專利名稱：反義多核苷酸的制作方法
同一個基因的有意義鏈或由它轉(zhuǎn)錄的mRNA互補并能雜交的核苷酸寡聚物(寡核苷酸)是反義寡聚物。當(dāng)一個目標(biāo)基因的有意義鏈或一個mRNA暴露于它的反義寡聚物，兩者將會雜交，其結(jié)果是，只要此寡聚物一直雜交著，那么此基因或mRNA的轉(zhuǎn)錄將受到封閉。因而，該基因編碼的蛋白質(zhì)(如果該基因是編碼調(diào)節(jié)蛋白的，那就是一組蛋白質(zhì))就不會產(chǎn)生。反義寡聚物因其性質(zhì)有許多用途。例如依靠它們與目標(biāo)核苷酸結(jié)合的能力，可用于診斷。而且，它們對蛋白質(zhì)合成的影響使得反義寡聚物在治療上也有用。反義寡核苷酸的概念及其組成與化學(xué)性質(zhì)已總結(jié)在Chemical Reviews 90，544-579(1990)中。
NF-kB轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物是一個多效激活劑，它參與多種細胞和病毒基因的誘導(dǎo)作用參見(Baeuerle，P.A.，和D.Baltimore(1989)Genes Dev.31689-1698;Lenardo，M.J.，和D.Baltimore(1989)Cell 58227-229).
此活性復(fù)合物是由兩個亞基組成的，它們稱為P50和p65，參見(Baeuerle和Baltimore(supra);Ghosh，S.和D.Baltimore(1990)Nature(London)344678-682).
編碼p50的基因已克隆出來，參見
(Ghosh，S.et al.(1990)Cell 621019-1029(Ref.1);Kieran，M.et al.(1990)Cell 621007-1018(Ref.2))和p65(Nolan，G.P.et al.(1991)Cell 64961-969(Ref.3);Ruben，S.et al.(1991)Science 2511490-1493(Ref.4));
并且這兩個蛋白質(zhì)的N-末端顯示出與癌基因rel的產(chǎn)物有相當(dāng)大的同源性。上面提到的參考文獻1-4在表Ⅰ(實施例1)中以同樣的數(shù)碼被引用。
許多細胞粘合分子，(CAMs)，包括ICAM-1(Voraberger，G.et al.(1991)Immunol.1472777-2786)，vimentin(Lilienbaum，A.et al.(1990)J.Virol.64256-263)和ELAM-1(Whelan，J.et al.(1991)Nucleic Acids Res.192645-2653)在它們的5′調(diào)控區(qū)內(nèi)有NF-kB結(jié)合部位。NF-kB可以通過調(diào)節(jié)這些粘合分子而影響細胞粘合，從而影響細胞生長。
有可能利用細胞的粘合來檢測反義功能，例如用反義寡聚物對公認粘合分子和結(jié)腸直腸癌(DCC)中缺失的腫瘤抑制基因進行抑制，導(dǎo)致種種細胞的分離。
(Narayanan，R.et al.(1992)Oncogene 7553-561).
細胞與細胞以及細胞與底質(zhì)間的粘合是通過幾個不同的受體家族介導(dǎo)的，這些受體以特殊的細胞外基質(zhì)(ECM)蛋白和相鄰細胞的配基為靶子。
(Albelda，S.M.和C.A.Buck(1990)FASEB J.42868-2880).
這些受體也影響細胞生長、分化、細胞連接形成以及細胞極性的各個方面。
1990，supra;Hynes，R.O.(1992)Cell 6911-25).
在組織培養(yǎng)細胞中，焦點接觸(細胞結(jié)合到ECM的特殊膜區(qū))的形成包括蛋白多糖如肝素硫酸鹽以及多種一體蛋白分子。一體蛋白是雜二聚體分子，它具有細胞與基質(zhì)和細胞與細胞粘合的兩種受體的功能(Albelda和Buck，1990，supra)。免疫球蛋白超基因家族的粘合分子也參與細胞與細胞間粘合。這些分子在胚胎發(fā)生、傷口愈合、炎癥反應(yīng)、血凝固和轉(zhuǎn)移中起著重要的作用。
(Albelda和Buck，1990，supra;Hynes 1992，supra).
認識到細胞粘合分子與炎癥有關(guān)已導(dǎo)致新的治療方法的產(chǎn)生。特殊細胞粘合分子的單克隆抗體已用于抑制膿毒性休克和局部缺血-再灌注操作中皮膚炎癥區(qū)的嗜中性募集。
根據(jù)本發(fā)明，與編碼NF-kB轉(zhuǎn)錄因子的基因的一部分基本互補并雜交以基本阻止由上述基因決定的NF-kB轉(zhuǎn)錄因子產(chǎn)生的任何寡聚物，都能用來防止細胞粘合。細胞粘合在諸如炎癥、傷口愈合、腫瘤生長的情況中是一個重要的因素。這些寡聚物有減輕這些癥狀的治療應(yīng)用價值。
與NF-kB基因部分雜交以基本阻止NF-kB復(fù)合物形成的寡聚物對防止細胞粘合是有用的。任何與NF-kB基因的這些部分結(jié)合的寡聚物會象所描述的那樣阻止NF-kB產(chǎn)生。當(dāng)在暴露于此寡聚物的細胞中NF-kB產(chǎn)物被阻斷的時候，細胞會失去粘著于表面的能力。NF-kB基因中所提到的部分，當(dāng)它們通過雜交封閉時會基本阻止NF-kB合成，具有下列序列或基本上是下列序列GCC ATG GAC GAA CTG TTC CCC [SEQ ID:1]和AGA ATGGCA GAA GAT GAT CCA [SEQ ID:2]要求授權(quán)的寡聚物能同編碼NF-kB轉(zhuǎn)錄因子基團的一部分進行雜交。當(dāng)這一寡聚物與NF-kB基因的一部分雜交時，該基因的NF-kB產(chǎn)物將會被基本上阻止?；咀柚挂馕吨鳱F-kB不產(chǎn)生，或者在不起作用的水平上產(chǎn)生。正如在本文使用的一樣，與基因結(jié)合的含義包括與相應(yīng)的mRNA結(jié)合。NF-kB有兩個亞基，叫做p50和p65，由不同的基因編碼。其中每一個基因都被認為是編碼NF-kB的基因。本文描述的寡聚物能與p50基因或p65基因結(jié)合，特別是人的基因。如果p65或p50基因通過與一寡聚物雜交而被封閉，NF-kB轉(zhuǎn)錄因子就不會產(chǎn)生。此寡聚物與它們的靶位點基本互補。它們不必反映出靶部位的準(zhǔn)確互補序列，但必須是足夠的互補，以與靶部位選擇性地雜交。
關(guān)于寡核苷酸的設(shè)計，特別是有關(guān)雜交條件的專一性等需要考慮的一般問題，能夠在本領(lǐng)域的陳述中找到，例如在Sambrook等編寫的《分子克隆·實驗室手冊》，特別是第二版的第十一章，此書由冷泉港實驗室出版(1989)。就本發(fā)明的目的而言，應(yīng)該知道只有具目的核苷酸序列特定長度的寡核苷酸才是合適的。這一序列的最短長度能由本專業(yè)的技術(shù)人員依據(jù)有意義的給定靶序列的足夠?qū)Ｒ恍缘耐ǔＲ阎目紤]來確定(見上面Sambrook等所述)。這一序列的最大長度也能由專業(yè)人員根據(jù)技術(shù)中已知的需要來考慮確定，例如，考慮對細胞膜的足夠的穿透效率，該效率能通過實驗來檢測。
特別是，含有或具有GGG GAA CAG TTC GTC CAT GGC [SEQID:3]序列的寡聚物與編碼人p65亞基的基因的一部分相結(jié)合;含有或具有TGG ATC ATC TTC TGC CAT TCT [SEQID:4]序列的寡聚物與編碼人p50的基因的一部分相結(jié)合。這些寡聚物也能與在那里互補的相應(yīng)的mRNA雜交。
優(yōu)選的寡聚物長度約是21個核苷酸，然而也可用5到50的寡聚物長度。較長寡聚物的一個特點是更高的專一性，然而這一特點應(yīng)與對穩(wěn)定性的考慮和易于通過細胞膜相權(quán)衡，這樣較短的寡聚物更可取。具有根據(jù)[SEQID1]到[SEQID4]寡核苷酸序列的寡聚物最優(yōu)選。
當(dāng)本文公開的一個寡聚物引入一個細胞時，寡聚物通過與NF-kB基因或NF-kB mRNA的一部分結(jié)合，可基本上減少或阻止NF-kB合成。令人吃驚的是，結(jié)果該細胞失去了粘著到表面的能力。因此，這些寡聚物作為反義寡聚物是有用的，并且阻止暴露于它們的細胞粘著于表面。一個阻斷NF-kB合成及細胞粘合的寡聚物能通過實施例中所述的細胞粘合試驗來選擇。
這是出人意外的，因為NF-kB是一個轉(zhuǎn)錄因子，因而它介導(dǎo)DNA到mRNA的轉(zhuǎn)錄，這是所有細胞的一個基本功能。如果阻斷NF-kB的合成預(yù)料會擾亂一個細胞的代謝并且破壞或殺死細胞。令人驚奇的是處理過的細胞活了下來，但失去了其完成高度專一功能的能力，即粘著于表面的能力。粘合能力的喪失阻止細胞間或細胞與生理底物的粘合。因此，暴露于寡聚物的細胞會改變它們的特性。因為NF-kB是一種在各種細胞和組織中發(fā)現(xiàn)的蛋白，本公開的寡聚物將起減低或消除任何能粘著于表面的細胞的粘合作用。
要求授權(quán)的寡聚物可以由熟知的方法生產(chǎn)，例如，象實施例中敘述的那樣，通過克隆或化學(xué)合成生產(chǎn)。寡聚物可以從一個靶基因的序列獲得，或從由蛋白序列推斷出來的核苷酸序列來獲得。
用任何常規(guī)的方法生產(chǎn)的寡聚物通過測定它們基本抑制NF-kB合成的能力來篩選。能夠與編碼NF-kB基因的一部分雜交，進而基本阻止NF-kB合成的寡聚物的測定可通過測定雜交和細胞粘合的任何常規(guī)方法來完成。用于此篩選的細胞粘合檢測敘述在實施例中。簡短地說，能粘著到表面的任何類型的細胞可以在常規(guī)條件下生長，例如在培養(yǎng)皿(或任何可培養(yǎng)細胞的合適的容器)培養(yǎng)足夠長的時間，讓細胞粘著在皿的底部。將一層白明膠或任何其它合適的底物在細胞加入前覆蓋在培養(yǎng)皿表面，寡聚物隨后加入到培養(yǎng)的細胞中，一段時間后當(dāng)細胞從培養(yǎng)皿的表面分開時，便觀察到寡聚物的預(yù)期作用。12到24小時是觀察喪失粘合的優(yōu)選培養(yǎng)時間，然而，或許需要幾個星期或更長時間。
阻斷細胞粘合的寡聚物可以經(jīng)修飾來增加其穩(wěn)定性。組成寡聚物核苷酸的磷酸酯基團可以在像天然核苷酸磷酸酯部分的自由單鍵氧的位置進行修飾，可以是氧、甲基或硫。這樣修飾的寡聚物通過實施例中敘述的常規(guī)合成得到。這些取代物的任一個都可以用已知方法通過將合適的分子加入一臺自動合成儀中來得到。
因此，提供本發(fā)明中寡核苷酸的制備及其修飾方法也是本發(fā)明的目的之一，其特征在于將通過固相合成已得到的、經(jīng)保護的固體支持物結(jié)合的相應(yīng)核苷酸順序的寡核苷酸脫保護，并從固相裂解下來，如果需要的話，然后進行修飾。脫保護和裂解過程依賴于所合成的寡核苷酸的類型，例如依賴于所用的保護基或如下所示的磷原子上的取代基Y。寡核苷酸，特別是其中的堿基也可以在合成中通過化學(xué)修飾或在合成的延長步驟中用已修飾前體(building blocks)在結(jié)構(gòu)上加以修飾。這些過程對專業(yè)人員是已知的。
優(yōu)選的寡聚物有下列簡化的結(jié)構(gòu)
堿基代表核苷堿基A、T、C、G。Y選自O(shè)-、S-、或甲基。
優(yōu)選的修飾的寡聚物正如以上所描述的一樣，具有下列的堿基序列GGG GAA CAG TTC GTC CAT GGC[SEQID:3]和TGG ATC ATC TTC TGC CAT TCT[SEQID:4]所以，要求授權(quán)的寡聚物由具有上面提供序列的核苷酸組成，而且它們的核苷酸是通過化學(xué)式為-O-P(＝O)(Y)-O-的磷酸酯基團連接的，其中Y選自甲基、氧或硫。
因為阻止細胞粘合，要求授權(quán)的寡聚物是有用的。正是此特性賦于寡聚物通過阻止細胞粘合反應(yīng)在治療炎癥、促進傷口愈合以及分解腫瘤上的用途。
本發(fā)明的再一目的是提供一種藥物組合物，它含有至少一種本發(fā)明的寡核苷酸或其修飾物，如果適當(dāng)?shù)脑?，還含有治療上可接受的載體材料。
而且，利用本發(fā)明的寡核苷酸及其修飾物來制備上述的藥物組合物，即用于阻止細胞粘合或用于診斷目的的藥物組合物，也是本發(fā)明的一個目的。
就阻止細胞粘合而言，寡聚物可直接注射到血流或靶組織中，然后通過擴散透過細胞膜或經(jīng)受體進入細胞內(nèi)，這時它們與上述靶序列雜交。寡聚物可以與像抗體或受體片段那樣的靶載體連接，或通過常規(guī)的方法包裹在脂質(zhì)體或膠囊中，以便更有效地被送入細胞內(nèi)。像敘述的那樣，帶有用甲基或硫取代的磷酸酯基的寡聚物的修飾導(dǎo)致對酶降解作用更穩(wěn)定的寡聚物，因此，就治療目的而言，修飾的寡聚物比同樣序列未修飾的寡聚物更優(yōu)選。另外，修飾的寡聚物比未修飾的寡聚物更易透過細胞膜。
任何施用一個具生物活性化合物的常規(guī)方法都可以用于施用有效量的寡聚物。更具體地講，經(jīng)修飾或未經(jīng)修飾的寡聚物可以單獨施用，也可通過與合適的藥物載體組合或與載體連接來施用。載體的實例包括肽、免疫球蛋白及其片段、脂質(zhì)體、受體分子、配基分子(如激素)、酶及任何供藥用的常規(guī)化合物。
有效劑量的寡聚物的給藥可以是口服、腸胃外、靜脈、皮膚或通過其它傳統(tǒng)給藥途徑給藥。包括有效量寡聚物的常規(guī)制劑都是本發(fā)明天的一部分。寡聚物可以局部地用于阻止靶組織中細胞粘合。
寡聚物的有效劑量可由專業(yè)人員根據(jù)實驗數(shù)據(jù)確定。例如，治療部位的有效劑量可以通過提供對單個細胞有效劑量的體外實驗確定。這些劑量可以被推斷以用于治療部位的細胞群，并考慮到因部分寡聚物不能到達治療部位而造成的有效濃度的降低。寡聚物濃度依賴于各種已知的因素，它們包括寡聚物的穩(wěn)定性(它基于寡聚物自身、長度、修飾及載體)，給藥途徑和給藥媒介物(口服、皮下、胃腸外或靜脈給藥)，及治療部位(它決定于生理屏障，如血-腦屏障)。治療的病情也是一個考慮因素。
在治療部位寡聚物的優(yōu)選有效劑量是從約1×10-8M到約1×10-5M。在外用組合物中，所述優(yōu)選有效量的寡聚物是存在于溶液、乳化液、或帶有可接受載體的乳膏或油膏中。
藥用賦形劑包括溶液、油膏、片劑、以及任何適合于給定施用模式的常規(guī)賦型劑。優(yōu)選溶液或油膏。除寡聚物和/或它的鹽外，溶液還可包括緩沖劑(如生理鹽水)，穩(wěn)定劑(如BSA)，以及其它常規(guī)成分。供局部應(yīng)用的油膏、乳膏、乳化液、洗劑及香波包括已知的成分。
本發(fā)明的寡聚物可被用來治療與細胞粘合有關(guān)的病癥。
炎癥是由細胞對底物和其它細胞的粘合而介導(dǎo)的。因此，防止細胞粘合會減輕局部炎癥。所以，治療炎癥的方法包括給病人施用足以減輕炎癥的一定量的要求授權(quán)的寡聚物。在炎癥部位，寡聚物的優(yōu)選存放濃度為約1×10-8M到1×10-5M。優(yōu)選局部給藥。傷口愈合也受細胞粘合的影響，因此，為了傷口愈合，要求授權(quán)的寡聚物可以完全按提到的治療炎癥的相同方式給藥。
要求授權(quán)的寡聚物對破壞實體瘤也是有用的。細胞轉(zhuǎn)化常與一體蛋白所有組成部分的性質(zhì)改變有關(guān)(Plantefaber，L.C.and R.O.Hynes(1989)Cell 56281-290)。腫瘤侵入和轉(zhuǎn)移的機制包括在正常的細胞與細胞間以及細胞與底質(zhì)間的相互作用中發(fā)生的復(fù)雜變化，參見(Juliano，R.(1987)Biochim.Biophys.Acta 907261-278;Ruoslahti，E.和F.G.Giancotti(1989)Cancer Cells 1119-126;Albeda和Buck，1990，supra;Hynes，R.U.(1992)Cell 6911-15，supra).
腫瘤發(fā)展過程是復(fù)雜的并且在腫瘤發(fā)展的不同時期需要亞性細胞表現(xiàn)增加或減少粘合的性質(zhì)，參見(Ruoslahti和Giancotti(supra);Edelman，G.M.和K.L.Crossin(1991)Annu.Rev.Biochem.60155-190;Edelman，G.M.et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci USA 848502-8506).
腫瘤細胞要轉(zhuǎn)移，必須首先附著在血管的細胞外基質(zhì)上。要求授權(quán)的寡聚物抑制細胞與基質(zhì)的粘合。因此，若用寡聚物處理會防止腫瘤細胞相互粘合，從而使腫瘤分解。然后未粘合的腫瘤細胞被免疫系統(tǒng)消除。而且，因為未粘合的腫瘤細胞不能附著便不會引起轉(zhuǎn)移，并可回變?yōu)闆]有腫瘤形成可能性的正常表型。因此，要求授權(quán)的寡聚物可用于治療實體瘤的方法中，它包括施用足夠能引起實體腫瘤溶解的一定量的要求授權(quán)的寡聚物。實體瘤可以是轉(zhuǎn)移腫瘤。
再者，本發(fā)明的寡核苷酸當(dāng)依照已知的技術(shù)方法固定在固體支持物上時，可用于寡核苷酸分離及其自身對NF-kBDNA或RNA的檢測。本發(fā)明用于診斷的寡核苷酸可根據(jù)已知的技術(shù)方法用一個作為信號的部分標(biāo)記，如放射性同位素、酶、熒光化合物。
本發(fā)明用下列實施例進行解釋，這些實施例的目的只是為了解釋而不是以任何方式限制本發(fā)明。
實施例方法1反義寡核苷酸寡核苷酸的硫類似物根據(jù)出版的會議記錄(Matsukura，M.et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 847706-7710).已用一臺自動合成儀合成(model 394，Applied Biosystems，foster city，CA)。寡聚物由Nurayanan等(1992)(supra)純化，他們作了這樣的改變寡聚物在用無水乙醇洗滌前使用醚常規(guī)反復(fù)萃取(6次)。細胞經(jīng)胰蛋白酶消化，與寡聚物(30μm)混合后象前面描述的那樣放入不同的ECM-覆蓋的皿中24小時至2周(Ito，E.etd.(1989)Oncogene 41193-1199)。在某些實驗中每48小時加入一次寡聚物。在某些實驗中，在寡聚物加入前先植入細胞并允許其粘合。反義寡聚物實驗要用分別制備的寡聚物重復(fù)3到4次。可使用不同代的細胞。
方法2細胞培養(yǎng)將鼠ES細胞(CCE-24，L.Robertson，Columbia University)常規(guī)生長在含15%加熱滅活過的胎牛血清(FBS)、10μg/ml的人白細胞抑制因子(LIF)(UBI，Lake Placid，NY)和4.5×10-4M的單硫甘油的Dulbecco's改良的Eagle's培養(yǎng)基(DMEM)中，培養(yǎng)皿覆蓋有1%的明膠。移去LIF并在無LIF培養(yǎng)基中再培養(yǎng)6到8天，細胞開始分化。NIH 3T3、Rat-1、PC-12(ATCC CRL 1721)和S-17細胞株用Narayanan等[(1992)，supra]描述的方法維持。原代人血管內(nèi)皮細胞(HUVECs)和原代角化細胞從Clonetech Inc.Palo alto，CA獲得。RHEK-1細胞用Rhim，J.S.等所述方法[(1986)Science232385-388]維持。細胞外基質(zhì)(ECM)是從喂養(yǎng)層成纖維細胞建立的，它是通過用含3.5×10-4M NH4OH的0.5%Triton X-100溶液在室溫溶解融合的培養(yǎng)物5分鐘，然后用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗三次。
方法3PCR分析RT-PCR是用前述方法(Narayana等(1992)，Supra)完成的。
P65的引物 (1)5'GCG GCC AAG CTT AAG ATC TGC CGA GTA AAC3'和(2)5'CGC TGC TCT AGA GAA CAC AAT GGC CAC TTG CCG 3'限定了一個150bp的擴增子。p50的引物 (1)5'AAA GGT TAT CGT TCA GTT 3'和(2)5'TTG TAG ATA GGC AAG GTC 3'限定了一個250bp的擴增子。GAPDH引物已有描述[Narayanan，et al(1992)Supra]。細胞因子受體順序也有描述[Schmitt，R.M.等(1991)Genes Dev.5728-740]。
方法4質(zhì)粒構(gòu)建m-P65 cDNA的一個350bp片段從NIH 3T3細胞cDNA中用RT-PCR方法克隆，包含起始密碼子ATG。PCR引物包括(1)5'ACC GCT CGA GCT AGC CCG GGA CCC TGA CCA TGG AC3'和(2)5'CCG GAA TTC GCT AGC GCT TCA CAC ACT GGA TCC CCA GG 3'并且擴增片段插入MAM-Neo-CAT載體(Narayanan etd.(Supra))的NheI部位。有意義及反義克隆通過限制性分析來表示其特性并用測序證實。超螺旋質(zhì)粒DNAs用電穿孔的方法轉(zhuǎn)染PC-12細胞[Reiss et al，Biochem and Biophysical Res.Comm.137，244(1986)]。
方法5分離RNARNA用RNAzol用-B(Cinna Biotecx，F(xiàn)riendswood，Texas)分離。Northern blot用前述的方法完成(Narayanan et al，supra)。
實施例1細胞粘合分析證明要求授權(quán)的寡聚物的效用。合成了NF-kB個別亞基修飾的偶磷-硫寡核苷酸(表Ⅰ)。
基因 種類 序列(5'至3') 參考文獻P65-S 鼠 ACC ATG GAC GAT CTG TTT CCC CTC 3P65-AS 鼠 GAG GGG AAA CAG ATC GTC CAT GGT 3P65-S 人 GCC ATG GAC GAA CTG TTC CCC 4P65-AS 人 GGG GAA CAG TTC GTC CAT GGC4P50-S 鼠 ACC ATG GCA GAC GAT GAT CCC 1P50-AS 鼠 GGG ATC ATC GTC TGC CAT GGT1P50-S 人 AGA ATG GCA GAA GAT GAT CCA 2P50-AS 人 TGG ATC ATC TTC TGC CAT TCT2表Ⅰ.實施例中使用的偶磷-硫寡聚物。寡核苷酸順序相應(yīng)于各自的mRNA的5′端并包含起始密碼上游區(qū)的3-4個核苷酸。
用鼠ES細胞來檢測NF-kB的p50及p65亞基的抑制作用。ES細胞在白血病抑制因子(LIF)存在時不分化，但從培養(yǎng)基中去除LIF后開始分化。在分化的和未分化的ES細胞中都加入p65反義寡聚物會使細胞從覆蓋有明膠的培養(yǎng)皿上完全分離，而對照的有意義p65寡聚物對ES細胞的粘合無任何影響。實驗的細胞消化后與p65的寡聚物混合(30μM)，再植入覆蓋有明膠的培養(yǎng)皿，并在培養(yǎng)72小時后拍照以觀察結(jié)果。
p50反義寡聚物依賴于ES細胞的分化狀況表現(xiàn)出激動人心的作畫用對ES未分化細胞，p50反義寡聚物沒有作用。除去LIF六天后使ES細胞分化，這時加入p50反義寡聚物會引起細胞完全分開，這與p65反義寡聚物作用相同。與上面相似，胰酶消化的細胞(分化或未分化的)與p50寡聚物(30μM)混合并植入覆蓋明膠的培養(yǎng)皿上并拍照。其中分化的ES細胞的狀況用不同細胞因子受體(如Epo-R，C-kit，G-CSF-R，和CSF-1R)的上調(diào)來檢測。與反義寡聚物分離的細胞用臺盼蘭排斥法可看出細胞的存活，并在反義寡聚物存在的情況下繼續(xù)生長兩至三周(寡聚物每48小時換一次)。這些反義寡聚物對ES細胞粘合的作用是高度專一性的，并且不是由于非專一性毒性。許多沒有關(guān)系的反義寡聚物對ES細胞粘合沒有這樣的作用。反義寡聚物處理的ES細胞在懸液中長成聚集體，與ES細胞在甲基纖維素培養(yǎng)基中生長情況相似。
(Wiles，M.V.和G.Keller(1991)Development 111259-267).
此外，反義p50和p65的作用是短暫的，當(dāng)沒有新寡聚物存在時，反義寡聚物處理的ES細胞保持其分化或未分化形態(tài)。這些結(jié)果表明NF-kB在細胞與基質(zhì)粘合中起重要作用，因此阻止NF-kB使其不能細胞粘合。
實施例2未分化的ES細胞在p65寡聚物(30μM)存在下進行培養(yǎng)。細胞72小時后經(jīng)胰酶消化，再植入纖粘蛋白(10μg/ml)或?qū)诱尺B蛋白(10μg/ml)覆蓋的培養(yǎng)皿中并拍照作為對照。
在p65反義寡聚物存在下，植在纖粘蛋白、層粘連蛋白或膠原蛋白上的ES細胞是完全分開的。
但是，當(dāng)ES細胞植在溶解的喂養(yǎng)層細胞產(chǎn)生的ECM上時，p65反義寡聚物的分散作用完全消失。其它一些粘合分子是由喂養(yǎng)細胞的總ECM提供的，而不依賴于NF-kB的作用。未分化的ES細胞在p65寡聚物(30μM)存在的情況下培養(yǎng)。細胞72小時后經(jīng)胰酶消化再植在膠原IV型(5μg/ml)或由溶解3T3喂養(yǎng)細胞產(chǎn)生的ECM上，并拍照作分析。
P65反義寡聚物對ES細胞粘合的作用是很快的僅五小時內(nèi)，p65反義處理的細胞便在其粘合性質(zhì)上發(fā)生戲劇性的變化。未分化ES細胞在無寡聚物存在下在覆蓋有明膠的培養(yǎng)皿上培養(yǎng)72小時。然后傾去培養(yǎng)基，在附著的細胞里加入含有30μM反義或有意義p65的新培養(yǎng)基。標(biāo)出一個區(qū)域立即拍照(0時)，5小時后進行光學(xué)分析。最好，這些細胞在12到14小時內(nèi)完全分開，而p65有意義或p50反義寡聚物直到二個星期仍對未分的ES細胞的粘合沒有任何作用。
在另一個實驗中，分離總RNA并用RT-PCR分析p65、p50和GAPDH的表達。
RT-PCR顯示未分化和分化的ES細胞在p65反義存在下培養(yǎng)72小時后，p65反義寡聚物均阻止了p65mRNA的表達，而在這些細胞中的p50和管家酶GAPDH的表達卻不受影響。相似地，p50反義寡聚物無論ES細胞分化與否均抑制p50 mRNA的表達，而對p65或GAPDH的mRNA表達沒有影響。這些結(jié)果表明P65與p50反義寡聚物對ES細胞粘合的作用應(yīng)歸于對各自mRNA表達的選擇性抑制作用。
p65反義寡聚物可使各種各樣的細胞株及原代細胞完全分開，其作用是順序的并具種屬專一性。反義p50對表Ⅱ的細胞沒有作用。這些結(jié)果有力地支持了NF-kB的多效性作用以及NF-kB的p65亞基在細胞粘合過程中更特殊的作用。
表Ⅱ細胞株 細胞類型 反義寡聚物1,2,3鼠3T3喂養(yǎng)物 成纖維 mp65細胞(原)RAT-1 成纖維 mp65NIH3T3 成纖維 mp65S-17 骨髓基質(zhì)細胞 mp65PC-12 嗜鉻細胞瘤 mp65人原代 內(nèi)皮 hp65RHEK-1 上皮 hp65原代角化細胞 上皮 hp651)反義寡聚物對細胞粘合的抑制作用是種屬特異性的。2)相應(yīng)的有意義寡核苷酸沒有作用。3)p50反義或有意義寡聚物不抑制這些細胞的粘合。
表Ⅱ.p65的反義寡聚物抑制多個細胞株的粘合。鼠與人的多種細胞株，包括成纖維細胞、基質(zhì)細胞、神經(jīng)元細胞、內(nèi)皮細胞及上皮細胞，暴露于30μM人或鼠的p65寡聚物中并于48到72小時后拍照。在所列的每一個細胞株中都觀察到對細胞粘合的顯著作用。
實施例3為了確證p65反義寡聚物對細胞粘合的作用，我們使用了一種能利用MAM-Neo-CAT載體[Narayanan et al，(1992)(supra))表達經(jīng)氟甲強的松龍誘導(dǎo)的p65反義寡聚物的穩(wěn)定PC-12細胞株，并且建立了反義的和有意義的(作為對照)兩種PC-12細胞轉(zhuǎn)染體(transfectant)。在幾個獨立克隆中發(fā)現(xiàn)了高水平的經(jīng)氟甲強的松龍誘導(dǎo)的p65反義RNA。對照組的有意義克隆在用氟甲強的松龍(1×10-6M)處理72小時后，自24小時開始重接種并拍照，發(fā)現(xiàn)細胞粘合性質(zhì)沒有改變。反義p65克隆在沒有氟甲強的松龍存在時表現(xiàn)正常的形態(tài)，但經(jīng)氟甲強的松龍誘導(dǎo)后，p65反義RNA對細胞與基質(zhì)的粘合產(chǎn)生重大影響，這與這些細胞中p65反義寡聚物的作用相似。從這些反義克隆中移去氟甲強的松龍后，細胞又回復(fù)正常形態(tài)。
P65反義寡聚物對細胞粘合的抑制作用可用于被試細胞類型的回復(fù)，為NF-kB復(fù)合物對細胞粘合的多效性需要提供依據(jù)。個別的ECMs，如纖連蛋白、層粘連蛋白或膠原蛋白不能克服由NF-kB作用調(diào)節(jié)的對CAMs的需要。然而，由喂養(yǎng)層細胞溶解產(chǎn)物產(chǎn)生的ECMs具有補充細胞粘合中對NF-kB作用的需要的能力。這說明不依賴于NF-KB的CAMs也可能介入細胞粘合。
在穩(wěn)定的PC-12反義轉(zhuǎn)染體中看到依賴于氟甲強的松龍的對細胞與基質(zhì)間粘合的抑制作用，此PC-12反義轉(zhuǎn)染體對誘導(dǎo)的p65反義RNA高表達。反義寡聚物同p65反義RNA一樣使PC-12細胞與基質(zhì)分離生長成為聚集體。P65的表達要能對細胞與基質(zhì)間粘合作用的抑制遠大于對細胞與細胞間粘合作用的抑制。
P50反義寡聚物對p50 mRNA的抑制作用除在ES細胞系統(tǒng)有明顯作用外，對其它多種細胞型沒有作用。未分化ES細胞的粘合不受P50表達抑制的影響，但在分化ES細胞中，與反義p65的作用相同，對p50 mRNA的抑制導(dǎo)致對粘合的顯著抑制。結(jié)果表明在分化ES細胞中，NF-kB的p65亞基能與除p50外的一些亞基復(fù)合或作為同一二聚體來起作用。我們的觀察進一步證實，在不同細胞型中只由p65表達的抑制能對細胞粘合產(chǎn)生巨大的作用。在這些條件下p50表達不受影響。而在正常細胞中，p65在調(diào)節(jié)參與細胞粘合的不同基因中起基本作用，而只與胞漿抑制蛋白Ⅰ(Baeuerle，P.A.and D.Baltimore(1988)Science 242540-546)復(fù)合也不能起作用。
實施例4惡性細胞在腫瘤演進過程中表現(xiàn)粘合下降。(Ruoslathi和Giancotti(supra);Edelman et al.(1987和1991)，supra).
反義p65對NF-kB的抑制作用也抑制腫瘤細胞生長。體外結(jié)果表明，ras轉(zhuǎn)化的細胞其轉(zhuǎn)化后表型受所用p65反義寡聚物的抑制。在這個實驗中，K-ras轉(zhuǎn)化的BALB/C 3T3細胞(ATCC CCL163.3)用p65的有意義或反義寡聚物處理，并在第十天測定其在軟瓊脂中的生長。
然后，將K-ras轉(zhuǎn)化的BALB/C 3T3細胞在體內(nèi)穩(wěn)定表達有意義和反義RNA的細胞株用來證明對腫瘤的抑制作用，此細胞株如實施例3所述用氟甲強的松龍可誘導(dǎo)的載體來制備。反義克隆顯示依賴于氟甲強的松龍的對P65 mRNA表達的抑制作用并且在瓊脂中不能形成克隆，而對照組有意義克隆無上述現(xiàn)象。K-ras mRNA的表達在這些反義克隆中不被抑制。
最后，這些表達反義RNA的克隆植入裸鼠中，小鼠用或不用氟甲強的松龍?zhí)幚怼．?dāng)用氟甲強的松龍?zhí)幚頃r，反義克隆表現(xiàn)出完全喪失腫瘤形成能力。此外，不用氟甲強的松龍?zhí)幚淼膸в蟹戳x克隆的荷瘤小鼠，在用氟甲強的松龍?zhí)幚砗竽[瘤完全消退。
更特別地是，對照組有意義克隆在7到10天內(nèi)，在裸鼠的注射區(qū)域很快長出腫瘤，無論氟甲強的松龍存在與否，在2至4周內(nèi)腫瘤不斷增大。在氟甲強的松龍存在下，反義p65比有意義p65產(chǎn)生的腫瘤生長緩慢得多(4到6倍)。再者，在無氟甲強的松龍存在下，兩周內(nèi)反義克隆產(chǎn)生的腫瘤，當(dāng)小鼠用含氟甲強的松龍的水喂養(yǎng)一至兩周后，腫瘤完全消退。并且小鼠在兩個月內(nèi)不長腫瘤。與此相反，對照組有意義克隆產(chǎn)生的腫瘤繼續(xù)生長，在四至六周內(nèi)殺死宿主。
基于p65反義RNA對致瘤性的結(jié)果，鼠p65反義寡聚物可用于對付裸鼠腫瘤。使用兩種寡聚物給藥方式皮下注射，每次1.4mg寡核苷酸，每周兩次;定時釋放(14天)的Alza泵(Alza Corporetion，Palo alto，Calif.)，其中含2.8mg寡核苷酸。兩種小鼠腫瘤細胞株K-BALB(纖維肉瘤)細胞和B-16(黑色素瘤)細胞(ATCC CRL 6322)被選來在注射部位形成侵入腫瘤。當(dāng)小鼠用有意義寡聚物處理時，無論哪種給藥方式腫瘤均快速生長。與此相比，用反義p65治療的小鼠70%以上腫瘤體積明顯縮小(3至5倍)。在帶有B-16黑色素瘤的免疫未受損害的同系小鼠中，在p65反義寡核苷酸治療下腫瘤體積也明顯縮小。p65 mRNA在用有意義寡聚物治療的裸鼠的B-16黑色素瘤中可看到其表達，但用反義寡聚物治療的卻看不到p65 mRNA表達。NF-kB樣結(jié)合活性用對照的有意義p65寡核苷酸治療的K-B ALB和B-16細胞的核提取物來檢測，此活性能被超過30倍體積克分子濃度的冷寡核苷酸對抗。與之相比，此活性在p65反義寡聚物處理的細胞中受到顯著抑制。用放射性標(biāo)記的p65有意義及反義寡聚物進行實驗，注射后72小時檢測到腫瘤中有2-4%的輸入放射活性用p65反義寡聚物治療的小鼠進行二周的療程后未看到明顯的血液學(xué)(haemotologic)血清化學(xué)或骨髓的變化。
序列表(1)一般數(shù)據(jù)(i)申請人:
(A)姓名:霍夫曼拉羅奇AG(B)街道:Grenzacherstrasse124(C)城市:Basle(D)州:BS(E)國家:瑞士(F)郵政編碼(ZIP):CH-4002(G)電話:061-6882511(H)電傳:061-6881395(I)電報:962292/965542hlrc(ii)發(fā)明題目:F-KappaB反義多核苷酸(iii)序列號:4(iv)計算機可讀形式:
(A)中型號:Floppy盤(B)計算機:IBMPC(C)操作系統(tǒng):PC-DOS/MS-DOS(D)軟件:PatentInRelease#1.0,Version#1.25(EPO)(vi)優(yōu)先申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?US07/950531(B)申請日期:1992.9.23(2)SEQIDNo.1數(shù)據(jù):
(i)序列特征:
(A)長度:21個堿基對(B)類型:核酸(C)股數(shù):單鏈(D)拓撲學(xué):線性(ii)分子類型:cDNA(iii)假設(shè):無(iv)反義:無(xi)序列說明:SEQIDNo:1:
GCCATGGACGAACTGTTCCCC
(2)SEQIDNo.2數(shù)據(jù):
(i)序列特征:
(A)長度:21個堿基對(B)類型:核酸(C)股數(shù):單鏈(D)拓撲學(xué):線性(ii)分子類型:cDNA(iii)假設(shè):無(iv)反義:無(xi)序列說明:SEQIDNo:2:
AGATGGCAGAAGATGATCCA(2)SEQIDNo.3數(shù)據(jù)(i)序列特征:
(A)長度:21個堿基對(B)類型:核酸(C)股數(shù):單鏈(D)拓撲學(xué):線性(ii)分子類型:DNA(iii)假設(shè):無(iv)反義:有(xi)序列說明:SEQIDNo:3GGGGAACAGTTCGTCCATGGCSEQIDNo.4的數(shù)據(jù):
(i)序列特征:
(A)長度:21個堿基對(B)類型:核酸(C)股數(shù):單鏈(D)拓撲學(xué):線性(ii)分子類型:DNA(iii)假設(shè):無(iv)反義:有(xi)序列說明:SEQIDNo:4TGGATCATCTTCTGCCATTCT
權(quán)利要求
1.包含或由一個核苷酸順序組成的寡核苷酸，其特征在于它具有與編碼人NF-kB轉(zhuǎn)錄因子的一部分基因雜交的能力，而且當(dāng)此寡核苷酸與所述的那部分基因雜交后會阻止NF-kB轉(zhuǎn)錄因子的合成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的寡核苷酸，其中編碼NF-kB轉(zhuǎn)錄因子的基因是mRNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的寡核苷酸，其長度為5到50個核苷酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一權(quán)項的寡核苷酸，其中NF-kB轉(zhuǎn)錄因子的p65亞基的部分基因具有與SEQ ID No1相同的序列或它的互補序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一權(quán)項的寡核苷酸，其中該寡核苷酸含有與SEQ ID No3相同的序列或它的具有SEQ ID No1序列的互補序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一權(quán)項的寡核苷酸，其中NF-kB轉(zhuǎn)錄因子p50亞基的部分基因具有與SEQ ID No2相同的序列或它的互補序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、或6中任一權(quán)項的寡核苷酸，其中該寡核苷酸含有與SEQ ID No4相同的序列或它的具有SEQ ID No2序列的互補序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一權(quán)項的寡核苷酸，其中該核甘酸由分子式為-O-P(＝O)(Y)-O-的磷酸酯基因連接，這里的Y為甲基、氧或硫。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一權(quán)項的寡核苷酸，在疾病治療中用作治療活性化合物。
10.制備權(quán)利要求1-8中任一權(quán)項的寡核苷酸的方法，其特征在于將固體支持物連接、保護的通過固相合成的相應(yīng)核苷酸序列的寡核苷酸脫保護、從固體支持物上解離下來，和如果需要的話，再進行修飾。
11.一種藥用組合物，它至少含有權(quán)利要求1-8中任一權(quán)項的寡核苷酸，如果合適的話，還可含有治療上可接受的載體物質(zhì)。
12.將權(quán)利要求1-8中任一權(quán)項的寡核苷酸用于制備藥用組合物。
13.將權(quán)利要求1-8中任一權(quán)項的寡核苷酸用于治療疾病的藥物的制造。
全文摘要
本發(fā)明公開了能與編碼NF-KB的基因雜交的寡聚物。
文檔編號A61K31/70GK1084564SQ9311783
公開日1994年3月30日 申請日期1993年9月22日 優(yōu)先權(quán)日1992年9月23日
發(fā)明者R·那拉亞南, C·A·羅森 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司