專利名稱：新的合成肽，含有該肽的肺表面活化劑以及治療呼吸窘迫綜合癥的藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的合成肽。更具體地說，本發(fā)明涉及通過與一種類脂混合物復(fù)合而顯示有潛在表面活性作用的合成肽。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)所述合成肽的中間體，生產(chǎn)這種合成肽的方法，含有該肽和一種類脂混合物的肺表面活化劑以及含有所述肺表面活化劑作為活性成分的用于治療呼吸窘迫綜合癥的藥物。
背景技術(shù)：
呼吸窘迫綜合癥是一種由于失去了肺表面活化劑而使肺泡表面的表面活性降低的疾病。這種疾病導(dǎo)致肺泡萎陷，繼而導(dǎo)致嚴(yán)重的呼吸紊亂。這種綜合癥經(jīng)常見于發(fā)育不全的新生嬰兒并且出現(xiàn)較高的致死率。已知肺表面活化劑組合物十分有效地抵抗新生兒呼吸窘迫綜合癥。
由各種原因引起的血氧過少也可使成年人受折磨，并且用胸腔X-射線照相術(shù)在兩葉肺中看到類似擴(kuò)散性簇鏡片的陰影(diffuse ground-glass-like shadow)的許多例子以及盡管用呼吸器等控制呼吸仍呼吸衰竭。Ueda和其同事(在Hiromoto Yasuda，“Biosurfactants.Chapter 3.Medical Practices Using Surfactants.Section 1.Clinical Application of Surfactants.V.Aspiration Pneumonia and Surfactants.″P.184，1990，Science Forum，Co.Ltd)已經(jīng)報(bào)道兩種成人肺炎病例(即下列病例①硝酸鹽氣體吸入性肺炎和②源于腦瘤的復(fù)發(fā)性吸入性肺炎，這種肺炎引起血氧過少并且導(dǎo)致正常狀態(tài)變壞和呼吸衰竭)，對于這兩種病例，通過向呼吸道注射肺表面活化劑而獲得顯著改善和挽救生命。在心臟手術(shù)之后由于手術(shù)期間呼吸停止而可能出現(xiàn)手術(shù)后呼吸衰竭。還已經(jīng)有人報(bào)道肺表面活化劑對這種呼吸衰竭的作用(Shuichi Nosaka et al，Journal of Japanese MedicalSociety for Biological Interface，Vol.22，P.66，1991)。
因此從體外和借助于呼吸道施用肺表面活化劑的替代治療法顯示對呼吸窘迫綜合癥有顯著的治療效果。
最近，發(fā)現(xiàn)4種類型的脫輔基蛋白質(zhì)是極好的哺乳動物的肺表面活化劑。它們是親水性的表面活化劑脫輔基蛋白質(zhì)A和表面活化劑脫輔基蛋白質(zhì)D，以及疏水性的表面活化劑脫輔基蛋白質(zhì)B(下文將稱為SP-B)以及表面活化劑脫輔基蛋白質(zhì)C(下文中將稱為SP-C)(Toyoaki Akino和YoshioKuroki，Respiration and Circulation，Vol.38，No.18.P.722，1990；Hiromoto Yasuda et al，BiosurfactantsChapter 2.Ihe Biochemistry of Surfactants-Surfactants and Apoproteins，P.131，1990，Science Forum，Co.Ltd.)。
來源于人肺的SP-C(序列號.1)由35個(gè)氨基酸組成，并且是富含纈氨酸的高度疏水脫輔基蛋白質(zhì)，它有作為N-末端氨基酸的苯丙氨酸。分離自牛肺(序列號.2)，豬肺(序列號.3)，大鼠肺等的SP-C也由34-35個(gè)氨基酸組成并且雖然不同種之間N-末端氨基酸序列不同，但他們與人SP-C顯示有非常高的同源性。
日本專利申請No.Hei-3-502095還指出具有作為SP-C結(jié)構(gòu)一部分的下述的32氨基酸序列的合成肽(序列號.4)是顯示高效表面活性的基本單位，還指明該肽和類脂的混合物可有效地治療呼吸窘迫綜合癥，并且將該基本單位肽的表面活性和其他具有更短的氨基酸序列的合成肽的表面活性進(jìn)行比較顯示表面活性的喪失不是由于特定氨基酸的喪失引起的而是肽鏈長度降低的緣故。
以前，本發(fā)明的一部分發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)由一種合成肽(下文中稱作為TP-C)，其結(jié)構(gòu)是作為SP-C結(jié)構(gòu)一部分，以及一種類脂構(gòu)成的混合物可有效地治療呼吸窘迫綜合癥，并且已經(jīng)有關(guān)這個(gè)主題申請了一份專利(日本專利申請No.Hei-5-518188)。
就合成肽的生產(chǎn)而言，總的來說，隨著肽的氨基酸序列延長在生產(chǎn)期間形成有缺陷肽的頻率升高，分離和純化變得困難，生產(chǎn)需要的時(shí)間增加，大批量地生產(chǎn)也變得困難等等。
從保持優(yōu)良特性考慮，也經(jīng)?？芍苽涓煞劢M合物形式的肺表面活化劑組合物，在使用時(shí)將干粉組合物制作為生理鹽水懸液給藥。已經(jīng)有人建議例如加入類似甘露醇的懸浮劑(日本專利公開No.Hei-1-60451)并且在-1至-10℃的原始凍干的方法可以改善肺表面活化劑的懸浮特性。但是，在實(shí)際操作中這些方法較復(fù)雜因此需要研制生產(chǎn)藥劑的更簡單方法。
通過將SP-C與一種類脂混合物(由膽堿磷酸甘油酯，一種酸性磷脂以及一種脂肪酸類似物組成)復(fù)合而制備的肺表面活化劑組合物(下文中稱作為S-35)在生理鹽水中具有十分低的可分散性，要將其制備成一種足夠均勻而可用作組合物的懸浮液是十分困難的，其原因包括在肽中由半胱氨酸殘基形成二硫橋鍵，從而使肽具高度內(nèi)聚性和肺表面活化劑本身高度疏水性。
由于TP-C在一般性溶劑中溶解性較低，利用三氟乙酸(TFA)制備肺表面活化劑組合物是必要的。因此TP-C具有這樣的問題，例如為除去盡可能多的TFA需要更多的濃縮和干燥時(shí)間，并且由于在肺表面活化劑組合物制備期間殘留有TFA使肺表面活化劑懸浮液變得酸化。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明人考慮到上述因素勤勉地研究合成肽并且已經(jīng)達(dá)到了發(fā)明目的，即新的合成肽含有在N-末端具有親水肽部分的特定序列以及在C-末端具主要由Leu和/或NIe組成的疏水性肽部分的下文中所述的氨基酸序列，該新合成肽易于分離和純化，可以大批量地生產(chǎn)，在甲酸，TFA，三氟乙醇，二甲基亞砜(DMSO)，氯仿，氯仿-甲醇混合物，甲醇，2-氯乙醇和四氫呋喃中溶解性大，特別是與合成SP-C和TP-C相比，新合成肽具顯著高的溶解性。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)當(dāng)于-20℃或更低采用普通凍干方法進(jìn)行生產(chǎn)并且沒有添加懸浮劑時(shí)，從本發(fā)明的合成肽和類脂混合物制備的肺表面活化劑與S-35相比或與僅由一種類脂混合物(由膽堿磷酸甘油酯，酸性磷脂以及脂肪酸類似物組成)組成的合成肺表面活化劑(下文中稱作為“SF-3””，日本專利申請No.H-2-87685)相比或與含有結(jié)合有脂肪酸的一種由磷脂、中性類脂、總膽固醇、碳水化合物以及哺乳動物肺中存在的微量蛋白質(zhì)組成的物質(zhì)的一種物質(zhì)(下文中稱為“S-TA”；日本專利申請Sho-61-9924)相比具有很均勻的懸浮特性，并且這種肺表面活化劑還顯示有相當(dāng)于S-35，S-TA或由TP-C和類脂混合物組成的肺表面活化劑的強(qiáng)表面活性。
Xaa-Pro-Val-Xbb-Xcc-Lys-Arg-W(Xaa可能不存在或者可能代表Cys或Ser，Xbb代表His或Asn，Xcc代表Leu或Ile并且W代表疏水部分)。
本發(fā)明合成肽含有由下文中特定序列的N-末端描述的親水肽部分以及具有主要由C-末端的Leu和/或Nle組成的疏水肽部分的一段肽組分，并且該本發(fā)明所述合成肽是當(dāng)與一種類脂混合物復(fù)合時(shí)顯示有強(qiáng)表面活性的合成肽。
Xaa-Pro-Val-Xbb-Xcc-Lys-Arg(Xaa可以不存在或者可以代表Cys或Ser，Xbb代表His或Asn以及Xcc代表Leu或Ile)。
盡管疏水肽部分是由如Leu，Nle，Ile，Val，Phe，Nva和Trp這樣的疏水氨基酸組成的，但其主要是由12或更多以及優(yōu)選的是12-20個(gè)Leu和/或Nle的分子組成。雖然從合成方便來考慮優(yōu)選的是該疏水肽部分是由相同疏水氨基酸組成，但它也可以由Leu和Nle分子的合成序列組成或者在其序列內(nèi)含有1-5個(gè)分子的Ile，Val，Nva，Trp和其它疏水氨基酸。
本發(fā)明的合成肽還包括在上面介紹的合成肽的N-末端和/或C-末端增加了氨基酸或肽的合成肽。被加到N-末端的氨基酸可能是Cys或者Ser。此外，可將具有Phe-Gly-Ile-Pro序列的肽加到N-末端。借助于一個(gè)具14-18個(gè)碳原子的脂肪酸并且優(yōu)選的是棕櫚酸可將上文介紹的合成肽中存在的巰基或羥基?；蛘呖梢砸阴０坊谆?。加到C-末端的肽可以具有Gly-Ala-Leu-Leu或者Gly-Ala-Leu-Leu-Met-Gly-Leu序列。
此外，本發(fā)明的合成肽還包括含有肽基團(tuán)的合成肽(除具有天然SP-C部分結(jié)構(gòu)的肽外)，所述肽基團(tuán)當(dāng)與類脂混合物復(fù)合時(shí)顯示出良好親水性以及強(qiáng)大的表面活性，甚至于在其含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸增加、除去和替代后也具有這種特性。
本發(fā)明的合成肽可以采用化學(xué)或遺傳工程方法生產(chǎn)，但是就分離和純化而言優(yōu)選的是化學(xué)方法。
生產(chǎn)本發(fā)明合成肽的化學(xué)方法包括逐步延伸方法和片段縮合方法，涉及液相或固相合成方法如疊氨化物方法，酸性氯化物方法，酸酐方法，混合的酸酐方法，DCC方法，活化的酯方法(對-硝基苯酯方法，對-羥基琥珀酰亞胺酯方法，碳咪唑方法等)，氧化還原方法以及DCC-活化方法。
本發(fā)明還提供用于生產(chǎn)本發(fā)明合成肽的片段縮合方法，該方法中以具有被保護(hù)的N-末端和被保護(hù)的功能側(cè)鏈的親水肽基團(tuán)作為生產(chǎn)的中間產(chǎn)物。
與逐步延伸方法相比，片段縮合方法提供了易于純化的目的物質(zhì)，更適于大量合成并且具有阻止由于不期望出現(xiàn)的錯(cuò)誤而喪失的特性。通過采用液相或固相合成方法將疏水部分與具有被保護(hù)的N-末端和被保護(hù)的功能側(cè)鏈的前面制備的親水肽進(jìn)行縮合可以生產(chǎn)本發(fā)明的合成肽。N-末端以及功能性側(cè)鏈的保護(hù)性基團(tuán)沒有特別規(guī)定，只要是常規(guī)的肽合成方法中使用的保護(hù)性基團(tuán)?？捎?-芴基甲氧基羰基(Fmoc)，2-氯苯氧基羰基(2-CLZ)或者t-丁氧羰基(Boc)基團(tuán)作為末端氨基酸基團(tuán)的保護(hù)性基團(tuán)，可將Fmoc，Boc或者芐氧羰基(Z)或者對甲苯碳酰(Tos)基團(tuán)用作為Lys的保護(hù)性基團(tuán)，可將Trt，F(xiàn)moc，Boc，Dnp，Bom，Bzl或者Tos用作為His和Mtr的保護(hù)性基團(tuán)，以Pmc，Mts或者Tos作為Arg的保護(hù)性基團(tuán)。因此，可用作為生產(chǎn)本發(fā)明合成肽的中間產(chǎn)物的肽包括Fmoc-Pro-Val-His(Trt)-Leu-Lys(Boc)-Arg(Mtr)，F(xiàn)moc-Pro-Val-Asn-Leu(Boc)-Arg(Mtr)和Fmoc-Pro-Val-Asn-Ile-Lys(Boc)-Arg(Mtr)。
通過將本發(fā)明的合成肽與由膽堿磷酸甘油酯，酸性磷脂和一種脂肪酸類似物組成的類脂混合物進(jìn)行復(fù)合而生產(chǎn)肺表面活化劑(下文中稱作為“本發(fā)明表面活化劑”)。
適當(dāng)?shù)匾?guī)定組合物中每種組分所占比例，以便相對最終產(chǎn)物的總干重量而言每種組分的重量比為合成肽占0.1-5.0％(w/w)，膽堿磷酸甘油酯為50.6-80.5％(w/w)，酸性磷脂比例為4.5-37.6％(w/w)以及脂肪酸類似物占4.6-24.6％(w/w)。
適用于本發(fā)明的表面活化劑的膽堿磷酸甘油酯的例子包括1，2-二?；视?(3)-磷酸膽堿如1，2-二棕櫚酰甘油-(3)-磷酸膽堿(二棕櫚酰磷脂酰膽堿)，1，2-二硬脂酰甘油-(3)-磷酸膽堿，1-棕櫚酰-2-硬脂酰甘油-(3)-磷酸膽堿和1-硬脂酰-2-棕櫚酰甘油-(3)-磷酸膽堿等等；1-烷基-2-?；视?(3)-磷酸膽堿如1-十六烷基-2-棕櫚酰甘油(3)-磷酸膽堿和1-十八烷基-2-棕櫚酰甘油-(3)-磷酸膽堿等；以及1，2-二烷基甘油-(3)-磷酸膽堿例如1，2-二-十六烷基甘油-(3)-磷酸膽堿等等。雖然對于上述化合物存在基于甘油殘基的第二位碳原子的光學(xué)異構(gòu)體，但是對于本發(fā)明的表面活化劑可以使用D-，L-和DL-形式任一種。除了上面提到的單個(gè)膽堿磷酸甘油酯化合物以外，可以將由兩個(gè)或多個(gè)帶有酰基基團(tuán)，優(yōu)選的是兩個(gè)飽和的酰基基團(tuán)的含12-24個(gè)碳原子的不同1，2-二?；视?(3)磷酸膽堿組成的混合物或者這種混合物與上面介紹的單個(gè)化合物組成的混合物用作為膽堿磷酸甘油酯。
合適的酸性磷脂的例子包括1，2-二?；?sn-甘油-(3)-磷酸(L-α-磷脂酸)，1，2-二?；?sn-甘油-(3)-磷酸-L-絲氨酸(磷脂酰絲氨酸)，1，2-二?；?sn-甘油-(3)-磷酸-sn-甘油(磷脂酰甘油)以及1，2-二?；?sn-甘油-(3)-磷酸-(1)-L-myo-肌醇(磷脂酰肌醇)。這些化合物的第一和第二位可以采用相同的酰基基團(tuán)或者采用不同?；鶊F(tuán)替代。這里，具有12-24個(gè)碳原子的酰基基團(tuán)是優(yōu)選的。
合適的脂肪酸類似物的例子包括游離脂肪酸，脂肪酸的堿金屬鹽，脂肪酸烷基酯，脂肪酸甘油酯和脂酰胺以及由上述二種或多種類似物組成的混合物和脂肪醇以及脂肪胺。
在本發(fā)明說明書中，“脂肪酸類似物”包括上面介紹的脂肪醇和脂族胺。
可用肉豆蔻酸，棕櫚酸或硬脂酸作為游離脂肪酸，但是棕櫚酸是優(yōu)選的。
可以用上面介紹的游離脂肪酸的鈉鹽，鉀鹽，鎂鹽和鈣鹽作為脂肪酸的堿金屬鹽，但是棕櫚酸鈉是優(yōu)選的。可用具1-4個(gè)碳原子的低級烷基酯作為脂肪酸烷基酯，但棕櫚酸乙酯是優(yōu)選的。甘油一酯可用作為脂肪酸甘油酯，但是，單棕櫚酸甘油酯是優(yōu)選的。
具有14-18個(gè)碳原子的醇可用作為脂肪醇，但是十六烷醇是優(yōu)選的。具有14-18個(gè)碳原子的胺可用作為脂族胺，但是十六烷胺是優(yōu)選的。
上文中介紹的膽堿磷酸甘油酯，酸性磷脂以及脂肪酸類似物可以是從植物或動物中分離到的產(chǎn)物，也可使用半合成產(chǎn)物或合成的化學(xué)產(chǎn)品和可購買到的這樣的產(chǎn)品。
通過在減壓下干燥和固化由本發(fā)明的肽溶液和上面介紹的類脂混合物的混合物并將由此獲得的殘留物懸浮于合適的懸浮液體中然后凍干可生產(chǎn)本發(fā)明的表面活化劑。
可用于制備本發(fā)明的肽溶液的溶劑的例子包括甲酸，TFA，三氟乙醇，DMSO，氯仿-甲醇，氯仿，甲醇，2-氯乙醇和四氫呋喃。
可用于制備類脂混合物溶液的溶劑的例子包括氯仿和氯仿-甲醇[1∶2-5∶1(V/V)]。
懸浮液例子包括水和水-乙醇混合物[4∶1-20∶1(V/V)]，但是水-乙醇混合物是優(yōu)選的。懸浮步驟執(zhí)行5-60分鐘并且優(yōu)選的是在30-60℃，并且優(yōu)選的是在40-50℃執(zhí)行15-30分鐘。
采用這種方法制備的本發(fā)明的表面活化劑不可避免地含有小量的殘留水。但是，優(yōu)選的是將表面活化劑干燥至相對于總重量而言殘留水的重量比是5.0％(w/w)或更低。如果將表面活化劑干燥到該含量，即使使用水-乙醇混合物的情況下也不能檢測到乙醇?xì)埩粑铩?br> 利用用手振蕩或變速混合器或超聲波發(fā)生裝置可將本發(fā)明的表面活化劑的干粉組合物均勻懸浮和分散于具有合適生理濃度的單價(jià)或二價(jià)金屬鹽，例如0.9％NaCl或1.5mM CaCl2的溶液或者含有所述鹽的生理緩沖溶液中。
現(xiàn)在將描述由此產(chǎn)生的本發(fā)明表面活化劑的表面活性，懸浮特性和藥物特性。
(1)表面活性①降低表面張力的作用根據(jù)Tanaka等人采用的方法(Journal of Japanese Medical Society for Biological Interface，Vol.13，No.2，P.87，1982)測定降低表面張力的作用。
將本發(fā)明的表面活化劑的懸浮液滴加到生理鹽水(表面積為54.0cm2)中，從而每cm2中含有本發(fā)明表面活化劑為1.0-2.0μg。在2-5分鐘內(nèi)將所說表面積壓縮和擴(kuò)大到54.0-21.6cm2范圍內(nèi)，并且用Wilhelmy的表面天平(由Kyowa Interface Science Co.Ltd.制造)在37℃連續(xù)地檢測表面張力。最大表面張力是24.7-34.1達(dá)因/cm以及最小表面張力是0.2-8.7達(dá)因/cm，表明本發(fā)明表面活化劑的降低表面張力的作用使生理鹽水的表面張力降低。
采用相同方法檢測SF-3的表面張力降低作用，結(jié)果產(chǎn)生最大表面張力為26.8-50.3達(dá)因/cm以及最小表面張力為1.0-13.5達(dá)因/cm。
在37℃時(shí)生理鹽水本身的表面張力是70.5達(dá)因/cm。
②在氣-液界面間的可擴(kuò)散性將本發(fā)明的表面活化劑的懸浮液滴加到生理鹽水的表面，使每cm2的生理鹽水表面有0.8-1.5μg的表面活化劑，采用垂直平板方法從滴加懸浮液后時(shí)間點(diǎn)立即開始檢測表面張力隨時(shí)間的變化。檢測溫度是37℃。
達(dá)到平衡與時(shí)間相關(guān)，即表面張力從滴加樣品之后即時(shí)開始到達(dá)到固定值花費(fèi)的時(shí)間，該時(shí)間之后的值稱為平衡表面張力。
本發(fā)明表面活化劑在30-60秒短時(shí)間內(nèi)在氣-液界面形成一薄層并且將表面張力降低到26.7-34.3達(dá)因/cm。
采用相同方法檢測SF-3的氣-液界面擴(kuò)散作用，結(jié)果顯示120秒之后表面張力是38.1-52.9達(dá)因/cm。
該結(jié)果表明本發(fā)明的表面活化劑迅速地?cái)U(kuò)散在氣-液界面并且快速降低表面張力。
③吸附到氣-液界面的能力制備在37℃時(shí)每ml含有0.2-1.0mg本發(fā)明表面活化劑的生理鹽水懸浮液，并檢測被懸浮的本發(fā)明的表面活化劑吸附到生理鹽水氣-液界面的速率。
根據(jù)King等人的方法(American Journal of Physiology，No.223，P.715，1972)檢測吸附能力。
就是說，將該懸浮液注射到含有生理鹽水的直徑為5cm的特富龍罐的底部，然后用磁攪拌器進(jìn)行攪拌。根據(jù)停止攪拌之后表面張力的變異測定吸附能力。
在停止攪拌之后30到100秒內(nèi)本發(fā)明表面活化劑將表面張力降至28.3至36.8達(dá)因/cm之間，此后表面張力保持不變。
這一結(jié)果表明在懸浮條件下本發(fā)明的表面活化劑在30到100秒的時(shí)間內(nèi)漂浮并吸附到氣-液界面并形成具有強(qiáng)大表面活性的一薄層。
當(dāng)以相同方式檢測SF-3時(shí)，結(jié)果表明在150秒或更多的時(shí)間內(nèi)恒量的表面張力達(dá)到42.2-58.3達(dá)因/cm。
這一結(jié)果表明SF-3的氣-液界面吸附作用低于本發(fā)明的表面活化劑，并且本發(fā)明的表面活化劑具有強(qiáng)有力的促進(jìn)表面吸附的能力。
(2)懸浮能力按照在日本實(shí)用新型公開號Hei-4-76965中指出的方法對肺表面活化劑的懸浮能力進(jìn)行檢測。
就是說，根據(jù)開始懸浮操作以后特定時(shí)間點(diǎn)的分散效率以及根據(jù)開始懸浮操作以后2分鐘最大分散顆粒大小來評估懸浮能力。
分散效率檢測按如下方法進(jìn)行，將60mg的每一種肺表面活化劑分散到20ml的各個(gè)小試管中。然后向所述的每個(gè)小試管中加入2ml的生理鹽水并將試管置于I waki KM Shaker-V-S型振蕩器(由I waki Sangyo Co.Ltd制造)中，以270次/分鐘的速率進(jìn)行振蕩。在振蕩起始之后開頭的2分鐘期間每隔30秒，在振蕩起始之后2分鐘到4分鐘內(nèi)每隔1分鐘以及在振蕩起始之后4分鐘之后每隔10分鐘用磁玻璃肉眼觀察每個(gè)樣品的分散狀態(tài)。
在各個(gè)特定的時(shí)間由二人，每人各評價(jià)10個(gè)樣品對懸浮狀況進(jìn)行評價(jià)。如果在容器內(nèi)沒有小團(tuán)塊以及該組合物均勻地分散于生理鹽水中而形成一種白色一致的懸浮液，則判定樣品是懸浮的。
由每人在各個(gè)特定的時(shí)間點(diǎn)檢測分散效率即完全懸浮的樣品占樣品總數(shù)(10bials)的百分?jǐn)?shù)，結(jié)果以兩人測得的平均值表示。
按如下方法對最大分散顆粒直徑進(jìn)行測量。將每種肺表面活化劑各60mg分散于20ml的試管中。然后向每個(gè)試管中加入20ml的生理鹽水并在上面介紹的相同條件下連續(xù)振蕩2分鐘。然后用顯微鏡尋找懸浮液中最大顆粒，并用游標(biāo)測徑器測量而確定其直徑。由此發(fā)現(xiàn)在2分鐘內(nèi)本發(fā)明的表面活化劑大多數(shù)被懸浮，并且它的最大顆粒直徑是0.8mm或更低，表明其懸浮能力是好的。
(3)藥理特性①急性毒性利用5周齡的ICR雄鼠和Wister大鼠對本發(fā)明的表面活化劑的急性毒性進(jìn)行檢測。對于雄鼠口服LD50和腹膜LD50分別為2.4-10.0克/千克和1.0-5.0克/千克，而對于大鼠分別為1.5-5.0克/千克以及1.5-2.5克/千克。
②亞急性毒性以每天300-600mg/kg的劑量將本發(fā)明的表面活化劑給成年Wister大鼠腹膜注射1個(gè)月。大鼠的重量沒有變化，用裸眼觀察組織學(xué)分析沒有看到異常。
③維持肺泡體積的作用末成熟的兔胎兒在妊娠期27天時(shí)幾乎沒有產(chǎn)生肺表面活化劑并處于肺表面活化劑缺乏條件下。因此可將其用作為研究新生兒呼吸窘迫綜合癥動物模型。
利用5只妊娠期27天的兔胎兒，于37℃不同的氣道壓力下檢測肺泡空間體積(下文中稱為肺體積)。
在通過呼吸道供給本發(fā)明肺表面活化劑5分鐘后切開胎兒的頸并用附在氣管上的水測壓計(jì)進(jìn)行連續(xù)檢測。用由2個(gè)獨(dú)立通道啟動的注射泵No.940(泵由Harvard Co.，USA制造)將氣道壓力提高到30cm H2O以便擴(kuò)張肺泡。然后在以不同水壓條件下測量肺體積時(shí)將氣道壓力降到0cm H2O以便使肺泡衰退。然后以每1kg體重的ml(ml/kg)數(shù)表示肺體積。
本發(fā)明的表面活化劑可通過將表面活化劑濃度為1.0-6.0％(w/v)的0.05-0.5ml生理鹽水懸浮液直接注射到呼吸道中而完成給藥。
在壓力降到5cm H2O時(shí)肺體積表示殘留的功能能力并且該體積越大，肺表面活化劑的活性越大。
作為對照，用生理鹽水替代本發(fā)明表面活化劑來給藥。對照組不成熟兔胎兒的肺體積(在5cm水時(shí))是1-5ml/kg，表明肺泡幾乎沒有被擴(kuò)張。
妊娠30天的足月的胎兒具有正常的肺表面活化劑含量。它們的肺體積(在5cm水)是35-53ml/kg，表明肺泡被適量地?cái)U(kuò)張并可執(zhí)行正常呼吸。
在以SF-3給藥時(shí)，未成熟胎兒的肺體積(在5cm H2O)是15-25ml/kg，表明肺泡擴(kuò)張不足。
如果以本發(fā)明的表面活化劑給藥，則肺體積(在5cm H2O)是39-55ml/kg，表明本發(fā)明的表面活化劑將末成熟胎兒的肺體積改善到正常水平。
如上所述，本發(fā)明的合成肽具有強(qiáng)有力地提高類脂混合物的表面活性的作用。因此，制備用于呼吸窘迫綜合癥的治療劑是可行的，所述治療劑具有來自本發(fā)明的表面活化劑的表面活性，懸浮能力以及藥學(xué)特性，所述表面活化劑可由本發(fā)明的合成肽和一種類脂混合物組成。
還可用含有本發(fā)明表面活化劑作為活性成分的組合物治療肺表面活化劑對其有治療效果的其他疾病，包括手術(shù)后呼吸紊亂，哮喘，支氣管炎，新生兒壞死腸炎，胃和十二指腸潰瘍，由病毒和管道障礙引起的呼吸病和可用于防止輸卵管粘連以及手術(shù)后器官粘連并作為祛痰劑。
由本發(fā)明提供的用于呼吸窘迫綜合癥治療的治療劑在兒童使用時(shí)每劑量含有50-1000mg本發(fā)明的表面活化劑而在成人使用時(shí)每劑量含有500-5000mg的本發(fā)明的表面活化劑。通過以1.0-10.0％(w/v)的濃度懸浮于水，生理鹽水或生理上可接受的緩沖液等中可制備這些劑量。然后將治療劑在出現(xiàn)呼吸紊亂之后72小時(shí)內(nèi)通過分1-10次注射或噴霧劑呼吸道內(nèi)而給藥。也可以通過吸方法使用該組合物，換句話說作為粉劑使用沒有懸浮。使用的劑量，方法和頻率適當(dāng)?shù)馗鶕?jù)患者癥狀和重復(fù)治療次數(shù)而改變。
如果需要，本發(fā)明的治療劑可含有類似于穩(wěn)定劑，防腐劑，等離子劑，緩沖劑，懸浮劑，抗氧化劑和表面活化劑這樣的藥物輔劑或者類似的氣管擴(kuò)張劑、抗過敏劑、治癌劑、抗病毒劑、抗炎劑和抗真菌劑的藥物。
所述劑型可適當(dāng)?shù)刂瞥梢后w或粉末形式?？蓪⒈景l(fā)明的治療劑裝填于密封容器如試管和安瓿管以及以無菌組合物狀態(tài)保存。實(shí)現(xiàn)發(fā)明的最好方式參照下列實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。
(1)肽的生產(chǎn)在下文描述的實(shí)施例中，用快速原子轟擊質(zhì)譜法(FABMS)測量合成肽的分子量。所使用的質(zhì)量分析儀是JMS--S102A(JEOL.Ltd.)以及以銫槍(10KeeV)作為離子源。實(shí)施例1按照“The Peptides″(GrossE.和Meinenhofe J.eds.，Barney G.和Merrifield R.authors，Vol.2，pp.1-284，Academic Press，New York，1980)描述的方法采用固相合成法在苯乙酰胺甲基(PAM)樹脂表面合成以序列No.5表示的肽(肽A)。
將C-末端亮氨酸殘基轉(zhuǎn)化為t-丁氧羰基-亮氨酸(Boc-Leu)并借助于一個(gè)羥甲基苯乙酰胺甲基鍵結(jié)合到PAM樹脂上。在鍵合到C-末端之后，將Boc-Leu-PAM樹脂(0.7mol/g，0.35g)轉(zhuǎn)移到肽合成儀(Model 990E，Beckman Instruments，Inc.)的反應(yīng)容器內(nèi)。然后采用對稱酸酐方法在樹脂的表面以N-末端方向加上已經(jīng)過保護(hù)性處理的氨基酸，以便合成得到充分保護(hù)的肽-O-樹脂。但是，在縮合精氨酸時(shí)，利用N，N-二環(huán)己基碳化二亞胺/羥基苯并三唑完成雙偶合(Connie等人，Chem.Ber.，103，788-798(1970)。
所有氨基酸的N-末端氨基用Boc基團(tuán)保護(hù)，并在反應(yīng)中使用氨基酸之前用下列基團(tuán)保護(hù)功能性側(cè)鏈Arg-Tos(甲苯磺?；?
Lys-2CLZ(2-氯苯氧羰基)Cys-4Me Bzl(4-甲基苯基)His-Tos(甲苯磺酰基)采用茚三酮方法kaiser檢測方法證實(shí)這些縮合反應(yīng)。在二氯甲烷中使得到充分保護(hù)的肽-O-樹脂(155mg)吸脹5分鐘。然后用含有1％(V/V)吲哚和0.1％(v/v)乙烷二硫醇的TFA除去N-α-Boc保護(hù)性基團(tuán)。接著，通過在0℃用無水氟化氫(HF)(11ml)將脫保護(hù)的肽-O-樹脂處理60分鐘而從樹脂上將肽切下，所述氟化氫中加入了p-甲酚(1ml)，p-巰基甲酚(0.2克)和DMSO(1ml)。
在0℃真空條件下蒸餾HF和DMSO。用冷二乙醚(15ml)將移走的肽和樹脂洗滌三次，通過在冷TFA(5ml)中洗四次而提取移走的肽。將提取液立即過濾并加入冰冷水(150ml)以沉淀粗制肽。然后以1000xg及0℃將該粗制肽離心30分鐘，并回收沉淀。用二乙醚(15ml)洗滌該沉淀。用二乙醚，乙酸乙酯和蒸餾水重復(fù)洗滌處理之后得到84mg肽A。
將該粗制肽溶于50％DMSO水溶液中并采用反相高效液相層析(HPLC)方法以及利用μ-Bondasphere和一個(gè)C8-300柱進(jìn)行純化以收集純肽A。
利用含0.1％TFA的50％乙腈水溶液作為洗脫劑進(jìn)行5分鐘的洗脫。利用上面提及的洗脫劑和含0.1％TFA的80％乙腈水溶液形成的線性濃度梯度洗脫30分鐘。在245nm(分光光度計(jì)，日本Spectroscopic Co.Ltd.Model870-UV)以及示差折光計(jì)(Shimadzu制造公司RID-6A型)監(jiān)測洗脫液中存在的肽。
FABMS(M+H+)；3837.1(計(jì)算出的分子量；3835.9)實(shí)施例2采用固相方法以及利用多肽固相合成系統(tǒng)“Kokku-San”(商品名；Kokusan Chemical works Co.Ltd)，并且參照由E.Atherton和R.C.Sheppard在“Solid Phase Peptide Syntyesis-A Practical Approach”中(pp.25-189，牛津大學(xué)出版社，牛津)以及由Kenichi Akagi等人(Chem.Pharm.Bull.，37(10)PP.2661-2664，1989)說明的方法合成序列No.6的肽(肽B)。
以N-α-9-芴基甲氧羰基-亮氨酸-O-樹脂(Fmoc-Leu-O-樹脂)(0.20mmol/0.5克)(其中N-α-9-芴基甲氧羰基-亮氨酸(Fmoc-Leu)鍵合到4-(羥甲基)苯氧甲基-共聚物(苯乙烯1％二乙烯苯)樹脂上)用作為起始樹脂。用N，N-二甲基甲胺(DMF)吸脹該樹脂20分鐘，然后用DMF洗4次。然后加入溶于DMF中的20％哌啶，并振蕩該混合物以除去保護(hù)基。該操作重復(fù)三次，以徹底去除保護(hù)基團(tuán)。接著用DMF洗三次，用N-甲基-2-吡咯烷酮洗三次，再用DMF洗三次，以去除樹脂中過量的哌啶。在此時(shí)用pH試紙檢測哌啶的存在。
然后加入DMF(6ml)，F(xiàn)moc-Leu(0.5mmol)，N-羥苯并三唑(0.5mmol)以及N，N′-二異丙基碳化二亞胺(0.5mmol)，將混合物振蕩90分鐘以完成縮合反應(yīng)。然后用DMF將樹脂洗四次以去除過量的試劑。用茚三酮方法kaiser檢測法檢測該縮合反應(yīng)。
由此進(jìn)行合成計(jì)劃并在樹脂表面，從N-末端方向逐步增加氨基酸，從而形成了具有完全被保護(hù)的N-末端和功能基團(tuán)的肽-O-樹脂。
用于導(dǎo)入Arg，Lys，His，Pro和Cys的縮合反應(yīng)共進(jìn)行二次，每次120分鐘。
此后，將溶于DMF中的20％哌啶加入到被保護(hù)的肽-O-樹脂以便去除N-末端的Fmoc保護(hù)基團(tuán)。然后用DMF和甲醇將該肽-O-樹脂各洗六次，并在減壓條件下干燥。然后向干燥的肽-O-樹脂(100mg)中邊攪拌邊冷卻地加入m-甲酚(0.2ml)，1，2-乙烷二巰基(0.5ml)，苯硫基甲烷(1.2ml)，TFA(7.5ml)和三甲基甲硅烷基溴化物(1.4ml)。隨后在冰冷下將該混合物攪拌120分鐘，從而從功能側(cè)鏈上除去保護(hù)性基團(tuán)以及從樹脂上去除肽，然后用一玻璃濾器(G3)過濾。在減壓條件下用一蒸發(fā)器將濾液濃縮到大約5ml。然后加入二乙醚以使肽沉淀。用一個(gè)玻璃濾器(G3)收集肽沉淀，用二乙醚洗五次并在減壓條件下干燥，獲得了60mg肽B。
在將氨基酸用于反應(yīng)之前所有氨基酸的N-端氨基用Fmoc基團(tuán)進(jìn)行保護(hù)，功能側(cè)鏈用下列基團(tuán)保護(hù)Arg-Mtr(4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺?；?Lys-Boc(t-丁氧基羰基)Cys-Trt(三苯甲基)His-Trt(三苯甲基)將約100mg的粗制肽溶于TFA(1ml)中，加入四倍于該量的溶于TFA-二氯乙烷(5∶95，v/v)中的流動相溶劑即10mMβ-巰基乙醇從而制備20mg/ml樣品溶液，利用AsahipakGS-510(φ7.5×500mm)柱(商品名；Asahi化學(xué)工業(yè)有限公司)以HPLC方法對該溶液進(jìn)行純化，從而收集純肽B。
將溶于TFA-二氯乙烷(5∶95，v/v)中的10mMβ-巰基乙醇用作為洗脫劑并以0.8ml/分的速度洗脫80分鐘。在245nm(分光光度計(jì)；日本Spectroscopic有限公司，870-UV型)并且用一示差折光計(jì)(Shimadzu公司RID-6A型)監(jiān)測洗脫液中存在的肽。
FABMS(M+H+)；3017.9(計(jì)算得到的分子量；3016.9)實(shí)施例3以與實(shí)施例2相同的方式制備序列No.7的肽(肽C)。
FABMS(M+H+)；3116.0(計(jì)算得的分子量；3115.1)。實(shí)施例4以與實(shí)施例2相同的方式制備序列No.8的肽(肽D)。
FABMS(M+H+)；2663.7(計(jì)算得的分子量；2662.5)。實(shí)施例5以與實(shí)施例2相同的方式制備序列No.9的肽(肽F)。
FABMS(M+H+)；2211.2(計(jì)算得的分子量；2209.9)。實(shí)施例6以與實(shí)施例2相同的方式制備序列No.10的肽(肽F)。
FABMS(M+H+)；2647.5(計(jì)算得的分子量；2646.4)。實(shí)施例7以與實(shí)施例2相同的方式制備序列No.11的肽(肽G)。
FABMS(M+H+)；3018.1(計(jì)算得的分子量；3016.9)。實(shí)施例8以與實(shí)施例2相同的方式利用固相多肽合成系統(tǒng)以固相合成方法合成具有序列No.12的肽(肽H)。
以N-α-9-芴基甲氧羰基-正亮氨酸-O-樹脂(Fmoc-Nle-O-樹脂)(0.20mmol/0.5g)樹脂作為起始樹脂。將該樹脂吸脹DMF20分鐘，然后用DMF洗四次。然后加入溶于DMF中的20％哌啶，振蕩該混合物以去除保護(hù)基團(tuán)。將該操作重復(fù)三次以徹底去除保護(hù)基團(tuán)。接著用DMF洗9次以去除樹脂中過量的哌啶。在此時(shí)利用pH試紙檢測殘留哌啶的存在。
然后加入DMF(6ml)，F(xiàn)moc-Nle(0.5mmol)，N-羥苯并三唑(0.5mmol)和N，N′-二異丙基碳化二亞胺(0.5mmol)并將混合物搖蕩90分鐘以完成縮合反應(yīng)。然后用DMF將樹脂洗滌四次，以去除過量試劑。用茚三酮方法kaiser檢測法檢測該縮合反應(yīng)。
由此執(zhí)行合成計(jì)劃并在樹脂表面于N-末端方向逐步加入氨基酸，從而形成了其N-末端和功能基團(tuán)得到充分保護(hù)的肽-O-樹脂。
對于導(dǎo)入Arg，Lys，His，Pro和Cys的縮合反應(yīng)進(jìn)行兩次，每次120分鐘。
此后，將溶于DMF中的20％吡啶加到受保護(hù)的肽-O-樹脂中以便去除N-末端的Fmoc保護(hù)性基團(tuán)。然后用DMF將肽-O-樹脂洗六次，用甲醇洗六次并在減壓條件下進(jìn)行干燥。然后邊攪拌邊在冰上冷卻而邊向干燥的肽-O-樹脂(100mg)中加入m-甲酚(0.2ml)，1，2-乙烷二硫醇(0.5ml)，苯硫基甲烷(1.2ml)，TFA(7.5ml)和三甲基甲硅烷基溴化物(1.4ml)。然后邊用冰冷卻邊將該混合物振蕩120分鐘從而從功能性側(cè)鏈上去除保護(hù)基團(tuán)，以及從樹脂去除肽，然后用玻璃濾器(G3)進(jìn)行過濾。用一個(gè)蒸發(fā)器將濾液在減壓條件下濃縮至約5ml。然后加入二乙醚以沉淀該肽。用一玻璃濾器(G3)收集該肽沉淀，用二乙醚洗5次，在減壓條件下進(jìn)行干燥，獲得了65mg肽H。
將所有氨基酸的N-端氨基用Fmoc基團(tuán)保護(hù)并且功能側(cè)鏈用下列基團(tuán)保護(hù)，然后將氨基酸用于反應(yīng)中Arg-Mtr(4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺?；?Lys-Boc(正-丁氧羰基)Cys-Trt(三苯甲基)His-Boc(正-丁氧羰基)將約10mg的肽溶于3.0ml的氯仿-甲醇(C/M)2∶1(v/v)的混合溶劑中。然后用Sephadex LH-60柱(φ2.5cm×90cm)純化樣品，從而收集肽H，所述柱用C/M混合溶劑2∶1(V/V)平衡。
在245nm(分光光度計(jì)；日本Spectroscopic有限公司，870-UV型)并用示差折光計(jì)(Shimadzu公司RID-6A型)對洗脫液中存在的肽進(jìn)行監(jiān)測。
FABMS(M+H+)；2663.6(計(jì)算得的分子量；2662.5)。實(shí)施例9以與實(shí)施例8相同的方式制備序列No.13的肽(肽I)。
FABMS(M+H+)；2560.4(計(jì)算得的分子量；2559.3)。實(shí)施例10以與實(shí)施例8相同的方式制備序列No.14的肽(肽J)。
FABMS(M+H+)；2663.8(計(jì)算得的分子量；2662.5)。實(shí)施例11以與實(shí)施例2相同的方式制備序列No.15的肽(肽K)。
FABMS(M+H+)；2663.5(計(jì)算得的分子量；2662.5)。實(shí)施例12以與實(shí)施例2相同的方式制備序列No.16的肽(肽L)。
FABMS(M+H+)；2503.6(計(jì)算得的分子量；2502.4)。實(shí)施例13以與實(shí)施例2相同的方式制備序列No.17的肽(肽M)。
FABMS(M+H+)；2736.7(計(jì)算得的分子量；2735.5)。實(shí)施例14以與實(shí)施例2相同的方式制備序列No.18的肽(肽N)。
FABMS(M+H+)；2640.4(計(jì)算得的分子量；2639.4)。實(shí)施例15以與實(shí)施例8相同的方式制備序列No.19的肽(肽O)。
FABMS(M+H+)；2640.3(計(jì)算得的分子量；2639.4)。實(shí)施例16Fmoc-Pro-Val-His(Trt)-Leu-Lys(Boc)-Arg(Mtr)利用肽合成儀系統(tǒng)9050(MilliporeCorp.)以固相方法合成主題肽(肽P)。
以N-α-9-芴基甲基羰基-N-ω-4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺?；?精氨酸-O-樹脂(Fmoc-Arg(Mtr)-O-樹脂)(0.20mmol)(其中N-α-9-芴基甲基羰基-N-ω-4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺?；?精氨酸(Fmoc-Arg(Mtr))鍵合到2-甲氧基-4-烷氧基芐基醇-樹脂(Sasrin樹脂，Bachem Co.，Ltd的商品名))用作為起始樹脂，按照肽合成儀系統(tǒng)9050的合成方案在樹脂表面以N-末端方向依次添加氨基酸從而合成N-末端和功能基團(tuán)被完全保護(hù)的肽-O-樹脂。
然后用甲醇將被充分保護(hù)的肽-O-樹脂洗滌五次，并在減壓條件下干燥。然后邊攪拌邊用冰冷卻向干燥的肽-O-樹脂(330mg)中加入TFA-二氯甲烷溶液(1∶99，V/V)。然后邊用冰冷卻邊將混合物振蕩30分鐘，然后在室溫下振蕩90分鐘從而從樹脂上去除仍附有保護(hù)基團(tuán)的肽。然后用玻璃濾器(G3)過濾該混合物，用一個(gè)蒸發(fā)器在減壓條件下將濾液濃縮至約5ml。然后加入二乙醚以使肽沉淀。用玻璃濾器(G3)收集該肽沉淀，然后用二乙醚洗五次，并在減壓條件下干燥，于是獲得了180mg的肽P。
在將氨基酸用于反應(yīng)之前，將所有氨基酸的N-末端氨基用Fmoc基保護(hù)并且功能側(cè)鏈用下列基團(tuán)保護(hù)Arg-Mtr(4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基)Lys-Boc(正丁氧羰基)His-Trt(三苯甲基)然后向該粗制肽中加入TFA-二氯甲烷(1∶99，V/V)溶液從而制備10mg/ml樣品溶液，將該溶液用Asahipak GS-510(φ21.5×500mm)柱(商品名；Asahi化學(xué)工業(yè)有限公司)以HPLC進(jìn)行純化從而收集到純化肽P。
以TFA-二氯甲烷(1∶99，V/V)溶液作為洗脫劑，并以8.1ml/分的流速洗脫120分鐘。在245nm(分光光度計(jì)；Japan Spectroscopic Co.Ltd.870-UV型)以及用示差折光計(jì)(Shimadzu公司RID-6A型)監(jiān)測洗脫液中存在的肽。
FABMS(M+H+)；1405.0(計(jì)算的分子量；1403.8)。實(shí)施例17
按照實(shí)施例8的方法采用固相多肽合成系統(tǒng)合成H-Nle-(Nle)14-Nle-O-樹脂。
接著，在將DMF加入到合成的H-Nle-(Nle)14-Nle-O-樹脂中之后，加入肽P以替代Fmoc-Arg(Mtr)。加入N-羥基苯并三唑以及N，N′-二異丙基碳化二亞胺，然后將混合物振蕩8小時(shí)。將該縮合反應(yīng)進(jìn)行二次。用茚三酮方法kaiser檢測法檢測縮合反應(yīng)。
此后，根據(jù)實(shí)施例8的方法，去除功能基團(tuán)的保護(hù)基，從樹脂上去除肽并用HPLC進(jìn)行純化以制備具有序列No.13的肽(肽I)。
FABMS(M+H+)；2560.2(計(jì)算的分子量；2559.3)。實(shí)施例18按類似于實(shí)施例4的方式制備具有乙酰胺基甲基化(acetoamidomethylated，ACM)形式的肽D的巰基的肽(肽Q)，不同的是利用Fmoc-Cys(Acm)替代Fmoc-Cys(Trt)。
FABMS(M+H+)；2734.7(計(jì)算的分子量；2733.6)。實(shí)施例19根據(jù)Sarin，Virender和Kumar的方法(EP0458167A1)用棕櫚酸將肽E的巰基酯化而制備肽R。
FABMS(M+H+)；2448.5(計(jì)算的分子量；2448.3)。比較實(shí)施例1按類似于實(shí)施例2的方式制備具序列No.20的肽(肽S)。
FABMS(M+H+)；2793.8(計(jì)算的分子量；2792.6)。比較實(shí)施例2按類似于實(shí)施例2的方式制備具序列No.21的肽(肽T)。
FABMS(M+H+)；3018.3(計(jì)算的分子量；3016.9)。
對本發(fā)明合成肽的氨基酸組分的分析在150℃，真空條件下用含5％(w/v)苯酚的12N HCl-TFA溶液[2∶1(V/V)]將本發(fā)明合成肽酸水解1，2，4，6，12，24，48和72小時(shí)，在去除酸之后，用Shimadzu自動氨基酸分析系統(tǒng)(LC-9A)分析水解產(chǎn)物。
用4.2N NaOH水溶液將肽M的Trp堿水解16，24和32小時(shí)，然后用HCl中和，然后用氨基酸分析系統(tǒng)分析。從在1-72小時(shí)的水解過程表示更高回收率的氨基酸的值計(jì)算到的氨基酸組成成分表明該值基本上與從化學(xué)公式計(jì)算出的值相匹配。
結(jié)果顯示于表1。
表1本發(fā)明的合成肽的氨基酸組成<

>(除肽N和O是將Asx含量設(shè)為1.0而計(jì)算其它氨基酸值外，其它肽均以His含量設(shè)為1.0而計(jì)算。)
(2)本發(fā)明表面活化劑的制備通過將本發(fā)明的肽與膽堿磷酸甘油酯，酸性磷脂和脂肪酸類似物三種類脂成分混合而制備本發(fā)明的表面活化劑。實(shí)施例20在室溫下將無菌的1，2-二棕櫚酰甘油-(3)-磷酸膽堿(1350mg)，1，2-二酰基-sn-甘油-(3)-磷酸-sn-甘油(具有14-24個(gè)碳的?；鶊F(tuán)；由Sigma化學(xué)有限公司制造)(450mg)和肉豆蔻酸(200mg)溶于氯仿-甲醇混合物[2∶1(V/V)](1000ml)以及將25mg的肽A溶于TFA(1.0ml)中。將這些溶液混合在一起，然后在減壓條件下干燥和固化。在40℃將得到的殘留物懸浮于水-乙醇混合物[9∶1(V/V)](1000ml)15分鐘。在-50℃將該懸浮液進(jìn)行冷凍，然后在85-100μHg真空中干燥36小時(shí)，獲得白色粉末的表面活化劑(2070mg)。
在該粉末中沒有可檢測量的乙醇，相對于表面活化劑的總量而言各種成分的含量分別是1，2-二棕櫚酰甘油-(3)-磷酸膽堿為65.2％(W/W)，1，2-二?；?sn-甘油-(3)-磷酸-sn甘油為21.7％(W/W)，肉豆蔻酸為9.7％(W/W)，肽A為1.2％(W/W)以及水占2.2％(W/W)。實(shí)施例21
將1，2-二棕櫚酰甘油-(3)-磷酸膽堿(300.0mg)，1，2-二酰基-sn-甘油-(3)-磷酸-sn-甘油(具14-24碳原子的?；挥蒘gma化學(xué)有限公司制造)(100.0mg)以及棕櫚酸(40.0mg)溶于氯仿-甲醇混合物[2∶1(V/V)](300ml)，將10.0mg肽B溶于氯仿-甲醇混合物[2∶1(V/V)](2.0ml)。將這些溶液混合在一起，然后在減壓條件下干燥和固化。在45℃將獲得的殘留物于水-乙醇混合物[9∶1(V/V)](100ml)中懸浮20分鐘。將懸浮液在-60℃冷凍并在60-110μHg的真空器中干燥40小時(shí)，獲得459.1mg的白色粉末狀表面活化劑。
在該粉末中沒有可檢測量的乙醇，相對于表面活化劑總重量而言各種成分的含量分別是1，2-二棕櫚酰甘油-(3)-磷酸膽堿為65.3％(W/W)，1，2-二?；?sn-甘油-(3)-磷酸-sn-甘油為21.8％(W/W)，棕櫚酸為8.7％W/W)，肽B為2.2％(W/W)以及水為2.0％(W/W)。實(shí)施例22將1，2-二棕櫚酰甘油-(3)-磷酸膽堿(280.0mg)，1，2-二月桂酰-sn-甘油-(3)-磷酸-sn-甘油(120.0mg)以及棕櫚酸(27.0mg)溶于氯仿-甲醇混合物[2∶1(V/V)](150ml)以及將2.8mg肽C溶于氯仿-甲醇混合物[1∶2(V/V)](0.5ml)。將這些溶液混合在一起，然后在減壓條件下干燥和固化。在40℃將獲得的殘留物于水-乙醇混合物[8∶2(V/V)](100ml)中懸浮45分鐘。在-65℃將該懸浮液冷凍并用真空器50-80μHg干燥36小時(shí)，獲得了437.6mg的白色粉末狀表面活化劑。
在該粉末中沒有可檢測量的乙醇，相對于表面活化劑總重量而言各種成分的含量分別是1，2-二棕櫚酰甘油-(3)-磷酸膽堿為64.0％(W/W)，1，2-二月桂酰-sn-甘油-(3)-磷酸-sn-甘油為27.4％(W/W)，棕櫚酸為6.2％(W/W)，肽C為0.6％(W/W)以及水為1.8％(W/W)。實(shí)施例23除了以肽D代替肽B以及用1-棕櫚酰-2-油酰-sn-甘油替代1，2-二酰基-sn-甘油(3)-磷酸-sn-甘油(具有14-24碳原子的?；鶊F(tuán)；由Sigma化學(xué)有限公司制造)以外，完成類似于實(shí)施例21的操作，產(chǎn)生了451.9mg的白色表面活化劑粉末。
在該粉末中沒有可檢測量的乙醇，相對于表面活化劑總重量而言各種成分的含量分別是1，2-二棕櫚酰甘油-(3)-磷酸膽堿為66.4％，1-棕櫚酰-2-油酰-sn-甘油-(3)-磷酸-sn-甘同22.1％(W/W)，棕櫚酸為8.9％(W/W)，肽D為2.2％(W/W)以及水為0.4％(W/W)。實(shí)施例24
將1，2-二棕櫚酰甘油-(3)-磷酸膽堿(320.0mg)，1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-(3)-磷酸-sn-甘油(80.0mg)以及棕櫚酸(60.0mg)溶于氯仿-甲醇混合物[1∶1(V/V)](200ml)以及將肽E(14.0mg)溶于TFA(0.3ml)中。將這些溶液混合在一起，然后在減壓條件下干燥和固化。在45℃將獲得的殘留物于水-乙醇混合物[10∶1(V/V)](50ml)中懸浮60分鐘。在-45℃將該懸浮液冷凍并用50-110μHg的真空器干燥24小時(shí)，獲得479.2mg的白色粉末狀表面活化劑。
在該粉末中沒有可檢測量的乙醇，相對于表面活化劑總重量而言各種成分的含量分別是1，2-二棕櫚酰甘油-(3)-磷酸膽堿為66.8％(W/W)，1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-(3)-磷酸-sn-甘油為16.7％，棕櫚酸為12.5％，肽E為2.9％(W/W)以及水為1.1％(W/W)。實(shí)施例25除了以肽F(22.0mg)代替肽B(10.0mg)以及利用1，2-二硬脂酰-sn-甘油-(3)-磷酸-sn-甘油替代1，2-二?；?sn-甘油(3)-磷酸-sn-甘油(具有14-24碳原子的酰基基團(tuán)；由Sigma化學(xué)有限公司制造)以外，以類似于實(shí)施例21的操作，產(chǎn)生了463.9mg的白色表面活化劑粉末。
在該粉末中沒有可檢測量的乙醇，相對于表面活化劑總重量而言各種成分的含量分別是1，2-二棕櫚酰甘油-(3)-磷酸膽堿為64.7％，1，2-二硬脂酰-sn-甘油-(3)-磷酸-sn-甘油為21.6％(W/W)，棕櫚酸為8.6％(W/W)，肽F為4.7％(W/W)以及水為0.4％(W/W)。實(shí)施例26除了以肽G代替肽B以外，按實(shí)施例21描述方法生產(chǎn)454.1mg的白色表面活化劑粉末。
在該粉末中沒有可檢測量的乙醇，相對于表面活化劑總重量而言各種成分的含量分別是1，2-二棕櫚酰甘油-(3)-磷酸膽堿為66.1％，1，2-二?；?sn-甘油-(3)-磷酸-sn-甘油(具有14-24個(gè)碳原子的?；?，由Sigma化學(xué)有限公司制造)為22.0％(W/W)，棕櫚酸為8.8％(W/W)，肽G為2.2％(W/W)以及水為0.9％(W/W)。實(shí)施例27將1，2-二棕櫚酰甘油-(3)-磷酸膽堿(210mg)，1，2-二?；?sn-甘油-(3)-磷酸-sn-甘油(具有14-24個(gè)碳原子的?；挥蒘ihma化學(xué)有限公司制造)和硬脂酸33.0mg)溶于氯仿-甲醇混合物[3∶1(V/V)](100ml)中以及將肽H(1.9mg)溶于甲醇(0.5ml)。將這些溶液混合在一起，然后在減壓條件下干燥和固化。在50℃將獲得的殘留物于水-乙醇混合物[9∶1(V/V)](90ml)中懸浮15分鐘。在-55℃將該懸浮液冷凍和在100-120μHg的真空器中干燥28小時(shí)，獲得340.2mg的白色粉末狀表面活化劑。
在該粉末中沒有可檢測量的乙醇，相對于表面活化劑總重量而言各種成分的含量分別是1，2-二棕櫚酰甘油-(3)-磷酸膽堿為61.7％(W/W)，1，2-二?；?sn-甘油-(3)-磷酸-sn-甘油為26.5％(W/W)，硬脂酸為9.7％(W/W)，肽H為0.5％(W/W)以及水為1.6％(W/W)。實(shí)施例28將1，2-二棕櫚酰甘油-(3)-磷酸膽堿(210.0mg)，1-棕櫚酰-2油酰-sn-甘油-(3)-磷酸-L-絲氨酸(90.0mg)以及棕櫚酸(33.0mg)溶于氯仿-甲醇混合物[4∶1(V/V)](100ml)以及將肽I(11.0mg)溶于TFA(0.5ml)中。將這些溶液混合在一起，然后在減壓條件下干燥和固化。在45℃將獲得的殘留物于水-乙醇混合物[9∶1(V/V)](110ml)中懸浮25分鐘。在-55℃將該懸浮液冷凍后在100-120μHg真空器中干燥28小時(shí)，獲得了348.7mg的白色粉末狀表面活化劑。
在該粉末中沒有可檢測量的乙醇，相對于表面活化劑總重量而言各種成分的含量分別是1，2-二棕櫚酰甘油-(3)-磷酸膽堿為60.2％(W/W)，1-棕櫚酰-2-油酰-sn-甘油-(3)-磷酸-L-絲氨酸為25.8％(W.W)，棕櫚酸為9.5％(W/W)，肽I為3.2％(W/W)以及水為1.3％(W/W)。實(shí)施例29除了利用肽J替代肽B以外，按與實(shí)施例21相同的操作，生產(chǎn)了459.3mg的白色表面活化劑粉末。實(shí)施例30除了利用肽K替代肽B以外，按與實(shí)施例21相同的操作方法，生產(chǎn)了452.5mg的白色表面活化劑粉末。實(shí)施例31除了利用肽L代替肽B以外，按與實(shí)施例21相同的操作方法，生產(chǎn)456.6mg的白色表面活化劑粉末。實(shí)施例32除了利用肽M替代肽B以外，按與實(shí)施例21相同的操作方法生產(chǎn)453.9mg的白色表面活化劑粉末。實(shí)施例33除了利用肽N替代肽B以外，按與實(shí)施例21相同的操作，生產(chǎn)了452.5mg的白色表面活化劑粉末。實(shí)施例34除了利用肽O替代肽B以外，按與實(shí)施例21相同的操作，生產(chǎn)了458.1mg的白色表面活化劑粉末。實(shí)施例35將1，2-二棕櫚酰甘油-(3)-磷酸膽堿(30.0mg)，1，2-二?；?sn-甘油-(3)-磷酸-sn-甘油(具有14-24個(gè)碳原子的?；?；由Sigma化學(xué)有限公司制造)(10.0mg)以及棕櫚酸(4.0mg)溶于氯仿-甲醇混合物[2∶1(V/V)](30ml)以及將肽Q(1.0mg)溶于氯仿-甲醇混合物[2∶1(V/V)](2.0ml)。將這些溶液混合在一起，然后在減壓條件下干燥和固化。將獲得在殘留物在45℃在水-乙醇混合物[9∶1(V/V)](10ml)中懸浮20分鐘。在-60℃將該懸浮液冷凍并在60-120μHg的真空器中干燥36小時(shí)之后，獲得45.4mg的白色表面活化劑粉末。
在該粉末中沒有可檢測量的乙醇，相對于表面活化劑總重量而言各種成分的含量分別是1，2-二棕櫚酰甘油-(3)-磷酸膽堿為66.1％(W/W)，1，2-二?；?sn-甘油-(3)-磷酸-sn-甘油為22.0％(W/W)，棕櫚酸為8.8％(W/W)，肽Q為2.2％(W/W)以及水為0.9％(W/W)。實(shí)施例36除了使用肽R替代肽Q以外，按與實(shí)施例35相同的操作方法，生產(chǎn)得到45.7mg的白色表面活化劑粉末。比較實(shí)施例3
除了利用溶于TFA(0.3ml)中的肽S(10.0mg)的溶液替代溶于氯仿-甲醇混合物[2∶1(V/V)](2.0ml)中的肽B(10.0mg)溶液以外，按實(shí)施例21相同的操作法，生產(chǎn)455.2mg的白色表面活化劑粉末。
在該粉末中沒有可檢測量的乙醇，相對于表面活性劑總重量而言各種成分的含量分別是1，2-二棕櫚酰甘油-(3)-磷酸膽堿為65.9％(W/W)，1，2-?；?sn-甘油-(3)-磷酸-sn-甘油(具有14-24個(gè)碳原子的?；鶊F(tuán)；由Sigma化學(xué)有限公司制造)為22.0％(W/W)，棕櫚酸為8.8％(W/W)，肽S占2.2％(W/W)以及水為1.1％。(W/W)。比較實(shí)施例4除了利用溶于TFA(0.3ml)中的肽T(10.0mg)的溶液替代溶于氯仿-甲醇混合物[2∶1(V/V)](2.0ml)中的肽B(10.0g)溶液以外，按實(shí)施例21相同的操作法，生產(chǎn)456.0mg的白色表面活化劑粉末。
在該粉末中沒有可檢測量的乙醇，相對于表面活性劑總重量而言各種成分的含量分別是1，2-二棕櫚酰甘油-(3)-磷酸膽堿為65.8％(W/W)，1，2-?；?sn-甘油-(3)-磷酸-sn-甘油(具有14-24個(gè)碳原子的酰基基團(tuán)；由Sigma化學(xué)有限公司制造)為21.9％(W/W)，棕櫚酸為8.8％(W/W)，肽T占2.2％(W/W)以及水為1.3％。(W/W)。
表2顯示由本發(fā)明的表面活化劑對表面活性以及保持肺泡空間體積的作用的檢測效果。
在工業(yè)上的潛在應(yīng)用如上所述，與常規(guī)組合物相比，本發(fā)明的新合成肽易于分離和純化，可采用允許大批量生產(chǎn)方法進(jìn)行制備，在一般性溶劑中具高溶解性，并且顯示更好的均勻懸浮性以及同樣效力的表面活性。
因此，本發(fā)明可用作為呼吸窘迫綜合癥的治療劑，該綜合癥是一種導(dǎo)致嚴(yán)重呼吸紊亂的疾癥。
表2本發(fā)明的表面活化劑的表面活性及維持肺泡體積的作用

序列表序列號1序列長度35序列形式氨基酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)直鏈序列類型肽序列Phe Gly Ile Pro Cys Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Ile Val1 5 10 15Val Val Val Val Val Leu Ile Val Val Val Ile Val Gly Ala Leu Leu20 25 30Met Gly Leu35序列號2序列長度34序列形式氨基酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)直鏈序列類型肽序列Leu Ile Pro Cys Cys Pro Val Asn Ile Lys Arg Leu Leu Ile Val Val1 5 10 15Val Val Val Val Leu Leu Val Val Val Ile Val Gly Ala Leu Leu Met20 25 30Gly Leu序列號3序列長度35序列形式氨基酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)直鏈序列類型肽序列Leu Arg Ile Pro Cys Cys Pro Val Asn Leu Lys Arg Leu Leu Val Val1 5 10 15Val Val Val Val Val Leu Val Val Val Val Ile Val Gly Ala Leu Leu20 25 30Met Gly Leu35序列號4序列長度32序列形式氨基酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)直鏈序列類型肽序列Cys Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Ile Val Val Val Val Val1 5 10 15Val Leu Ile Val Val Val Ile Val Gly Ala Leu Leu Met Gly Leu His20 25 30序列號5序列長度35序列形式氨基酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)直鏈序列類型肽序列Phe Gly Ile Pro Cys Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu20 25 30Met Gly Leu35序列號6序列長度27序列形式氨基酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)直鏈序列類型肽序列Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu20 25序列號7序列長度27序列形式氨基酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)直鏈序列類型肽序列Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu20 25序列號8序列長度23序列形式氨基酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)直鏈序列類型肽序列Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu20序列號9序列長度19序列形式氨基酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)直鏈序列類型肽序列Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Leu序列號10序列長度23序列形式氨基酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)直鏈序列類型肽序列Ser Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu20序列號11序列長度27序列形式氨基酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)直鏈序列類型肽序列Cys Pro Val His Leu Lys Arg Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle1 5 10 15Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle Gly Ala Leu Leu20 25序列號12序列長度23序列形式氨基酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)直鏈序列類型肽序列Cys Pro Val His Leu Lys Arg Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle1 5 10 15Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle20序列號13序列長度22序列形式氨基酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)直鏈序列類型肽序列Pro Val His Leu Lys Arg Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle1 5 10 15Nle Nle Nle Nle Nle Nle20序列號14序列長度23序列形式氨基酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)直鏈序列類型肽序列Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Nle1 5 10 15Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle20序列號15序列長度23序列形式氨基酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)直鏈序列類型肽序列Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Ile Leu Leu Leu Leu Leu Leu1 5 10 15Ile Leu Leu Leu Leu Ile Leu20序列號16序列長度23序列形式氨基酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)直鏈序列類型肽序列Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Leu Leu Val Leu Nva Leu Val1 5 10 15Leu Nva Leu Leu Leu Leu Val20序列號17序列長度23序列形式氨基酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)直鏈序列類型肽序列Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Leu Leu Leu Leu Trp20序列號18序列長度23序列形式氨基酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)直鏈序列類型肽序列Cys Pro Val Asn Leu Lys Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu1 5 1015Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu20序列號19序列長度23序列形式氨基酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)直鏈序列類型肽序列Cys Pro Val Asn Ile Lys Arg Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle1 5 10 15Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle20序列號20序列長度27序列形式氨基酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)直鏈序列類型肽序列Cys Pro Val His Leu Lys Arg Val Val Val Val Val Val Val Val Val1510 15Val Val Val Val Val Val Val Gly Ala Leu Leu20 25序列號21序列長度27序列形式氨基酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)直鏈序列類型肽序列Cys Pro Val His Leu Lys Arg Ile Ile Ile Ile Ile Ile Ile Ile Ile1 5 10 15Ile Ile Ile Ile Ile Ile Ile Gly Ala Leu Leu20 2權(quán)利要求
1.具有下列特定序列的合成肽Xaa-Pro-Val-Xbb-Xcc-Lys-Arg-W(Xaa可以不存在，或者可以代表Cys或Ser，Xbb代表His或Asn，Xcc代表Leu或Ile，以及W代表疏水部分)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述合成肽，其中疏水肽部分由12-20分子的Leu和/或Nle組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述合成肽，其中疏水肽部分含有除Leu和Nle以外的疏水氨基酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3所述合成肽，其中疏水肽部分含有1-5分子的Ile，Val，Nva或Trp。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述合成肽，具有序列No.5-19之一作為特定的肽序列，或者它是序列No.8的肽的S-乙酰胺基甲基化形式或者它是序列No.9的肽的S-棕櫚酰基化形式。
6.用于合成的肽，其中該肽的由下列序列指明的親水肽部分的N-末端和功能基團(tuán)被保護(hù)Xaa-Pro-Val-Xbb-Xcc-Lys-Arg(Xaa可以不存在，或者可以是Cys或Ser，Xbb代表His或者Asn，Xcc代表Leu或Ile)。
7.如權(quán)利要求6所述用于合成的肽，它是Fmoc-Pro-Val-His(Trt)-Leu-Lys(Boc)-Arg(Mtr)，F(xiàn)moc-Pro-Val-Asn-Leu-Lys(Boc)-Arg(Mtr)或者Fmoc-Pro-Val-Asn-Ile-Lys(Boc)-Arg(Mtr)。
8.生產(chǎn)權(quán)利要求1合成肽的方法，其特征在于將權(quán)利要求1-4指示的疏水肽部分與權(quán)利要求6或7指明的用于合成的肽進(jìn)行縮合。
9.肺表面活化劑，由具有特定序列的合成肽，膽堿磷酸甘油酯，酸性磷脂和脂肪酸類似物組成。
10.用于治療呼吸窘迫綜合癥的治療劑，含有其中作為活性成分的肺表面活化劑，所述肺表面活化劑由具有特定序列的合成肽，膽堿磷酸甘油酯，酸性磷脂以及脂肪酸類似物組成。
全文摘要
含有下列特定序列的合成肽Xaa-Pro-Val-Xbb-Xcc-Lys-Arg-W(其中Xaa可以不存在或者代表Cys或Ser，Xbb代表His或Asn，Xcc代表Leu或Ile，W代表一種疏水肽部分)，一種用于制備該肽的中間體，一種生產(chǎn)該肽的方法，含該肽和一種類脂混合物的肺表面活化劑以及以該表面活化劑作為主要成分的用于治療呼吸窘迫綜合癥的藥物。該肽易于分離和純化并適于大批量生產(chǎn)。由于其在甲醇等中具高可溶性，因而其易于與類脂混合物混合，并適用于制備肺表面活化劑。由于肺表面活化劑有較高的懸浮性和潛在表面活性，因而適用于作為治療呼吸窘迫綜合癥的藥物。
文檔編號A61K38/00GK1136813SQ94194376
公開日1996年11月27日 申請日期1994年12月7日 優(yōu)先權(quán)日1993年12月8日
發(fā)明者武井恒知, 大坪英二, 大川博 申請人:東京田辺制藥株式會社