)，
分裂出二肽單元。根據(jù)它們的Kcat/Km值的最好的底物為在P1
位具有脯氨酸殘基的底物。
2.DP IV要求P1和P2殘基之間的‘反式’肽鍵。
3.底物的N-末端氨基必須被質(zhì)子化以對DP IV易感。
4.底物的P1′位的脯氨酸殘基防止底物被二肽基肽酶IV水解。例
如，這種酶不釋放緩激肽中的精氨酰脯氨酸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及由式(I)代表的化合物
其中的某些限定如下文詳述。
這些化合物是脯氨酸特異性肽酶，特別是DP IV和其它具有類似DP IV樣酶活性曲線的酶(“DP IV樣酶”)的底物，且可以用作DP IV和DP IV樣酶的底物或拮抗劑，以通過競爭性催化而抑制內(nèi)源肽激素的生理學(xué)翻轉(zhuǎn)。
式(I)的化合物可以用于治療受試者中診斷的葡萄糖耐量低減、糖尿病、糖尿、代謝性酸中毒、癌和多發(fā)性硬化。


圖1顯示血管內(nèi)給予10、30和100mg/kg b.w.Ile-Pro-Ile后Wistar大鼠中的血漿DP IV活性；
圖2顯示給予10、30和100mg/kg b.w.Ile-Pro-Ile和作為陽性對照的10mg/kg b.w.異亮氨酰噻唑烷延胡索酸鹽后Wistar大鼠中的血漿DP IV活性(AUC0-20分鐘)；
圖3顯示血管內(nèi)給予10、30和100mg/kg b.w.Val-Pro-Leu后Wistar大鼠中的血漿DP IV活性；
圖4顯示給予10、30和100mg/kg b.w.Val-Pro-Leu和作為陽性對照的10mg/kg b.w.異亮氨酰噻唑烷延胡索酸鹽后Wistar大鼠中的血漿DP IV活性(AUC0-20分鐘)；
圖5顯示口服和血管內(nèi)給予100mg/kg b.w.叔丁基-Gly-Pro-Ile后Wistar大鼠中的血漿DP IV活性；
圖6顯示口服和血管內(nèi)給予100mg/kg b.w.叔丁基-Gly-Pro-Ile和作為陽性對照的10mg/kg b.w.異亮氨酰噻唑烷延胡索酸鹽后Wistar大鼠中的血漿DP IV活性(AUC0-20分鐘)；
圖7顯示口服給予100mg/kg b.w.叔丁基-Gly-Pro-Ile和作為陽性對照的10mg/kg b.w.異亮氨酰噻唑烷延胡索酸鹽后糖尿病Zucker大鼠中的血漿葡萄糖濃度過程；和
圖8顯示口服給予100mg/kg b.w.叔丁基-Gly-Pro-Ile和作為陽性對照的10mg/kg b.w.異亮氨酰噻唑烷延胡索酸鹽后糖尿病Zucker大鼠在OGTT期間的葡萄糖耐量和G-AUC的改善(G-AUC0-60分鐘)。具體實施方案
更具體地說，本發(fā)明涉及下式(I)的肽
其中
A、B、C、D和E為任何氨基酸，包括蛋白原氨基酸、非蛋白原氨基酸、L-氨基酸和D-氨基酸，且其中E和/或D可以不存在或者B和/或A可以不存在，其它條件如以下詳述
關(guān)于式(I)的其它條件
A為除D-氨基酸之外的任何氨基酸；
B為選自Pro、Ala、Ser、Gly、Hyp、氮雜環(huán)丁烷-(2)-羧酸(acetidine-(2)-carboxylic acid)和2-哌啶酸的氨基酸；
C為除Pro、Hyp、氮雜環(huán)丁烷-(2)-羧酸、2-哌啶酸和N-烷基化的氨基酸例如N-甲基纈氨酸和肌氨酸之外的任何氨基酸，
D為任何氨基酸或不存在，且
E為任何氨基酸或不存在；
或者
C為除Pro、Hyp、氮雜環(huán)丁烷-(2)-羧酸、2-哌啶酸、N-烷基化的氨基酸例如N-甲基纈氨酸和肌氨酸、D-氨基酸之外的任何氨基酸；
D為選自Pro、Ala、Ser、Gly、Hyp、氮雜環(huán)丁烷-(2)-羧酸和2-哌啶酸的氨基酸，且
E為除Pro、Hyp、氮雜環(huán)丁烷-(2)-羧酸、2-哌啶酸、N-烷基化的氨基酸例如N-甲基纈氨酸和肌氨酸之外的任何氨基酸。
本發(fā)明特別地涉及式(I)的化合物，其中
A為除D-氨基酸之外的任何氨基酸；
B為選自Pro、Ala、Ser、Gly、Hyp、氮雜環(huán)丁烷-(2)-羧酸和2-哌啶酸的氨基酸；
C為除Pro、Hyp、氮雜環(huán)丁烷-(2)-羧酸、2-哌啶酸和N-烷基化的氨基酸例如N-甲基纈氨酸和肌氨酸之外的任何氨基酸，
D為任何氨基酸或不存在，且
E為任何氨基酸或不存在。
本發(fā)明還涉及式(I)的化合物，其中
A為除D-氨基酸之外的任何氨基酸；
B為選自Pro、Ala、Ser、Gly、Hyp、氮雜環(huán)丁烷-(2)-羧酸和2-哌啶酸的氨基酸，
C為除Pro、Hyp、氮雜環(huán)丁烷-(2)-羧酸、2-哌啶酸、N-烷基化的氨基酸例如N-甲基纈氨酸和肌氨酸、D-氨基酸之外的任何氨基酸；
D為選自Pro、Ala、Ser、Gly、Hyp、氮雜環(huán)丁烷-(2)-羧酸和2-哌啶酸的氨基酸，且
E為除Pro、Hyp、氮雜環(huán)丁烷-(2)-羧酸、2-哌啶酸、N-烷基化的氨基酸例如N-甲基纈氨酸和肌氨酸之外的任何氨基酸。
優(yōu)選A為L-氨基酸；
還優(yōu)選C為L-氨基酸；
還優(yōu)選E為不存在；
還優(yōu)選D和E不存在；
還優(yōu)選A為叔丁基-Gly、Ile或Val；
特別優(yōu)選A為叔丁基-Gly；
還優(yōu)選B為Pro；
還優(yōu)選D為Pro；
還優(yōu)選C為叔丁基-Gly、Ile或Val；
更優(yōu)選C為叔丁基-Gly或Val；
特別優(yōu)選C為叔丁基-Gly；
特別優(yōu)選的是叔丁基-Gly-Pro-Ile、叔丁基-Gly-Pro-Val、Val-Pro-叔丁基-Gly、Ile-Pro-叔丁基-Gly或叔丁基-Gly-Pro-叔丁基-Gly和它們的藥學(xué)可接受的鹽。
本發(fā)明的化合物可以是游離酸肽形式或C-末端酰胺肽形式。
本發(fā)明的化合物可以游離C-末端酸或以C-末端酰胺形式存在。游離酸肽或酰胺可以通過側(cè)鏈修飾改變。這種側(cè)鏈修飾是，例如但不限于，高絲氨酸加成、焦谷氨酸加成、二硫鍵形成、天冬酰胺或谷氨酰胺殘基脫酰胺、甲基化、叔丁基化、叔丁氧羰基化、4-甲基芐基化、硫代茴香基化(thioanysilation)、硫代羥甲苯基化(thiocresylation)、芐氧基甲基化、4-硝基苯基化、芐氧羰基化、2-硝基苯甲?；?-硝基亞磺?；?、4-甲苯磺酰化、五氟苯基化、二苯基甲基化、2-氯芐氧羰基化、2，4，5-三氯苯基化、2-溴芐氧羰基化、9-芴基甲氧羰基化、三苯基甲基化、2，2，5，7，8-五甲基苯并二氫吡喃-6-磺?；?、羥基化、甲硫氨酸氧化、甲?；?、乙?；?、茴香基化、芐基化、苯甲?；⑷阴；⑻於彼峄蚬劝彼狒然?、磷酰化、硫酸化、半胱氨酰化、用戊糖、脫氧己糖、己糖胺、己糖或N-乙酰己糖胺糖基化(glycolysation)、法呢基化、肉豆蔻?；?、生物素基化、棕櫚?；?、硬脂?；?、香葉基香葉基化、谷胱甘肽基化、5′-腺苷基化、ADP-核糖基化、用N-羥乙酰神經(jīng)氨酸、N-乙酰神經(jīng)氨酸、吡哆醛磷酸、硫辛酸、4′-磷酸泛酰巰基乙胺或N-羥基琥珀酰亞胺修飾。
在式(I)的化合物中，根據(jù)標準命名法，氨基酸A、B、C、D和E分別以常規(guī)方式通過酰胺鍵與相鄰氨基酸連接，從而使氨基酸的氨基末端(N-末端)在左邊，而氨基酸的羧基末端在右邊。
可以用于本發(fā)明的氨基酸的實例為L和D-氨基酸、N-甲基-氨基酸；allo-和threo-形式的Ile和Thr，例如它們可以是α-、β-或ω-氨基酸，其中優(yōu)選α-氨基酸。
氨基酸的實例為天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、精氨酸(Arg)、賴氨酸(Lys)、組氨酸(His)、甘氨酸(Gly)、絲氨酸(Ser)和半胱氨酸(Cys)、蘇氨酸(Thr)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、酪氨酸(Tyr)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、纈氨酸(Val)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、羥脯氨酸(Hyp)、β-丙氨酸(β-Ala)、2-氨基辛酸(Aoa)、氮雜環(huán)丁烷-(2)-羧酸(azetidine-(2)-carboxylic acid，Ace)、2-哌啶酸(Pip)、3-氨基丙酸、4-氨基丁酸等、α-氨基異丁酸(Aib)、肌氨酸(Sar)、鳥氨酸(Orn)、瓜氨酸(Cit)、高精氨酸(Har)、叔丁基丙氨酸(叔丁基-Ala)、叔丁基甘氨酸(叔丁基-Gly)、N-甲基異亮氨酸(N-MeIle)、苯基甘氨酸(Phg)、環(huán)己基丙氨酸(Cha)、正亮氨酸(Nle)、磺基丙氨酸(Cya)和甲硫氨酸亞砜(MSO)、乙酰-Lys，修飾的氨基酸如磷酰-絲氨酸(Ser(P))、芐基-絲氨酸(Ser(Bzl))和磷酰-酪氨酸(Tyr(P))、2-氨基丁酸(Abu)、氨基乙基半胱氨酸(AECys)、羧甲基半胱氨酸(Cmc)、脫氫丙氨酸(Dha)、脫氫氨基-2-丁酸(Dhb)、羧基谷氨酸(Gla)、高絲氨酸(Hse)、羥基賴氨酸(Hyl)、順式羥脯氨酸(cisHyp)、反式羥脯氨酸(transHyp)、異纈氨酸(Iva)、焦谷氨酸(Pyr)、正纈氨酸(Nva)、2-氨基苯甲酸(2-Abz)、3-氨基苯甲酸(3-Abz)、4-氨基苯甲酸(4-Abz)、4-(氨基甲基)苯甲酸(Amb)、4-(氨基甲基)環(huán)己烷羧酸(4-Amc)、青霉胺(Pen)、2-氨基-4-氰基丁酸(Cba)、環(huán)烷烴羧酸。
ω-氨基酸的實例為，例如5-Ara(氨基戊酸)、6-Ahx(氨基己酸)、8-Aoc(氨基辛酸)、9-Anc(氨基壬酸)、10-Adc(氨基癸酸)、11-Aun(氨基十一酸)、12-Ado(氨基十二酸)。
其它氨基酸為2，3-二氫化茚基甘氨酸(Igl)、二氫吲哚-2-羧酸(Idc)、八氫吲哚-2-羧酸(Oic)、二氨基丙酸(Dpr)、二氨基丁酸(Dbu)、萘基丙氨酸(1-Nal)、(2-Nal)、4-氨基苯丙氨酸(Phe(4-NH2))、4-苯甲酰苯丙氨酸(Bpa)、二苯丙氨酸(Dip)、4-溴苯丙氨酸(Phe(4-Br))、2-氯苯丙氨酸(Phe(2-Cl))、3-氯苯丙氨酸(Phe(3-Cl))、4-氯苯丙氨酸(Phe(4-Cl))、3，4-氯苯丙氨酸(Phe(3，4-Cl2))、3-氟苯丙氨酸(Phe(3-F))、4-氟苯丙氨酸(Phe(4-F))、3，4-氟苯丙氨酸(Phe(3，4-F2))、五氟苯丙氨酸(Phe(F5))、4-胍基苯丙氨酸(Phe(4-胍基))、高苯丙氨酸(hPhe)、3-jodo苯丙氨酸(Phe(3-J))、4-iodo苯丙氨酸(Phe(4-J))、4-甲基苯丙氨酸(Phe(4-Me))、4-硝基苯丙氨酸(Phe-4-NO2))、聯(lián)苯基丙氨酸(Bip)、4-膦?；谆奖彼?Pmp)、環(huán)己基甘氨酸(Ghg)、3-吡啶基丙氨酸(3-Pal)、4-吡啶基丙氨酸(4-Pal)、3，4-脫氫脯氨酸(A-Pro)、4-酮脯氨酸(Pro(4-keto))、硫代脯氨酸(Thz)、六氫異煙酸(isonipecotic acid)(lnp)、1，2，3，4-四氫異喹啉-3-羧酸(Tic)、炔丙基甘氨酸(Pra)、6-羥基正亮氨酸(NU(6-OH))、高酪氨酸(hTyr)、3-jodo酪氨酸(Tyr(3-J))、3，5-二jodo酪氨酸(Tyr(3，5-J2))、d-甲基-酪氨酸(Tyr(Me))、3-NO2-酪氨酸(Tyr(3-NO2))、磷酸酪氨酸(Tyr(PO3H2))、烷基甘氨酸、1-氨基茚滿-1-羧酸、2-氨基茚滿-2-羧酸(Aic)、4-氨基-甲基吡咯-2-羧酸(Py)、4-氨基-吡咯烷-2-羧酸(Abpc)、2-氨基四氫萘-2-羧酸(Atc)、二氨基乙酸(Gly(NH2))、二氨基丁酸(Dab)、1，3-二氫-2H-isoinole-羧酸(Disc)、高環(huán)己基丙氨酸(hCha)、高苯丙氨酸(hPhe或Hof)、反式-3-苯基-氮雜環(huán)丁烷-2-羧酸、4-苯基-吡咯烷-2-羧酸、5-苯基-吡咯烷-2-羧酸、3-吡啶基丙氨酸(3-Pya)、4-吡啶基丙氨酸(4-Pya)、苯乙烯基丙氨酸、四氫異喹啉-1-羧酸(Tiq)、1，2，3，4-四氫去甲哈爾滿(norharmane)-3-羧酸(Tpi)、β-(2-thienryl)-丙氨酸(Tha)。
編碼在遺傳密碼中的氨基酸的氨基酸置換也可以包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的肽化合物中。
本發(fā)明還涉及包含至少一種本發(fā)明的化合物和藥學(xué)可接受的載體和/或稀釋劑的藥物組合物。
這種藥物組合物可以通過將至少一種本發(fā)明的化合物和藥學(xué)可接受的載體和/或稀釋劑混合而制備。
根據(jù)本發(fā)明的化合物和組合物可以用于制備預(yù)防或治療由二肽基肽酶IV活性的調(diào)節(jié)介導(dǎo)的藥物。
例如，這些病癥選自葡萄糖耐量低減、糖尿病、糖尿、代謝性酸中毒、癌癥和多發(fā)性硬化。
本文所用的術(shù)語“受試者”指動物，優(yōu)選哺乳動物，最優(yōu)選人，它是治療、觀察或試驗的對象。
本文所用的術(shù)語“治療有效量”意指研究者、獸醫(yī)、醫(yī)生或其它臨床醫(yī)生尋求的在組織系統(tǒng)、動物或人中引起生物或藥物反應(yīng)，包括緩解在治療的疾病或病癥的癥狀的活性化合物或藥學(xué)試劑的量。
本文所用的術(shù)語“組合物”意指包括含有治療有效量的本發(fā)明的化合物的產(chǎn)品，和任何直接或間接地由所要求的化合物的組合得到的產(chǎn)品。
本發(fā)明的化合物還可以藥學(xué)可接受的鹽的形式存在。藥學(xué)可接受的鹽一般采取其中氨基酸堿基側(cè)鏈被無機或有機酸質(zhì)子化的形式。代表性的有機或無機酸包括例如鹽酸、氫溴酸、高氯酸、硫酸、硝酸、磷酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、琥珀酸、馬來酸、延胡索酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、苦杏仁酸、甲磺酸、羥基乙磺酸、苯磺酸、草酸、雙羥萘酸、2-萘磺酸、對甲苯磺酸、環(huán)己烷氨基磺酸、水楊酸、己糖酸或三氟乙酸。
本發(fā)明在其范圍內(nèi)還包括本發(fā)明的化合物的前藥。一般而言，這種前藥是這些化合物的可以在體內(nèi)容易地轉(zhuǎn)化為期望的治療活性化合物的官能衍生物。因此在這些情況下，本發(fā)明的用途包括用一種或多種所要求的化合物的前藥形式治療所述的多種疾病，所述前藥在給予受試者后在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為上述化合物。例如在以下文獻中描述了用于選擇和制備適宜的前藥衍生物的常規(guī)方法“Design of Prodrugs”，ed.H.Bundgaard，Elsevier，1985和專利申請DE 198 28 113和WO99/67278、DE 198 28 114和WO 99/67279，本文引用所述文獻作為參考。
當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的化合物具有至少一個手性中心時，它們可以相應(yīng)地以消旋體存在。當(dāng)這些化合物具有兩個或更多個手性中心時，它們還可以非對映體存在。應(yīng)該理解，所有這些異構(gòu)體及其混合物都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。而且，所述化合物的某些結(jié)晶形式可以多晶型物存在并同樣包括在本發(fā)明內(nèi)。此外，某些所述化合物可以與水(即水合物)或常規(guī)有機溶劑形成溶劑化物，而這些溶劑化物也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在本申請人的發(fā)明之前，已知的體外脯氨酸特異性絲氨酸蛋白酶二肽基肽酶IV的肽底物為三肽Diprotin A(Ile-Pro-Ile)、Diprotin B(Val-Pro-Leu)和Diprotin C(Val-Pro-Ile)。這些化合物本身被排除在本發(fā)明之外。申請人已意外地發(fā)現(xiàn)本文公開的藥理學(xué)劑量的化合物擔(dān)當(dāng)哺乳動物的體內(nèi)二肽基肽酶IV底物，通過競爭性催化抑制內(nèi)源肽激素的生理學(xué)翻轉(zhuǎn)。
可以用作二肽基肽酶IV和DP IV樣酶調(diào)節(jié)劑的本發(fā)明的特別優(yōu)選的化合物或前藥包括顯示DP IV結(jié)合的Ki值，在血管內(nèi)(i.v.)和/或口服(p.o.)給予Wistar大鼠后在體內(nèi)有效抑制DP IV，并且在i.v.或p.o.給予fa/fa Zucker大鼠后有效改善葡萄糖耐量的化合物或前藥。
本發(fā)明的調(diào)節(jié)劑可以使用固相化學(xué)，或者通過普通溶液化學(xué)，使用本領(lǐng)域中已知的常規(guī)方法制備。
可以根據(jù)實施例3和4中所述的方法確定式(I)的化合物用作DPIV底物以通過體內(nèi)競爭性催化而抑制內(nèi)源肽激素的生理學(xué)翻轉(zhuǎn)的用途。因此，本發(fā)明提供預(yù)防或治療需要其的患者的由DP IV活性的調(diào)節(jié)介導(dǎo)的病癥的方法，所述方法包括以有效治療該病癥的量和劑量方案給予任何所述化合物或其藥物組合物。此外，本發(fā)明包括式(I)的化合物用于制備預(yù)防或治療受試者的由DP IV活性的調(diào)節(jié)介導(dǎo)的病癥的藥物的用途。所述化合物可以任何常規(guī)給藥途徑給予患者，所述給藥途徑包括但不限于靜脈內(nèi)、口服、皮下、肌內(nèi)、皮內(nèi)和腸胃外或它們的組合。優(yōu)選口服給藥。
本發(fā)明還提供包含一種或多種本發(fā)明的化合物和藥學(xué)可接受的載體和/或稀釋劑的藥物組合物。
為了制備本發(fā)明的藥物組合物，首先根據(jù)常規(guī)藥物復(fù)合技術(shù)，將作為活性成分的一種或多種式(I)的化合物或它們的鹽與藥物載體和/或稀釋劑混合，所述載體根據(jù)給藥例如口服或腸胃外給藥如肌內(nèi)給藥所需的制劑形式而采用多種形式。在制備口服劑型的組合物中，可以使用任何常規(guī)藥物介質(zhì)。因此，對于液體口服制劑如混懸劑、酏劑和溶液劑，適宜的載體和添加劑可以有利地包括水、乙二醇、油、醇、食用香料、防腐劑、著色劑等；對于固體口服制劑如散劑、膠囊劑、凝膠膠囊劑(gelcap)和片劑，適宜的載體和添加劑包括淀粉、糖、稀釋劑、造粒劑、潤滑劑、粘合劑、崩解劑等。由于片劑和膠囊劑給藥方便，因而它們代表最有利的口服單元劑型，在這種情況下使用固體藥物載體。如果需要的話，片劑可以通過標準技術(shù)包糖衣或包腸溶衣。對于腸胃外給藥，載體通常包含無菌水，雖然也可以包括其它成分，例如用于幫助溶解或用于保存。
也可以制備注射混懸劑，在這種情況下可以使用適宜的液體載體、助懸劑等。本文的藥物組合物的每劑量單元，如片劑、膠囊劑、散劑、注射劑、一茶匙量(teaspoonful)等含有轉(zhuǎn)運上述有效劑量所需量的活性成分量。本文的藥物組合物的每劑量單元，如片劑、膠囊劑、散劑、注射劑、栓劑、一茶匙量等含有約0.01mg至約1000mg(優(yōu)選約5至約500mg)，并可以約0.01至約300mg/kg體重/天(優(yōu)選1-50mg/kg/天)的劑量給藥。但是，劑量可以根據(jù)患者的需要、在治療的病癥的嚴重程度和所用的化合物而改變。可以采用每日給藥或周期后(post-periodic)給藥。通常劑量由醫(yī)師根據(jù)患者的特征、他的/她的病癥和期望的治療效果來調(diào)節(jié)。
優(yōu)選這些組合物為諸如以下的單元劑型片劑、丸劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、無菌腸胃外溶液或混懸劑、計量氣霧劑或液體噴霧劑、滴劑、安瓿、自我注射器裝置或栓劑；用于口、腸胃外、鼻內(nèi)、舌下或直腸給藥，或者用于吸入或吹入給藥?；蛘?，所述組合物可以適于一周一次或一月一次給藥的形式存在；例如可以使用活性化合物的不溶性鹽，如癸酸鹽以提供用于肌內(nèi)注射的長效制劑。對于制備固體組合物如片劑，將主要的活性成分與藥物載體，例如常規(guī)片劑成分如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂、磷酸二鈣或樹膠和其它藥物稀釋劑如水理想地混合，以形成含有本發(fā)明的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽的均勻混合物的固體處方設(shè)計前組合物。當(dāng)說這些處方設(shè)計前組合物均勻時，它意指活性成分理想地均勻分散在整個組合物中，從而使組合物可以容易地再分為同等有效的劑型，如片劑、丸劑和膠囊劑。然后可以將這種固體處方設(shè)計前組合物再分成含約0.01至約1000mg，優(yōu)選約5至約500mg的本發(fā)明的活性成分的上述類型的單元劑型。
可以有利地將所述新組合物的片劑或丸劑包衣或復(fù)合，以提供帶來延長作用優(yōu)點的劑型。例如，片劑或丸劑可以包含內(nèi)部劑量和外部劑量組分，后者為在前者上的外殼的形式。兩組分可以由腸溶層分開，該腸溶層用于抗胃中崩解并允許內(nèi)部組分完整地進入十二指腸或延遲釋放。許多材料可以用作這種腸溶層或包衣，這些材料包括具有諸如蟲膠、鯨蠟醇和乙酸纖維素的材料的許多聚合酸。
可以有利地引入本發(fā)明的新組合物用于口服或注射的液體形式包括水溶液、適宜調(diào)味的糖漿、含水或油的混懸劑、用食用油如棉籽油、芝麻油、椰子油或花生油調(diào)味的乳劑，以及酏劑和類似的藥物載體。用于含水混懸劑的適宜的分散劑或助懸劑包括合成和天然樹膠如黃芪膠、阿拉伯膠、藻酸鹽、葡聚糖、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮或明膠。
當(dāng)用于制備本發(fā)明的化合物的方法產(chǎn)生立體異構(gòu)體的混合物時，可以通過常規(guī)技術(shù)如制備色譜法分離這些異構(gòu)體。這些化合物可以制成外消旋形式，或者可以通過對映體特異性合成或拆分而制備單獨的對映體。例如，可以通過諸如以下的標準技術(shù)將所述化合物拆分成它們的組成對映體與光學(xué)活性酸，如(-)-二對甲苯甲酰-d-酒石酸和/或(+)-二對甲苯甲酰-1-酒石酸成鹽而形成非對映體對，然后分步結(jié)晶并再生游離堿。還可以通過形成非對映體酯或酰胺，然后進行色譜分離并除去手性輔劑而拆分化合物?；蛘?，可以使用手性HPLC柱拆分化合物。
在制備本發(fā)明的化合物的任何方法的過程中，可能需要和/或期望保護相關(guān)的任何分子上的敏感性或反應(yīng)性基團。這可以通過常規(guī)保護基實現(xiàn)，如在Protective Groups in Organic Chemistry，ed.J.F.W.McOmie，Plenum Press，1973；和T.W.Greene&P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley&Sons，1991中所述，本文引用這些文獻作為參考。這些保護基可以在隨后階段使用本領(lǐng)域中已知的方法方便地除去。
本發(fā)明所述的由二肽基肽酶IV和DPIV樣酶調(diào)節(jié)的病癥的治療方法還可以使用包含一種或多種本文定義的化合物和藥學(xué)可接受的載體的藥物組合物來完成。該藥物組合物可以含有約0.01mg至1000mg，優(yōu)選約5至約500mg或250mg的一種或多種所述化合物，并可以組成任何適于所選擇的給藥模式的劑型。載體包括必需的和惰性的藥物載體，包括但不限于粘合劑、助懸劑、潤滑劑、食用香料、甜味劑、防腐劑、染料和包衣。適于口服給藥的組合物包括固體形式，如丸劑、片劑、囊片、膠囊劑(各自包括中等釋放、定時釋放和延時釋放配方)、顆粒劑、散劑和液體形式如溶液劑、糖漿劑、酏劑、乳劑和混懸劑。用于腸胃外給藥的形式包括無菌溶液劑、乳劑和混懸劑。
有利地，本發(fā)明的化合物可以一次日劑量給藥，或者總?cè)談┝靠梢悦刻於?、三或四次的分開的劑量給藥。而且，本發(fā)明的化合物可以通過局部應(yīng)用適宜的鼻內(nèi)載體，以鼻內(nèi)形式給藥，或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的透皮藥貼給藥。為了以透皮遞送系統(tǒng)的形式給藥，在整個劑量方案中劑量給藥當(dāng)然是連續(xù)的而不是間歇的，需要相應(yīng)地改變劑量強度以獲得期望的治療效果。
例如，對于片劑或膠囊劑形式的口服給藥，可以將活性藥物組分與口服、無毒的藥學(xué)可接受的惰性載體如乙醇、甘油、水等組合。而且，如果期望或必需的話，還可以將適宜的粘合劑、潤滑劑、崩解劑和著色劑引入此混合物中。適宜的粘合劑包括但不限于淀粉、明膠、天然糖如葡萄糖或β-乳糖、玉米甜味劑、天然和合成樹膠如阿拉伯膠、黃芪膠或油酸鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、苯甲酸鈉、乙酸鈉、氯化鈉等。崩解劑包括但不限于淀粉、甲基纖維素、瓊脂、膨潤土、黃原膠等。
液體形式適于處在調(diào)味助懸劑或分散劑如合成和天然樹膠，如黃芪膠、阿拉伯膠、甲基纖維素等中。對于腸胃外給藥，無菌懸浮液和溶液是期望的。當(dāng)期望靜脈內(nèi)給藥時，使用一般含有適宜防腐劑的等滲制劑。
本發(fā)明的化合物還可以脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)，如小單室載體、大單室載體和多室載體的形式給藥?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中良好描述的方法，由多種磷脂如膽固醇、硬脂酰胺或磷脂酰膽堿形成脂質(zhì)體。
還可以通過使用抗體，最優(yōu)選單克隆抗體作為單獨的載體，化合物分子偶聯(lián)于其，而遞送本發(fā)明的化合物。本發(fā)明的化合物還可以與作為靶向藥物載體的可溶性聚合物偶聯(lián)。這些聚合物可以包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羥基丙基甲基丙烯酰胺酚、聚羥基乙基天冬酰胺酚或被棕櫚酰殘基取代的聚環(huán)氧乙烷聚賴氨酸。而且，本發(fā)明的化合物可以與一類用于實現(xiàn)藥物控釋的可生物降解的聚合物偶聯(lián)，這些聚合物例如聚乙酸、聚ε-己內(nèi)酯、聚羥基丁酸、聚原酸酯、聚縮醛、聚二氫吡喃、聚氰基丙烯酸酯和水凝膠的交聯(lián)或兩親嵌段共聚物。
在需要治療所述疾病的任何時候，本發(fā)明的化合物可以在任何前述組合物中，并根據(jù)本領(lǐng)域中確立的劑量方案給藥。
產(chǎn)品的日劑量可以在0.01-1.000mg/成人/天的寬范圍內(nèi)變化。對于口服給藥，組合物優(yōu)選以片劑形式提供，所述片劑含有0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0、100、150、200、250、500和1000毫克活性成分，用于根據(jù)癥狀調(diào)節(jié)待治療患者的劑量。有效量的藥物通常以約0.1mg/kg至約300mg/kg體重/天的劑量水平提供。優(yōu)選范圍為約1至約50mg/kg體重/天。這些化合物可以每天1-4次的方案給藥。
最佳的給藥劑量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定，且它隨所用的特定化合物、給藥方式、制劑強度、由于給藥方式導(dǎo)致的生物利用度以及疾病的推進而改變。此外，在調(diào)節(jié)劑量中一般應(yīng)考慮與特定的治療患者有關(guān)的因素，包括患者年齡、體重、飲食和給藥時間。
本發(fā)明的化合物或組合物可以在飯前、飯時或飯后服用。
當(dāng)在飯前服用時，可以在飯前1小時，優(yōu)選30或甚至15或5分鐘服用本發(fā)明的化合物或組合物。
當(dāng)在飯時服用時，可以將本發(fā)明的化合物或組合物混入膳食或以上述的單獨劑型服用。
當(dāng)在飯后服用時，在飯后5、15或30分鐘甚至1小時服用本發(fā)明的化合物和組合物。實施例實施例1Xaa-Pro-Yaa三肽的合成一般方法
所有的合成均在肽合成器SP650(Labortec AG)上，應(yīng)用Fmoc/tBu-策略進行。保護的氨基酸購自Novabiochem或Bachem。三氟乙酸(TFA)購自Merck，三異丙基硅烷(TIS)購自Fluka。
使用20％哌啶/N，N-二甲基甲酰胺(DMF)將預(yù)填充的Fmoc-Yaa-Wang樹脂(2.8g/取代水平0.57mmol/g)脫保護。在用DMF洗滌后，將2eq(1.1g)Fmoc-Pro-OH溶液溶于DMF(12ml溶劑/克樹脂)中。加入2eq(1.04g)2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(TBTU)和4eq(1.11ml)N，N-二異丙基乙胺(DIEA)，并將其置于反應(yīng)容器中。將混合物于室溫下振蕩20分鐘。然后重復(fù)偶聯(lián)循環(huán)。隨后用DMF、二氯甲烷、異丙醇和乙醚洗滌，接著干燥所得的Fmoc-Pro-Ile-Wang樹脂，并在偶聯(lián)最后的氨基酸衍生物之前將其分成6份。
如上述除去Fmoc保護基。然后將在DMF中的0.54mmol Boc-氨基酸、0.54mmol TBTU和0.108mmol DIEA振蕩20分鐘。重復(fù)偶聯(lián)循環(huán)。最后洗滌肽樹脂并如上述干燥。
使用包含以下清除劑TFA/H2O/三異丙基硅烷(TIS)＝9.5/0.25/0.25的三氟乙酸(TFA)的混合物從樹脂止切割肽，持續(xù)2.5小時。
粗品肽的收率平均為80-90％。通過HPLC在Nucleosil C18柱(7μm，250*21.20mm，100A)上純化粗品肽，使用線性梯度0.1％TFA/H2O并以6ml/min增大0.1％TFA/乙腈的濃度(40分鐘內(nèi)從5％到65％)。
凍干得到純肽，由電噴霧質(zhì)譜和HPLC分析鑒定純肽。結(jié)果
表1化學(xué)合成后Xaa-Pro-Yaa三肽的鑒定
1[M+H+]采用電噴霧質(zhì)譜，以陽性離子化模式測定。
2RP-HPLC條件
柱 LiChrospher 100 RP 18(5μm)，
125×4mm
檢測(UV)214nm
梯度系統(tǒng)乙腈(ACN)/H2O(0.1％TFA)在15分鐘內(nèi)從5％ACN至
50％，流速1ml/min
k′＝(tr-t0)/t0
t0＝1.16min
叔丁基-Gly定義為
Ser(Bzl)和Ser(P)分別定義為芐基-絲氨酸和磷酰-絲氨酸。
Tyr(P)定義為磷酰-酪氨酸。實施例2Xaa-Pro-Yaa三肽的IC50-和Ki-值的測定方法IC50-值的測定
將100μl抑制劑儲備液與100μl緩沖液(HEPES pH7.6)和50μl底物(Gly-Pro-pNA，最終濃度為0.4mM)混合，并在30℃下預(yù)溫育。通過加入20μl純化的豬DP IV開始反應(yīng)。在405nm下在10分鐘內(nèi)使用HTS 7000Plus平板讀數(shù)器(Perkin Elmer)測定產(chǎn)物pNA的形成并計算斜率。最終的抑制劑濃度范圍在1mM至30nM之間。
為了計算IC50-值，使用GraFit 4.0.13(Erithacus Software)。Ki-值的測定
為了測定Ki-值，以與上述相同的方式在0.05、0.1、0.2和0.4mM的最終底物濃度和覆蓋IC50濃度的其它7種抑制劑濃度處測定DP IV活性。使用GraFit Software進行計算。結(jié)果
表2Xaa-Pro-Yaa三肽的IC50-值
叔丁基-Gly定義為
Ser(Bzl)和Ser(P)分別定義為芐基-絲氨酸和磷酰-絲氨酸。
Tyr(P)定義為磷酰-酪氨酸。
表3Xaa-Pro-Yaa三肽的Ki-值
叔丁基-Gly定義為
Ser(Bzl)和Ser(P)分別定義為芐基-絲氨酸和磷酰-絲氨酸。
Tyr(P)定義為磷酰-酪氨酸。實施例3血管內(nèi)和口服給藥后Xaa-Pro-Yaa三肽在Wistar大鼠中對DP IV的血漿活性的影響研究設(shè)計動物
N＝10只體重＞350g的雄性Wistar大鼠(ShoeWist(Sho))購自Tierzucht Schnwald(Schnwalde，Germany)。飼養(yǎng)條件
在常規(guī)條件下，用受控的溫度(22±2℃)，以12/12小時光/暗循環(huán)(在06:00a.m.給光)單一籠養(yǎng)動物。允許其隨意獲取標準丸狀固體食物(ssni Soest，Germany)和用HCl酸化的自來水。頸動脈和頸靜脈的表征
在一周的飼養(yǎng)條件適應(yīng)后，在常規(guī)麻醉(腹膜內(nèi)注射0.25ml/kgb.w.Rompun[2％]，BayerVital，Germany和0.5ml/kg b.w.Ketamin10，Atarost GmbH&Co.，Twistringen，Germany)下將導(dǎo)管植入Wistar大鼠的頸動脈。使動物恢復(fù)一周。每周用肝素-鹽水(1001U/ml)沖洗導(dǎo)管三次。
如果導(dǎo)管功能不良，則將第二根導(dǎo)管插入相應(yīng)大鼠的對側(cè)頸動脈中。在外科手術(shù)恢復(fù)一周后，使動物再次用于研究。如果第二根導(dǎo)管功能不良，則將動物從研究中撤出。補充新的動物并以計劃的順序繼續(xù)試驗，所述試驗在導(dǎo)管植入后至少5天開始。實驗設(shè)計
以隨機的順序分別將測試物質(zhì)血管內(nèi)(動脈內(nèi))或口服給予具有完整導(dǎo)管功能的大鼠(各組N＝3只Wistar大鼠)。作為陽性對照，血管內(nèi)給予10mg/kg b.w.異亮氨酸噻唑烷*延胡索酸鹽。
在過夜禁食后，在-30、-5和0分鐘將100μl肝素化動脈血樣收集至冰冷的Eppendorf管中(參見以下)。將測試物質(zhì)新鮮溶于1.0ml鹽水(0.154mol/l)并在0分鐘通過飼管(15g，75mm；Fine ScienceTools，Heidelberg，Germany)口服或血管內(nèi)給予。對于血管內(nèi)途徑，立即用30μl鹽水沖洗導(dǎo)管并另外通過飼管口服給予1ml鹽水。
然后在5、10(僅在有限數(shù)目的試驗中)、20、40、60和120分鐘從有知覺的不受限制的大鼠的頸動脈導(dǎo)管取動脈血樣品，并且總是將所述動脈血樣品置入填充有10μl lM檸檬酸緩沖液pH3.0的冰冷的Eppendorf管(Eppendorf Netheler-Hinz，Hamburg，Germany)中，以防止血漿DP IV活性導(dǎo)致的三肽的進一步水解。立即將Eppendorf管離心(12000rpm持續(xù)2分鐘，Hettich Zentrifuge EBA12，Tuttlingen，Germany)在冰上保存血漿部分直至分析或在將其于-20℃下深冷直至分析。分析方法血漿DP IV活性試驗混合物由80μl試劑和20μl血漿組成。在30℃下預(yù)溫育2分鐘后，在390nm處，在1分鐘內(nèi)在相同的溫度下進行黃色產(chǎn)物4-硝基苯胺形成的動力學(xué)測定?；钚砸匀我鈫挝籟AU]和DP IV活性[mU/ml]表示。統(tǒng)計方法
計算血漿DP IV活性的絕對值、血漿DP IV活性的相對變化和最大抑制的時間和程度。數(shù)據(jù)表示包括表示曲線下面積(AUC)，它用于評價在兩小時的觀察期間血漿DP IV活性的抑制程度。使用梯形規(guī)則計算AUC。反應(yīng)性AUC具有在開始給予抑制劑的0分鐘的基線數(shù)值。為了比較DP IV活性的不同初始值條件下參數(shù)的相對變化，在測試開始時設(shè)置均勻的標準化平均值(值)(參見附圖和表)。
用Microsoft Excels97進行統(tǒng)計學(xué)評價。所有的變量均以平均值和標準偏差(SD)表示。通過斯氏t檢驗比較治療組，通過配對t檢驗比較組內(nèi)變化。認為p＜0.05的雙尾值是顯著性的。結(jié)果在Wistar大鼠中Ile-Pro-Ile對血漿DP IV活性的影響
通過血管內(nèi)途徑給予Wistar大鼠遞增劑量的10、30和100mg/kgb.w.的Ile-Pro-Ile(表1)。
在Ile-Pro-Ile的血管內(nèi)給藥后，存在由Ile-Pro-Ile導(dǎo)致的劑量依賴性血漿DP IV抑制的趨勢。這種抑制僅在100mg/kg b.w.的劑量下是顯著性的(相對于在0分鐘時的DP IV活性)。參見圖1，其表明由Ile-Pro-Ile導(dǎo)致的DP IV抑制迅速降低。在給藥后20分鐘二肽基肽酶IV活性的初始水平得以恢復(fù)。
參考圖2，可以看出在100mg/kg b.w.的劑量下DP IV活性的曲線下面積顯著性地減小(-159±40mU*min*ml-1，p＜0.05)。
表4在血管內(nèi)施用Ile-Pro-Ile后Wistar大鼠的血漿DP IV活性
時間最小的AUC(mU·min/ml)DP IV(mU/ml) 日期 -30-5 0 5 10 20 40 60 120最小 時間 下降 0-1200--20FS-5 4月3日 24,4 22,625,8 23,6 24,2 24,3 24,3 24,8 23,65 2,1 -171,4 -33,7FS-2 4月2日 27,2 29,825,9 23,2 27,2 25,4 28,5 23,2 23,25 2,6 14,3 -16,4FS-7 4月6日 19,3 19,720,5 20,2 20,6 20,6 19,3 18,0 20,25 0,3 -122,5 -2,4
平均值 23,6 24,124,1 22,4 24,0 23,5 24,0 22,0 22,45,01,7 -93,2-17,5
SD 4,05,2 3,11,93,32,54,63,61,9 0,01,2 96,2 15,7 標準.平均 24,6 25,025,0 23,3 24,9 24,4 25,0 22,9 22,9
時間最小的 AUC(mU·min/ml)DP IV(mU/ml) 日期 -30-5 0 5 10 20 40 60 120最小時間 下降 0-1200-20FS-24月10日 32,0 34,630,3 25,0 32,9 25,4 31,1 34,2 25,0 5 5,350,4 -32,9FS-94月11日 25,0 25,028,1 15,4 28,5 25,0 28,1 25,0 15,4 5 12,7 -273,0 -123,9FS-14 4月26日 16,7 17,115,4 10,1 15,4 15,8 12,7 14,9 10,1 5 5,3-162,3 -52,6
平均值 24,6 25,624,6 16,8 25,6 22,1 24,0 24,7 16,8 5,0 7,7-128,3 -69,8
SD 7,78,8 8,17,69,15,49,99,77,6 0,0 4,3164,447,9 標準.平均 25,0 26,025,0 17,3 26,0 22,5 24,4 25,1 17,3
時間最小的 AUC(mU·min/ml)DP IV(mU/ml) 日期 -30-5 0 5 10 20 40 60 120最小 時間下降 0-120 0-20FS-13 4月23日 16,7 19,321,1 5,3 6,6 19,7 21,1 19,7 21,9 5,3 5 15,8 -233,6-194,1FS-10 4月30日 21,9 20,621,1 4,8 8,8 22,4 22,8 20,2 20,0 4,8 5 16,2 -185,1-166,7FS-14 4月30日 15,4 14,914,9 5,3 6,1 14,5 14,5 18,0 15,8 5,3 5 9,69,7 -116,2
平均值 18,0 18,319,0 5,1 7,2 18,9 19,4 19,3 19,2 5,1 5,013,9 -133,0-159,0
SD3,53,0 3,50,3 1,4 4,04,41,23,10,3 0,03,7134,4 39,5 標準.平均 24,0 24,325,0 11,1 13,2 24,9 25,4 25,3 25,2 11,1
。。
* *+ *+在Wistar大鼠中Val-Pro-Leu對血漿DP IV活性的影響
血管內(nèi)給予10和30mg/kg b.w.的Val-Pro-Leu后可見血漿DP IV活性降低的趨勢(圖3)。在給予10mg/kg b.w.后，最低血漿活性是5分鐘時的26.2±8.0mU/ml(NS)，而在給予30mg/kg后為21.8±9.8(NS)。這還反映在給予10mg/kg b.w.Val-Pro-Leu(NS)后的-34±6mUminml-1的低DP IV-AUC0-20min和給予30mg/kg b.w.Val-Pro-Leu(NS)后的-10±10mUminml-1。
參照圖4，在血管內(nèi)給藥后100mg/kg b.w.降低5分鐘時的血漿DP IV活性(10.4±3.2mU/ml；p＜0.05vs.0分鐘)，因此DP IV-AUC0-20min輕微降低(-54±54mUminml-1；NS)。
血漿DP IV的抑制總是終止于給藥后20分鐘。
表5血管內(nèi)施用Val-Pro-Leu后Wistar大鼠的血漿DP IV活性
時間 最小的 AUC(mU·min/ml)DP IV(mU/ml)日期 -305 0 5 10 20 40 60120最小 時間 下降 0-120 0-20FS-54月3日 24,4 22,6 25,8 23,6 24,2 24,3 24,3 24,8 23,65 2,1-171,4-33,7FS-24月2日 27,2 29,8 25,9 23,2 27,2 25,4 28,5 23,2 23,25 2,614,3 -16,4FS-74月6日 19,3 19,7 20,5 20,2 20,6 20,6 19,3 18,0 20,25 0,3-122,5-2,4
平均值23,6 24,1 24,1 22.4 24.0 23.5 24.0 22.0 22.45.0 1.7-93.2 -17.5
SD4,05,23,11,93,32,54,6 3,61,9 0,0 1,296,2 15,7 標準.平均24,6 25,0 25,0 23,3 24,9 24,4 25,0 22,9 22,9
時間 最小的 AUC(mU·min/ml)DP IV(mU/ml)日期 -30-5 0 5 10 20 40 60120最小時間 下降 0-1200-20FS-2 4月10日 32,0 34,6 30,3 25,0 32,9 25,4 31,1 34,2 25,0 5 5,3 50,4 -32,9FS-9 4月11日 25,0 25,0 28,1 15,4 28,5 25,0 28,1 25,0 15,4 5 12,7 -273,0 -123,9FS-14 4月26日 16,7 17,1 15,4 10,1 15,4 15,8 12,7 14,9 10,1 5 5,3 -162,3 -52,6
平均值 24,6 25,6 24,6 16,8 25,6 22,1 24,0 24,7 16,8 5,0 7,7 -128,3 -69,8
SD7,78,88,17,69,15,49,9 9,77,6 0,0 4,3 164,447,9 標準.平均25,0 26,0 25,0 17,3 26,0 22,5 24,4 25,1 17,3
時間 最小的AUC(mU·min/ml)DP IV(mU/ml)日期 -30-5 0 5 10 20 40 60120最小時間 下降 0-120 0-20FS-13 4月23日 16,7 19,3 21,1 5,3 6,6 19,7 21,1 19,7 21,9 5,3 515,8 -233,6-194,1FS-10 4月30日 21,9 20,6 21,1 4,8 8,8 22,4 22,8 20,2 20,0 4,8 516,2 -185,1-166,7FS-14 4月30日 15,4 14,9 14,9 5,3 6,1 14,5 14,5 18,0 15,8 5,3 59,619,7 -116,2
平均值 18,0 18,3 19,0 5,1 7,2 18,9 19,4 19,3 19,2 5,1 5,0 13,9 -133,0-159,0
SD3,53,03,50,3 1,4 4,04,41,2 3,10,3 0,0 3,7134,4 39,5 標準平均24,0 24,3 25,0 11,1 13,2 24,9 25,4 25,3 25,2 11,1
。。
* *+ *+
化合物Ile-Pro-Ile和Val-Pro-Leu在以相對高的劑量(100mg/kgb.w.)血管內(nèi)給藥后抑制Wistar大鼠中的血漿DP IV活性。Ile-Pro-Ile在血管內(nèi)給藥后似乎是劑量依賴性抑制DP IV。在Wistar大鼠中叔丁基Gly-Pro-Ile對血漿DP IV活性的影響
口服和血管內(nèi)給予100mg/kg b.w.叔丁基-Gly-Pro-Ile。參照圖5，叔丁基-Gly-Pro-Ile在口服給予時確實在40分鐘的時間內(nèi)緩慢降低血漿DP IV。血管內(nèi)給予100mg/kg b.w.導(dǎo)致在5分鐘時快速降至10mU/ml以下(p＜0.05)。其后發(fā)現(xiàn)恢復(fù)(p＜0.05，5分鐘vs.40分鐘)。DP IV-AUC0-120min在血管內(nèi)給藥(-617±234mUminml-1)后比口服給藥(-336±162mUminml-1)后降低更多。
表6口服給予叔丁基-Gly-Pro-Ile后Wistar大鼠的血漿DP IV活性
DP IV-
時間 AUCDP IV(mU/m1) -30 -5 0 2,5 5 7,5 10 15 20 40 60 120 最小下降 (AU·分)53-4 21,9323,68 19,74 20,61 23,68 21,05 21,93 29,39 25,00 21,49 21,93 16,2316,23 6,58 155,253-7 26,7537,28 23,68 9,2113,16 12,28 25,88 15,79 10,97 8,7714,47 23,258,7723,25 -961,153-10 18,8618,86 17,11 21,93 20,61 18,42 17,11 17,98 27,63 21,93 23,2517,11 1,75 651,3
平均值
SD 3,989,55 3,316,995,414,504,397,309,929,624,30 4,05 4,5811,28 825,8 標準平均值 22,34 26,43 20,00 17,08 18,98 17,08 21,46 20,88 17,81 19,12 19,27 20,7317,08
表7血管內(nèi)給予叔丁基-Gly-Pro-Ile后Wistar大鼠的血漿DP IV活性
DP IV-
時間 AUCDP IV(mU/ml) -30 -5 0 2,5 5 7,510 15 20 40 60 120 顯小下降 (AU·分)53-4 19,3021,05 19,74 15,35 15,35 17,11 17,11 14,47 15,3514,91 15,79 17,1114,475,70 -452,953-7 24,1225,88 33,77 27,63 25,00 27,63 20,18 18,42 25,4423,68 22,37 25,8818,426,58 -1179,353-1017,1116,67 17,98 14,04 16,23 18,42 14,47 13,60 15,3515,35 13,60 15,3513,6032,9 -388,2
平均值
SD 3,59 4,618,657,505,345,74 2,852,57 5,82 4,944,57 5,64 2,57 1,70 439,3標準平均值 16,3517,37 20,00 15,18 15,03 17,22 13,42 11,67 14,8814,15 13,42 15,6111,67
表8顯示所選擇的Xaa-Pro-Yaa三肽在口服和血管內(nèi)給予Wistar大鼠后測試它們的DPIV和DPIV樣酶活性抑制能力的結(jié)果。表8結(jié)果-在將Xaa-Pro-Yaa三肽給予Wistar大鼠后tmax時的DPIV
抑制實施例4Xaa-Pro-Yaa三肽對糖尿病Zucker大鼠的葡萄糖耐量的影響研究設(shè)計動物
N＝30只平均11周齡(5-12周)，平均體重350g(150-400g)的雄性Zucker大鼠購自Charles River(Sulzfeld，Germany)。將它們飼養(yǎng)＞12周直至所有肥胖Zucker大鼠均具有明顯的糖尿病特征。飼養(yǎng)條件
在常規(guī)條件下，用受控的溫度(22±2℃)，以12/12小時光/暗循環(huán)(在06:00a.m.給光)單一籠養(yǎng)大鼠。允許其隨意獲取標準丸狀固體食物(ssnif Soest，Germany)和用HCl酸化的自來水。頸動脈表征
為進行測試，良好地準備適應(yīng)飼養(yǎng)條件的17-24周齡的肥胖Zucker大鼠。在常規(guī)麻醉(腹膜內(nèi)注射0.25ml/kg b.w.Rompun[20％]，BayerVital，Germany和0.5ml/kg b.w.Ketamin 10，Atarost GmbH&Co.，Twistringen，Germany)下將導(dǎo)管植入肥胖Zucker大鼠的頸動脈中。使動物恢復(fù)一周。每周用肝素-鹽水(100IU/ml)沖洗導(dǎo)管三次。
如果導(dǎo)管功能不良，則將第二根導(dǎo)管插入相應(yīng)的大鼠的對側(cè)頸動脈中。在外科手術(shù)恢復(fù)一周后，使動物再次用于研究。如果第二根導(dǎo)管功能不良，則將動物從研究中撤出。補充新的動物并以計劃的順序繼續(xù)試驗，所述試驗起始于導(dǎo)管植入后至少7天。實驗設(shè)計
以隨機的順序分別給予具有完整導(dǎo)管功能的肥胖Zucker大鼠安慰劑(1ml鹽水，0.154mol/l；N＝9只動物，作為對照)，一種均勻劑量的異亮氨酰噻唑烷*延胡索酸鹽(10mg/kg b.w.，溶于1ml鹽水；N＝6只動物)作為陽性對照，或100mg/kg b.w.溶于1ml鹽水的測試物質(zhì)(每測試組N＝6只動物)。
在過夜禁食后，在-10分鐘分別通過飼管(15G，75mm；FineScience Tools，Heidelberg，Germany)口服給予肥胖Zucker大鼠安慰劑、陽性對照和測試物質(zhì)。在±0分鐘用2g/kg b.w.葡萄糖以40％溶液(B.Braun Melsungen，Melsungen，Germany)進行口服葡萄糖耐量測試(OGTT)。通過第二根飼管給予葡萄糖。在-30分鐘、-15分鐘、0分鐘和5、10、15、20、30、40、60、90和120分鐘從頸動脈導(dǎo)管收集動脈血樣至20μl玻璃毛細管中，將毛細管置于填充有1ml用于溶血的溶液的標準管中(血糖測定)。
此外，在-30min，在20、40、60和120min從有知覺的不受限制的肥胖Zucker大鼠的頸動脈導(dǎo)管取動脈血樣，并將其置入填充有10μl檸檬酸鈉緩沖液(pH3.0)的冰冷的Eppendorf管(Eppendorf-Netheler-Hinz，Hamburg，Germany)以進行血漿DP活性測定。立即將Eppendorf管離心(12000rpm，持續(xù)2分鐘，HettichZentrifuge EBA 12，Tuttlingen；Germany)；在冰上保存血漿部分直至分析。分析方法血糖使用葡萄糖氧化酶法測定葡萄糖水平(Super GGlukosemeβgert；Dr.Müller Gertebau，F(xiàn)reital，Germany)。
幾種根據(jù)實施例4進行體內(nèi)試驗的三肽在口服給藥后在Zucker大鼠中顯著改善OGTT期間的葡萄糖耐量(參見表9和圖7與8)。表9結(jié)果一給予Xaa-Pro-Yaa三肽后在Zucker大鼠中OGTT期間葡
萄糖耐量的改善實施例5肽化合物與哺乳動物肽轉(zhuǎn)運蛋白的相互作用
為了分析脯氨酰特異性蛋白酶抑制劑與哺乳動物肽轉(zhuǎn)運蛋白的相互作用，使用兩種試驗系統(tǒng)。首先，用轉(zhuǎn)基因酵母細胞對所有測試化合物進行競爭試驗以確定來自底物結(jié)合部位的放射性標記的示蹤劑二肽的劑量依賴性置換(EC50值)。然后在表達哺乳動物肽轉(zhuǎn)運蛋白的非洲爪蟾(Xenopus)卵母細胞中對鑒定為具有良好親合力的化合物進行轉(zhuǎn)運電流的電生理學(xué)分析。由于功能表達水平隨卵母細胞而變，在相同的卵母細胞中比較每一種測試化合物和5mM二肽甘氨酰-L-谷氨酰胺(Gly-Gln)引起的電流。因此在表10中測試化合物的電流相對于由Gly-Gln導(dǎo)致的電流以％IGly-Gln給出，表示為殘基攝入。
表10結(jié)果-肽化合物與哺乳動物肽轉(zhuǎn)運蛋白的相互作用
雖然前述說明書以說明性實施例教導(dǎo)了本發(fā)明的本質(zhì)，但應(yīng)該理解，本發(fā)明的實施涵蓋本領(lǐng)域技術(shù)人員預(yù)期的所有常規(guī)改變、修改和/或修飾。
權(quán)利要求
1.由通式(I)代表的化合物
及其藥學(xué)可接受的鹽，其中
A為除D-氨基酸之外的任何氨基酸；
B為選自Pro、Ala、Ser、Gly、Hyp、氮雜環(huán)丁烷-(2)-羧酸和2-哌啶酸的氨基酸；
C為除Pro、Hyp、氮雜環(huán)丁烷-(2)-羧酸、2-哌啶酸和N-烷基化的氨基酸例如N-甲基纈氨酸和肌氨酸之外的任何氨基酸，
D為任何氨基酸或不存在，且
E為任何氨基酸或不存在，或者其中
C為除Pro、Hyp、氮雜環(huán)丁烷-(2)-羧酸、2-哌啶酸、N-烷基化的氨基酸例如N-甲基纈氨酸和肌氨酸、D-氨基酸之外的任何氨基酸；
D為選自Pro、Ala、Ser、Gly、Hyp、氮雜環(huán)丁烷-(2)-羧酸和2-哌啶酸的氨基酸，且
E為除Pro、Hyp、氮雜環(huán)丁烷-(2)-羧酸、2-哌啶酸、N-烷基化的氨基酸例如N-甲基纈氨酸和肌氨酸之外的任何氨基酸。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中
A為除D-氨基酸之外的任何氨基酸；
B為選自Pro、Ala、Ser、Gly、Hyp、氮雜環(huán)丁烷-(2)-羧酸和2-哌啶酸的氨基酸；
C為除Pro、Hyp、氮雜環(huán)丁烷-(2)-羧酸、2-哌啶酸和N-烷基化的氨基酸例如N-甲基纈氨酸和肌氨酸之外的任何氨基酸，
D為任何氨基酸或不存在，且
E為任何氨基酸或不存在。
3.權(quán)利要求1的化合物，其中
A為除D-氨基酸之外的任何氨基酸；
B為選自Pro、Ala、Ser、Gly、Hyp、氮雜環(huán)丁烷-(2)-羧酸和2-哌啶酸的氨基酸，
C為除Pro、Hyp、氮雜環(huán)丁烷-(2)-羧酸、2-哌啶酸、N-烷基化的氨基酸例如N-甲基纈氨酸和肌氨酸、D-氨基酸之外的任何氨基酸；
D為選自Pro、Ala、Ser、Gly、Hyp、氮雜環(huán)丁烷-(2)-羧酸和2-哌啶酸的氨基酸，且
E為除Pro、Hyp、氮雜環(huán)丁烷-(2)-羧酸、2-哌啶酸、N-烷基化的氨基酸例如N-甲基纈氨酸和肌氨酸之外的任何氨基酸。
4.前述權(quán)利要求之任一項的化合物，其中A為L-氨基酸。
5.前述權(quán)利要求之任一項的化合物，其中C為L-氨基酸。
6.前述權(quán)利要求之任一項的化合物，其中E不存在。
7.前述權(quán)利要求之任一項的化合物，其中D和E不存在。
8.前述權(quán)利要求之任一項的化合物，其中A為叔丁基-Gly、Ile或Val。
9.前述權(quán)利要求之任一項的化合物，其中B為Pro。
10.前述權(quán)利要求之任一項的化合物，其中C為叔丁基-Gly、Ile或Val。
11.前述權(quán)利要求之任一項的化合物，其中D為Pro、Ala、Ser、Giy、Hyp、氮雜環(huán)丁烷-(2)-羧酸或2-哌啶酸。
12.權(quán)利要求1的化合物，即叔丁基-Gly-Pro-Ile、叔丁基-Gly-Pro-Val、Val-Pro-叔丁基-Gly、Ile-Pro-叔丁基-Gly或叔丁基-Gly-Pro-叔丁基-Gly及它們的藥學(xué)可接受的鹽。
13.前述權(quán)利要求之任一項的化合物，其中化合物為游離酸肽形式或C-末端酰胺肽形式。
14.權(quán)利要求13的化合物，其中游離酸肽形式或C-末端酰胺肽形式通過選自以下的側(cè)鏈修飾而改變高絲氨酸加成、焦谷氨酸加成、二硫鍵形成、天冬酰胺或谷氨酰胺殘基脫酰胺、甲基化、叔丁基化、叔丁氧羰基化、4-甲基芐基化、硫代茴香基化、硫代羥甲苯基化、芐氧基甲基化、4-硝基苯基化、芐氧羰基化、2-硝基苯甲?；?、2-硝基亞磺?；?、4-甲苯磺酰化、五氟苯基化、二苯基甲基化、2-氯芐氧羰基化、2，4，5-三氯苯基化、2-溴芐氧羰基化、9-芴基甲氧羰基化、三苯基甲基化、2，2，5，7，8-五甲基苯并二氫吡喃-6-磺?；?、羥基化、甲硫氨酸氧化、甲?；⒁阴；?、茴香基化、芐基化、苯甲?；?、三氟乙酰化、天冬氨酸或谷氨酸羧化、磷?；?、硫酸化、半胱氨酰化、用戊糖、脫氧己糖、己糖胺、己糖或N-乙酰己糖胺糖基化、法呢基化、肉豆蔻酰化、生物素基化、棕櫚?；?、硬脂?；?、香葉基香葉基化、谷胱甘肽基化、5′-腺苷基化、ADP-核糖基化、用N-羥乙酰神經(jīng)氨酸、N-乙酰神經(jīng)氨酸、吡哆醛磷酸、硫辛酸、4′-磷酸泛酰巰基乙胺和N-羥基琥珀酰亞胺修飾。
15.前述權(quán)利要求之任一項的化合物的前藥。
16.包含至少一種權(quán)利要求1-15之任一項的化合物或前藥和藥學(xué)可接受的載體和/或稀釋劑的藥物組合物。
17.制備藥物組合物的方法，所述方法包括將至少一種權(quán)利要求1-15之任一項的化合物或前藥與藥學(xué)可接受的載體和/或稀釋劑混合。
18.根據(jù)前述權(quán)利要求1-15之任一項的化合物、前藥或組合物用于制備預(yù)防或治療由二肽基肽酶IV活性的調(diào)節(jié)介導(dǎo)的病癥的藥物的用途。
19.權(quán)利要求17的用途，其中病癥選自葡萄糖耐量低減、糖尿病、糖尿和代謝性酸中毒。
全文摘要
本發(fā)明涉及由通式(I)代表的化合物及其藥學(xué)可接受的鹽。所述化合物可以用于制備預(yù)防或治療由二肽基肽酶IV活性的調(diào)節(jié)介導(dǎo)的病癥的藥物，其中所述病癥優(yōu)選選自葡萄糖耐量低減、糖尿病、糖尿和代謝性酸中毒。
文檔編號A61P3/10GK1471538SQ0280224
公開日2004年1月28日 申請日期2002年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月27日
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