專利名稱：一種用于治療或預防纖維化疾病的含低劑量西羅莫司的藥物組合的制作方法
一種用于治療或預防纖維化疾病的含低劑量西羅莫司的藥物組合技術領域
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術領域。具體來講，本發(fā)明涉及用含有低劑量西羅莫司的藥物組合治療或預防肝臟和腎臟的纖維化障礙，硬化性疾病，和狼瘡疾病。更具體來講，本發(fā)明涉及控制單劑量給藥后的曲線下血藥濃度面積(AUCtlM ；或多次每日給藥AU(V24h)(約為1 到20納克/毫升*小時)，在保證藥物使用安全性的條件下達到治療和預防纖維化的目的。
背景技術：
纖維化是結締組織取代實質組織的病理過程，是由感染，自身免疫性疾病，化學物質侵害，或機械性損傷引起的不正常修復反應。
肝纖維化是一種由慢性肝損傷引起的疤痕反應，其起因包括乙型和丙型肝炎，過量飲酒，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，自身免疫疾病，遺傳異常，和鐵超載等等。肝纖維化影響全世界數(shù)千萬患者，最終導致肝硬化，肝功能衰竭，和患者死亡。目前的抗病毒和其他療法往往對纖維化的基礎治療無效，有許多副作用。從未來十年由于丙型肝炎(HCV)和非酒精性脂肪肝疾病的流行引起的肝硬化并發(fā)癥死亡人數(shù)預計將增加兩倍，而僅通過肝移植越來越不能滿足需求。
腎纖維化是由藥物中毒、高血壓、糖尿病、持續(xù)感冒、感染等致病因素引起的腎臟固有細胞的疤痕反應。細胞受到損傷后，會釋放一些細胞因子，如IL-I和腫瘤壞死因子 (TNFa)等。這些細胞因子會吸引血液中的一系列的炎癥細胞(如白細胞、淋巴細胞、血小板、單核一巨噬細胞等)向系膜區(qū)、血管區(qū)、腎間質區(qū)浸潤，并釋放一系列的炎性介質導致炎性反應，反過來促進腎臟固有細胞的表型轉化。在細胞因子與生長因子持續(xù)不停地刺激下，成纖維細胞呈現(xiàn)持續(xù)活化增殖狀態(tài)，并合成細胞外基質(ECM)成分(首先合成分泌纖維粘連蛋白，形成支架結構，然后繼續(xù)合成膠原I、III、IV、V成分)。腎臟同有細胞，如系膜細胞、腎小球上皮細胞、腎小管上皮細胞等都可轉化成肌成纖維細胞，形成疤痕。
迄今，病理學研究闡明了當肝臟受到損傷后的三種纖維化過程1)肝星狀細胞會被激活并向肝纖維母細胞轉化，這一過程可由血小板衍生生長因子(PDGF)和轉化生長因子β KTGF-β 1)介導。2)膽管上皮細胞和普通肝細胞也可轉化為具有細胞基質合成能力的肝纖維母細胞，這一過程又稱為上皮間質轉化。3)出現(xiàn)造成門纖維化的膽管反應。另外， 膽管上皮細胞可以表達PDGF和TGF-β 1，這些生長因子會促進肝星狀細胞分化和上皮間質轉化。腎纖維化也經(jīng)歷類似過程。
西羅莫司，又稱為雷帕霉素，是一種用于防止器官移植排斥反應的免疫抑制藥物。 目前國內外上市產(chǎn)品是由美國惠氏公司出品的斥消靈(Rapamime)，作為腎移植手術的免疫抑制藥物。西羅莫司是一種大環(huán)內酯，首次發(fā)現(xiàn)來源于復活節(jié)島的土壤樣品中的吸水鏈霉菌。西羅莫司最初是作為抗真菌劑。然而隨后的研究發(fā)現(xiàn)，它具有強大的免疫抑制及抗增殖特性。它后來又被證明可延長小鼠的生存并可能對某些癌癥起治療作用。
上市斥消靈有口服液和片劑兩種劑型。斥消靈口服液每毫升含1毫克西羅莫司，斥消靈口服液中的非活性成分是WioSal50PG(卵磷脂，丙二醇，單甘油酯，雙甘油酯，乙醇， 大豆脂肪酸，及維生素C)和聚山梨酯80。斥消靈口服液含有1.5%-2. 5%的乙醇。斥消靈口服液包裝在單劑量鋁復合袋或者為配有給藥注射器的琥珀色玻璃瓶。
斥消靈片劑分三種0. 5毫克西羅莫司棕褐色三角形片；1毫克西羅莫司白色三角狀片；2毫克西羅莫司黃色至淺褐色三角形片。斥消靈片的非活性成分包括蔗糖，乳糖， 聚乙二醇8000，硫酸鈣，微晶纖維素，醫(yī)藥釉，滑石粉，鈦白粉，硬脂酸鎂，聚維酮，泊洛沙姆 188，聚乙二醇20000，甘油單油酸酯，巴西棕櫚蠟和DL-阿爾法維生素E等成分。0. 5毫克和 2毫克片劑還含有黃色氧化鐵和褐色氧化鐵。斥消靈片劑包裝在聚氯乙烯/聚乙烯/Aclar/ 箔吸塑包裝片或者高密度聚乙烯瓶。發(fā)明內容
我們在研究中驚人的發(fā)現(xiàn)，含有低劑量西羅莫司的藥物組合能對上述三種肝纖維化過程均產(chǎn)生抑制作用，并不產(chǎn)生明顯的毒副作用。這種低劑量西羅莫司的藥物組合的特征是單次給藥后，經(jīng)過測定給藥個體全血中的西羅莫司，曲線下血藥濃度面積(AUCtl^ ；或多次每日給藥AU(V24h)約為1到20納克/毫升*小時。
本發(fā)明提供了低劑量西羅莫司的藥物組合用于治療和預防纖維化疾病
首先含有低劑量西羅莫司的藥物組合能在膽管結扎的大鼠試驗中有效的減少肝纖維化。其次，這一藥物組合能抑制肝星狀細胞增殖。再次，這一藥物組合能抑制上皮間質轉化過程。最后，這種藥物組合能抑制膽管反應。從動物試驗數(shù)據(jù)表明，肝星狀細胞對低濃度的西羅莫司非常敏感。其中西羅莫司對血小板衍生生長因子引發(fā)的肝星狀細胞增殖的抑制濃度在0.1納克/毫升。藥代動力學表明，給予含有低劑量西羅莫司的藥物組合(0. 1 毫克/公斤/天)，經(jīng)過測定給藥個體全血中的西羅莫司，曲線下血藥濃度面積(單次給藥 AUC0…；或多次每日給藥AUCQ_24h)為3.42士0. 27納克/毫升*小時。
本發(fā)明還提供了
1根據(jù)上述的曲線下血藥濃度面積要求制備的口服制劑，含有西羅莫司作為有效活性成分，其特征在于含有維生素E聚乙二醇琥珀酸脂和其他輔料成分。維生素E聚乙二醇琥珀酸脂作為抗氧化劑和乳化劑，可以用以增加西羅莫司的水溶解度，并可以提供抗纖維化的協(xié)同作用。
2根據(jù)上述的曲線下血藥濃度面積要求制備的透皮貼片制劑，含有西羅莫司作為有效活性成分，其特征在于含有聚異丁烯和聚酯纖維。
3根據(jù)上述的曲線下血藥濃度面積要求制備的透皮油膏制劑，含有西羅莫司作為有效活性成分，其特征在于含有凡士林和重礦物質油。
4根據(jù)上述的曲線下血藥濃度面積要求制備的透皮油膏制劑，含有西羅莫司作為有效活性成分，其特征在于含有用于溶解西羅莫司的生理鹽水。
本發(fā)明還提供了
5與應用權利要求書中提到的低劑量西羅莫司的藥物組合相關的聯(lián)合用藥方法。 這些聯(lián)合用藥方法可能比單一用藥方法在治療纖維化疾病方面更有優(yōu)勢。
6在上述5提及的聯(lián)合用藥方法中，除使用含有低劑量西羅莫司的藥物制劑，其他的抗纖維化藥物可以是腎素-血管緊張素系統(tǒng)抑制劑，例如貝那普利，卡托普利，福辛普利，賴諾普利，雷米普利；血管緊張素受體拮抗劑，例如洛沙坦，坎地沙坦，依普羅沙坦 ’腎素抑制劑，例如阿利吉侖。
7在上述5提及的聯(lián)合用藥方法中，除使用含有低劑量西羅莫司的藥物制劑，其他的抗纖維化藥物可以是降膽固醇藥物，例如阿托伐他汀，辛伐他汀，西立伐他汀等；
8在上述5提及的聯(lián)合用藥方法中，除使用含有低劑量西羅莫司的藥物制劑，其他的抗纖維化藥物可以是血小板源性生長因子拮抗藥物，例如抗血小板源性生長抗體，PDGF 受體酪氨酸激酶抑制劑，例如伊馬替尼，舒尼替尼；
9在上述5提及的聯(lián)合用藥方法中，除使用含有低劑量西羅莫司的藥物制劑，其他的抗纖維化藥物可以是成纖維細胞生長因子(FGF)拮抗劑，例如抗成纖維細胞生長因子抗體；
10在上述5提及的聯(lián)合用藥方法中，除使用含有低劑量西羅莫司的藥物制劑，其他的抗纖維化藥物可以是S_腺苷蛋氨酸；
本發(fā)明所帶來的有益效果是，本發(fā)明涉及用含有低劑量西羅莫司的藥物組合治療或預防肝臟和腎臟的纖維化障礙，硬化性疾病，和狼瘡疾病。在保證藥物使用安全性的條件下達到治療和預防纖維化的目的。
實施例1
西羅莫司口服液劑型篩選主要考慮到非水溶劑的載體可避免許多固態(tài)劑型的問題，諸如多晶性，顆粒大小，表面積及內在溶出速率。維生素E聚乙二醇琥珀酸脂作為抗氧化劑和乳化劑。WioSal50PG是主要輔料以提高西羅莫司的溶解度。聚山梨酯80是表面活性劑，助于提高水溶性。由于西羅莫司自身具有抗微生物和抗真菌作用，防腐劑在劑型中是不必要的。
所需設備(5公斤批量生產(chǎn)規(guī)模)7. 5升夾套不銹鋼反應釜；數(shù)控攪拌器，螺旋槳式；均質機；容積式泵；冷水機組；5升儲罐；聚乙烯管材；100目過濾系統(tǒng)。
生產(chǎn)工藝及步驟如下
反應釜溫度40°C
攪拌速度140rpm-170rpm
氮氣保護
1.攪拌下加料2公斤Phosal 50PG
2.攪拌下加料40克聚山梨酯80
3.攪拌下加料40克維生素E聚乙二醇琥珀酸脂，提高攪拌速度為170rpm以保證維生素E聚乙二醇琥珀酸脂全部溶解，繼續(xù)攪拌30分鐘
4.攪拌下加料0. 4克西羅莫司，確定西羅莫司全部溶解，繼續(xù)攪拌15分鐘
5.降低攪拌速度為140rpm，攪拌下加料2公斤Wiosal 50PG
6.反應完畢后，將反應液冷卻降溫至2_8°C。
7.將反應液轉移至儲罐中，等待分裝。儲罐需有氮氣保護，并保溫于2_8°C。
8.分裝過程必須在M小時之內進行。
設備清洗使用蒸餾水和異丙醇。清洗驗證方法使用Texwipe擦拭材料，分析方法為高效液相色譜法。
實施例2:
西羅莫司透皮貼片劑主要的輔料是聚異丁烯和聚酯纖維支持層和離型膜。由于西羅莫司自身具有抗微生物和抗真菌作用，防腐劑在劑型中是不必要的。
具體生產(chǎn)工藝及步驟如下
攪拌器溫度25°C
攪拌速度300rpm
1.先加1公斤聚異丁烯
2. 300rpm攪拌下加料0. 4克西羅莫司，并攪拌均勻
3.然后將溶藥的聚異丁烯加載到聚酯纖維支持層，大約是Ig聚異丁烯附著到一平方厘米的支持層
4.置入40°C烘箱知道去除殘余溶劑
5.在黏合劑的一面加上離型膜
6.將貼片切割到20平方厘米并密封在塑料袋中
實施例3
西羅莫司油膏劑主要的輔料是凡士林和重礦物質油。由于西羅莫司自身具有抗微生物和抗真菌作用，防腐劑在劑型中是不必要的。
具體生產(chǎn)工藝及步驟如下
攪拌器溫度25°C
攪拌速度200rpm 至 300rpm
1.先加1公斤凡士林
2. 200rpm攪拌下加料0. 080克西羅莫司
3.加料10毫升重礦物質油，300rpm繼續(xù)攪拌60分鐘
4.封裝在塑料或金屬的軟管中
實施例4:
西羅莫司靜脈注射液每250毫升含400微克(microgram)西羅莫司，非活性成分是生理鹽水。西羅莫司靜脈注射液是透明液體，包裝在靜脈注射用的透明塑料袋中。各項藥品規(guī)格包括藥品效價，雜質，含量均勻性，藥物穩(wěn)定性，酸堿度，粘度，比重，顏色等均達到設定指標。輔料兼容性和包裝材料的兼容性也已進行研究。
由于西羅莫司的水溶性很低，僅為2. 6微克/毫升，所以需要一定量的水作為溶劑。250毫升是可以足夠溶解400微克的西羅莫司。
具體生產(chǎn)工藝及步驟如下
1.準備25升的生理鹽水；
2.攪拌下加料40毫克西羅莫司，提高攪拌速度為170rpm以保證西羅莫司全部溶解，繼續(xù)攪拌15分鐘；
3.停止攪拌后，封裝在250毫升的注射用塑料袋中。
實施例5
實驗材料和方法
(1)動物
正常雄性Wistar大鼠，同時用于肝星狀細胞分離050-550克)和纖維化誘導 (214-320克)。大鼠經(jīng)過12小時的光/暗周期并喂標準的大鼠飲食和無菌水。
(2)肝纖維化的誘導及處理方案
對20只大鼠進行一般膽管結扎。結扎手術同一天，按0. 1毫克/公斤/天經(jīng)灌胃給予10只大鼠以實施例1方法制備的西羅莫司(0. 08到0. 10毫克/毫升)，另外10只大鼠給予溶媒對照共21天。此外，還對10動物進行假手術。在21天結束時，處死大鼠，收集肝臟作進一步分析。
(3)血液生化
肝功能檢查中對血清中的膽紅素，谷丙轉氨酶和伽馬谷氨酰轉移酶水平進行了評估。
(4)肝細胞分離和培養(yǎng)
在Optift·印(11.5%，Sigma-Aldrich公司)中對肝星狀細胞采用密度梯度離心分離。然后在未涂膜的組織培養(yǎng)塑料板上，以Dulbecco改良的fegle培養(yǎng)基(Gibco ^witrogen公司)，加10%小牛血清，glutamax，和1 %青霉素/鏈霉素培養(yǎng)肝星狀細胞。細胞經(jīng)西羅莫司，血小板衍生生長因子，或溶媒(二甲基亞砜)處理。增殖實驗根據(jù)制造商(Promega公司，麥迪遜，威斯康星州)的說明用CellTiter96細胞增殖單一解決方案檢測。
在肝臟，肝臟祖細胞同時是膽管和再生肝細胞的來源(雙位勢)，也是膽管反應的一個重要組成部分。雙位勢的橢圓形小鼠肝酪氨酸轉氨酶(BMOL-TAT)和雙位勢鼠標胚胎肝酪氨酸轉氨酶(BMEL-TAT)細胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)(羅斯威爾公園紀念研究所1640培養(yǎng)基，含10%小牛血清，glutamax，青霉素/鏈霉素，1微克/毫升fungizone，30納克 /毫升胰島素樣生長因子II，50納克/毫升表皮生長因子，和10微克/毫升胰島素；Gibco ^witrogen公司)。細胞經(jīng)西羅莫司或溶媒(二甲基亞砜)處理。增殖實驗方法如前面所述。
(5)藥代動力學分析
實驗大鼠在每天灌胃給與實施例1方法制備的西羅莫司(0. 10毫克/公斤/天) 后第10天取血樣分析(給藥后第1，2，4，8，10，對小時)。全血濃度在這些時間點均可被 LC-MS/MS測定，包括給藥后M小時。Cmax的平均值(士標準差)為0. 380士0. 028納克/ 毫升，在給藥后1小時出現(xiàn)。相對應的AUCchm數(shù)值為3. 42士0.27納克/毫升*小時。
(6)組織學評價
石蠟包埋肝切片在蘇木精和伊紅染色和天狼猩紅染色后用來量化纖維化，炎癥， 和膽管反應。由病理學家以雙盲方式對人肝臟進行半定量評分。
(7)統(tǒng)計分析
所有實驗結果經(jīng)過一次，兩次，或三次重復實驗測定(肝星狀細胞和肝臟祖細胞試驗)，或多樣本實驗(膽管結扎大鼠實驗)。統(tǒng)計學意義用t檢驗代表，并且P值小于0. 05 被認為具有顯著統(tǒng)計學意義。結果以均值士標準差表示。
結果
我們的目標是探索低劑量西羅莫司通過多個途徑在膽總管結扎肝模型中的抗纖維化作用。大鼠肝臟/體重重量比和肝功能測試結果列于表1。正如所料，膽管結扎大鼠的肝臟/體重重量比比較假手術組大鼠有顯著升高，而西羅莫司治療可以顯著抑制這種肝臟 /體重重量比增加(62%，P = 0. 006 ；表1)。膽管結扎大鼠比較假手術動物表現(xiàn)出顯著性增高的血清膽紅素水平(P = 0. 0017，表1)，這證實了完好的結扎過程，而西羅莫司顯著地降低了血清膽紅素濃度(P = 0. 07，表1)。谷氨酰轉移酶和丙氨酸轉氨酶水平也符合結扎誘導的肝損傷狀態(tài)，而西羅莫司治療可改善肝功能(表1)。
表1.假手術，膽管結扎溶媒，和膽管結扎西羅莫司治療組肝功指標(雄性Wistar大鼠)
權利要求
1.一種用于治療或預防纖維化疾病的含低劑量西羅莫司的藥物組合，其特征在于可以提供低濃度的西羅莫司進入血液循環(huán)系統(tǒng)，以至于單次給藥后，經(jīng)過測定給藥個體全血中的西羅莫司，曲線下血藥濃度面積(AUCchcJ約為1到20納克/毫升每小時，用于治療或預防纖維化疾病。
2.權利要求1中的一種用于治療或預防纖維化疾病的含低劑量西羅莫司的藥物組合， 其特征在于可以用于治療或預防肝臟或腎臟的纖維化，硬化，或狼瘡類疾病。
3.權利要求1中的一種用于治療或預防纖維化疾病的含低劑量西羅莫司的藥物組合， 其特征在于可以用于抑制肝星狀細胞的激活和向肌纖維母細胞的轉化，抑制上皮細胞向間質細胞轉化，或抑制膽管反應。
4.權利要求1中的一種用于治療或預防纖維化疾病的含低劑量西羅莫司的藥物組合， 其特征在于它是口服制劑，包括溶液劑，片劑和膠囊等。
5.權利要求1中的一種用于治療或預防纖維化疾病的含低劑量西羅莫司的藥物組合， 其特征在于它是透皮制劑，包括透皮貼劑和油膏劑等。
6.權利要求1中的一種用于治療或預防纖維化疾病的含低劑量西羅莫司的藥物組合， 其特征在于它是注射劑，包括水針劑和凍干粉針等。
7.權利要求4中的藥物制劑，其特征在于它是溶液劑，含有0.01毫克/毫升至0. 20毫克/毫升的西羅莫司。
8.權利要求5中的藥物制劑，其特征在于它是透皮貼劑，含有0.002毫克/平方厘米至0. 04毫克/平方厘米的西羅莫司，或油膏劑，含有0. 01毫克/克至0. 20毫克/克的西羅莫司。
9.權利要求6中的藥物制劑，其特征在于它是注射劑，含有西羅莫司0.1毫克/升至2毫克/升。
10.權利要求1中的一種用于治療或預防纖維化疾病的含低劑量西羅莫司的藥物組合，其特征在于與其他抗纖維化藥物聯(lián)合用于纖維化疾病的治療和預防。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于治療或預防纖維化疾病的含低劑量西羅莫司的藥物組合。具體來講，這種藥物組合可以用于治療或預防肝臟或腎臟的纖維化，硬化，或狼瘡類疾病，其特征是可以提供低濃度的西羅莫司進入血液循環(huán)系統(tǒng)，以致于單次給藥后，經(jīng)過測定給藥個體全血中的西羅莫司，曲線下血藥濃度面積(AUC0-∝)約為1到20納克/毫升每小時。這種含低劑量西羅莫司的藥物組合可以在明顯抑制和減緩纖維化過程的同時，不產(chǎn)生明顯的毒副作用。這種藥物組合的制劑包括口服制劑，透皮制劑和注射劑。
文檔編號A61K31/436GK102499919SQ20111031879
公開日2012年6月20日 申請日期2011年10月13日 優(yōu)先權日2011年10月13日
發(fā)明者張恒志, 惠峪, 袁旭東 申請人:嘉興富特吉生物科技有限公司