專利名稱：具有降血壓功能的多肽及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，具體涉及一種具有降血壓功能的多肽及其用途。
背景技術(shù)：
豬血，有著悠久的藥用歷史，自漢代起，歷代本草均把豬血單獨(dú)列出，記載了它的藥用功效“補(bǔ)血養(yǎng)心，熄風(fēng)鎮(zhèn)驚，下氣，止血”等等；同時還收錄了大量的驗方。民間也廣泛食用豬血預(yù)防、治療疾病?，F(xiàn)代研究亦表明，豬血不僅含有人體所必需的8種氨基酸在內(nèi)的 18種氨基酸，具有較高的營養(yǎng)價值，還能夠治療貧血、白血病，降低血脂，促進(jìn)傷口愈合等。 然而現(xiàn)在，人們主要利用了該品種的食用性，很大程度上忽略了它的藥用功效。這主要是因為豬血藥用功能物質(zhì)基礎(chǔ)不明，對它的藥用基礎(chǔ)性研究還十分薄弱。國外特別是日本以豬血為原料，研究酶解后的的生物活性肽，多肽的部分功能與本草記載相符。我國豬血資源豐富，年產(chǎn)量約為10億公斤，但僅有一小部分應(yīng)用于食品、飼料產(chǎn)業(yè)，絕大部分成為廢棄物。與我國歷史背景類似的日本對豬血的開發(fā)利用率為50 60%左右(主要根據(jù)本草記載利用現(xiàn)代生物技術(shù)進(jìn)行深度加工后開發(fā)為藥品)，究其原因主要是國內(nèi)對該資源重視度不夠，有效成分不明確，難以深度利用。國內(nèi)該資源的豐富性與低水平的利用現(xiàn)狀以及本草記載使用的歷史與現(xiàn)今國外研究利用的熱度，促使我們應(yīng)該對這一資源引起重視。國外由蛋白質(zhì)酶解獲得的活性肽，是功能性食品、藥品開發(fā)研究最活躍的領(lǐng)域之一。研究者從食品蛋白質(zhì)的酶解物中發(fā)現(xiàn)了一些小分子肽，這些肽按生理功能主要可分為 嗎啡樣活性肽、抗高血壓肽、免疫調(diào)節(jié)肽、促進(jìn)鈣吸收的酪蛋白磷酸肽、抗血栓肽、促進(jìn)DNA 合成和細(xì)胞生長的肽、抗菌肽、抗癌肽、促進(jìn)雙歧桿菌生長的肽等。以豬血為蛋白源的生物活性肽是通過現(xiàn)代生物技術(shù)酶解后將豬血中的血紅蛋白轉(zhuǎn)化為小分子肽。研究表明，小分子豬血肽不僅有很好的溶解性、低粘度，最新研究表明，飲食中的寡肽O 3個氨基酸)和多肽(10 51個氨基酸)能夠完整地通過腸道吸收，作為生物活性肽在組織水平上引起機(jī)體的生物學(xué)效應(yīng)。而且，蛋白質(zhì)利用率高，它還具有低抗原性，不會產(chǎn)生過敏反應(yīng)。1977年Darderme和Pleau等從豬血清中分離和精制了免疫調(diào)節(jié)激素-胸腺肽 (TF)，并進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析，得到了其氨基酸，分子量857Da。我國馮啟浩等通過藥理研究表明，從豬血中得到的TF具有顯著的免疫活性。越來越多的研究關(guān)注以豬血蛋白為來源的功能性多肽。Kazue Mito等人酶解豬血珠蛋白得到了 4種具有抑制ACE活性的多肽。張艷梅等對豬血中抗菌肽類物質(zhì)進(jìn)行分離純化和抗菌活性研究；王延卓從豬血中分離得到分子量為6kDa的多肽，其對大腸桿菌質(zhì)控株ATCC25922抗菌活性最好。方俊等對豬血蛋白多肽抗氧化功能進(jìn)行研究。目前需要在豬血中發(fā)現(xiàn)新的活性多肽，以為本領(lǐng)域提供新的選擇。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供新的功能多肽。
本發(fā)明解決技術(shù)問題的技術(shù)方案是提供一種新的具有降血壓功能的多肽。該具有降血壓功能的多肽(1)是具有SEQ ID No. 3所述的氨基酸序列的多肽；或者為(2)是在所述SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列基礎(chǔ)上經(jīng)過取代、缺失、或者添加一個或幾個氨基酸后且具有相同或相似功能的多肽。上述多肽的功能為降血壓。本發(fā)明還提供了上述具有降血壓功能的多肽的編碼核苷酸序列。本發(fā)明還提供了含有上述的編碼核苷酸序列的載體。本發(fā)明還提供了含有上述載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明另外也提供了上述具有降血壓功能的多肽在制備降血壓藥物中的用途。當(dāng)然，本發(fā)明也提供了一種新的降血壓藥物。該降血壓藥物含有上述的具有降血壓功能的多肽作為有效成分。進(jìn)一步的，上述的降血壓藥物的劑型為口服制劑。更進(jìn)一步的，上述的口服制劑主要為膠囊劑、片劑、滴丸、含片、分散片、片劑或顆粒劑等。本發(fā)明以豬血為起始的研究材料。首先制得豬血脫色液，然后對豬血脫色液進(jìn)行進(jìn)一步的酶解。對酶種類進(jìn)行比較后，最后仍選用胃蛋白酶進(jìn)行酶解為佳，通過胃蛋白酶酶解，然后超濾，得到分子量< 3kDa的酶解液MC。隨后再將酶解液MC通過凝膠層析分離、反向高效液相色譜法分離、體外ACE抑制活性跟蹤得到6個新多肽，Genebank多肽數(shù)據(jù)庫查詢表明這6種肽均為首次從豬血中分離得到。并通過基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-T0F-MS)測定序列，其中一種的氨基酸序列為VVYPW，其對ACE活性抑制的IC5tl為0. 254mg/mL·對VVYPW多肽進(jìn)行了胃蛋白酶和胰蛋白酶消化實驗，被消化后活性增強(qiáng)，說明這種肽能夠經(jīng)口服給藥。推測該ACE活性抑制肽為前體型抑制劑(Prodrug-type inhibitor)。藥理實驗表明，該多肽對自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)有顯著的降血壓作用。能夠在給藥后1 36小時內(nèi)發(fā)揮藥效，給藥后3小時降血壓作用最強(qiáng)。初證實了其降血壓效該多肽可以作為活性成分再添加本領(lǐng)域的其他輔助性成分，或再添加其他具有抗血壓活性的成分制成制劑使用。其劑型最好為口服制劑，如膠囊劑、片劑、滴丸、含片、分散片、口服液、片劑或顆粒劑等常見的口服制劑。本發(fā)明首次獲得了具有良好降壓活性的多肽VVYPW(SEQ ID No 3)，并通過體內(nèi)外試驗證明其合成肽具有良好的降血壓作用，能夠制備成為降血壓藥物，并且能夠口服使用， 為降血壓領(lǐng)域提供了一種新的有效選擇，具有很好的市場前景。


圖1豬血脫色液SDS-PAGECTris-Glycine體系)電泳圖譜。M 標(biāo)準(zhǔn)品1 胃蛋白酶酶解液2 胰蛋白酶酶解液3 :1394蛋白酶酶解液4 木瓜蛋白酶酶解液。圖2豬血脫色液SDS-PAGECTris-Tricine體系)電泳圖譜。M 標(biāo)準(zhǔn)品1 胃蛋白酶酶解液2 胃蛋白酶酶解液超濾后3 胰蛋白酶酶解液4 胰蛋白酶酶解液分子量超濾后 5 木瓜蛋白酶酶解液6 木瓜蛋白酶酶解液超濾后7 1394蛋白酶酶解液8 :1394蛋白酶酶解液分子量超濾后圖3S印hadex G-25凝膠色譜分離圖譜。I，II，III，IV，V，VI分別代表組分(管號)1，II，III，IV, V, VI。圖4P1、P2、P3的SHRs —次給藥血壓變化圖。SHRs —次給藥SBP (收縮壓)變化如上所述，垂直條代表標(biāo)準(zhǔn)偏差。其中·代表空白對照組(純凈水)，Δ代表Pl組， 代表Ρ2組，□代表Ρ3組?？v坐標(biāo)表示大鼠尾動脈收縮壓變化值，橫坐標(biāo)表示給藥后時間。與對照組比較，顯著度為*，ρ < 0. 05。圖5Ρ4的SHRs —次給藥血壓(SBP、收縮壓)變化曲線圖。其中·代表空白對照組(純凈水)，■代表Ρ4組?？v坐標(biāo)表示大鼠尾動脈收縮壓變化值，橫坐標(biāo)表示給藥后時間。與對照組比較，顯著度為*，ρ < 0. 05。圖6Ρ5的SHRs —次給藥血壓(SBP、收縮壓)變化曲線圖。其中▲代表空白對照組(純凈水)，■代表Ρ5組?？v坐標(biāo)表示大鼠尾動脈收縮壓變化值，橫坐標(biāo)表示給藥后時間。與對照組比較，顯著度為*，ρ < 0. 05。 圖7Ρ6的SHRs —次給藥血壓(SBP、收縮壓)變化曲線圖?！砜瞻讓φ战M(純凈水)，■代表Ρ6組?？v坐標(biāo)表示大鼠尾動脈收縮壓變化值，橫坐標(biāo)表示給藥后時間。與對照組比較，顯著度為*，ρ < 0. 05。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖通過實施例對本發(fā)明方法作進(jìn)一步的描述，但并不因此將本發(fā)明保護(hù)的范圍限定在實施例的范圍之中。實施例一模擬體內(nèi)代謝的豬血體外酶解豬血干燥后的主要成分為蛋白質(zhì)，含量近20%，其中血細(xì)胞中的血紅蛋白占全血蛋白總量的75%。血紅蛋白經(jīng)水解后，降解成為不同鏈長的小分子肽類化合物。豬血中顯色與腥臭味物質(zhì)主要為血紅素，它對有效物質(zhì)的提取分離、含量測定、分子量檢測等研究嚴(yán)重干擾。豬血的入人體首先被消化酶降解成較穩(wěn)定的多肽(分子量范圍是0. IkDa IOkDa)， 分子量小于3kDa的小肽通常具有生物活性，這類小肽也易被人體吸收。這類小肽也是豬血起效的共性性物質(zhì)。因此選擇合適的方法將豬血脫色成為尋找豬血降壓活性成分的首要任務(wù)。本發(fā)明通過酶解結(jié)合活性炭脫色，脫色產(chǎn)物采用消化酶體外模擬體內(nèi)消化條件， 對脫色液進(jìn)行進(jìn)一步的酶解，并對酶解液進(jìn)行超濾，得到分子量小于3kDa的多肽粗品 (MC)。全過程用Tricine-SDS-PAGE對蛋白、多肽的分子量范圍進(jìn)行跟蹤。為進(jìn)一步分離純化降壓肽奠定基礎(chǔ)。1、實驗材料與儀器豬血(采集于溫江屠宰場)；胃蛋白酶、胰蛋白酶、1394酶、木瓜蛋白酶，德陽生化廠；粉末活性炭(重慶吉元化學(xué)有限公司)；五水硫酸銅，無水碳酸鈉，檸檬酸三鈉，乙酸， 甘油，氫氧化鈉，羧甲基淀粉鈉，成都市科龍化工試劑廠；福林酚試劑；十二烷基硫酸鈉； Acrylamide (丙烯酰胺)，N, N-Methylene bisacrylamide (甲叉雙丙烯酰胺),Tris (三羥甲基氨基甲烷)，Tricine(N-三(羥甲基)甲基甘氨酸)，Glycin (甘氨酸)，美國sigma公司；以上皆為分析純。紫外可見分光光度計(France Anthelie)；冷凍離心機(jī)(Biofugo primor) ；pH 計(DD-15)；渦旋混合儀(WH-3)；恒溫水浴鍋；3kD、IOkD Millipore超濾離心筒；電泳儀 (Mini-proteanlll)；制冰機(jī)(SIM-F124)；冷凍離心機(jī)(Biofuge primor)；凝膠電泳分析系統(tǒng)(170-8101)2、豬血脫色研究2. 1實驗流程新鮮豬血一加入檸檬酸三鈉抗凝一離心一取下層一酶解一調(diào)pH = 3. O —加吸附劑脫色一離心一取上清液一補(bǔ)足到同一體積一綜合評價脫色效果2. 2實驗方法2. 2. 1血紅素測定用紫外分光光度計對脫色液進(jìn)行全波長掃描，得到兩個最大吸收峰OD28tl和OD415， OD280為蛋白質(zhì)的特征峰，OD415為血紅素的特征峰。本實驗選用OD415進(jìn)行血紅素的測定。脫色率按照以下公式計算
脫色率=
AsAs-酶解液脫色前在OD415的吸光度值A(chǔ)0-酶解液脫色后在OD415的吸光度值2. 2. 2蛋白質(zhì)含量測定采用Iowry法[53]測定脫色液樣、豬血原樣的蛋白濃度，計算蛋白質(zhì)得率(PR)。計
算方法如下式
蛋白質(zhì)得率(PR) = |||||5|xl00O/o
原豬血蛋白濃度2. 2. 3響應(yīng)值計算脫色效果采用響應(yīng)值評價，既保證較高的脫色率，又保證較高的蛋白質(zhì)得率，響應(yīng)
值越小越好，計算方法如下式
響應(yīng)值(R)=脫色率Xl00 網(wǎng)χ網(wǎng)2. 2. 4酶活力測定采用中華人民共和國專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)觀)(66030-87《蛋白酶活力測定法》規(guī)定的方法。2. 2. 5脫色條件優(yōu)化采用4因素5水平均勻設(shè)計法進(jìn)行脫色條件優(yōu)化。2. 3結(jié)果分析2. 3. 1脫色劑選擇選取粉末活性炭、羧甲基淀粉鈉(CMQ、羧甲基纖維素鈉(CMC)為脫色劑，評價指標(biāo)為蛋白質(zhì)得率、脫色率、響應(yīng)值、色澤、氣味、除去難易(以離心除去時間考察)，考慮脫色劑成本、再生問題。使用胃蛋白酶酶解液，脫色條件為吸附劑加入量4%、pH = 3.0、溫度 55°C、反應(yīng)30min、8000g離心。脫色評價見表1。表1不同脫色劑脫色效果評價
權(quán)利要求
1.具有降血壓功能的多肽，其特征在于(1)是具有SEQID No. 3所述的氨基酸序列的多肽； 或者為(2)是在所述SEQID No. 3所示的氨基酸序列基礎(chǔ)上經(jīng)過取代、缺失、或者添加一個或幾個氨基酸后且具有相同或相似功能的多肽。
2.權(quán)利要求1所述的具有降血壓功能的多肽的編碼核苷酸序列。
3.含有權(quán)利要求2所述的編碼核苷酸序列的載體。
4.含有權(quán)利要求3所述的載體的宿主細(xì)胞。
5.權(quán)利要求1所述的具有降血壓功能的多肽在制備降血壓藥物中的用途。
6.降血壓藥物，其特征在于含有權(quán)利要求1所述的具有降血壓功能的多肽作為有效成分。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的降血壓藥物，其特征在于為口服制劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的降血壓藥物，其特征在于所述的口服制劑為膠囊劑、片劑、 滴丸、含片、口服液、分散片、片劑或顆粒劑。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，具體涉及一種具有降血壓功能的多肽及其用途。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供新的降血壓多肽。本發(fā)明解決技術(shù)問題的技術(shù)方案是提供一種降血壓多肽。該具有降血壓功能的多肽(1)是具有SEQ ID No.3所述的氨基酸序列的多肽；或者為(2)是在所述SEQ ID No.3所示的氨基酸序列基礎(chǔ)上經(jīng)過取代、缺失、或者添加一個或幾個氨基酸后且具有相同或相似功能的多肽。通過體內(nèi)外試驗證明該多肽其具有良好的降血壓作用，能夠制備成為降血壓藥物，為降血壓領(lǐng)域提供了一種新的有效選擇。
文檔編號A61P9/12GK102276695SQ201110223589
公開日2011年12月14日 申請日期2011年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月5日
發(fā)明者萬德光, 任艷, 國錦琳 申請人:成都中醫(yī)藥大學(xué)