專利名稱：治療核苷的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及某些新的2′-脫氧-4′-硫代-嘌呤核苷，它們的生理機能衍生物，它們的制備方法，含有它們的藥物制劑和在治療中，尤其在病毒感染的治療或預(yù)防中的應(yīng)用。
在DNA病毒中，皰疹族的病毒是人類最常見的病毒性疾病的起因。該族包括皰疹單式病毒(HSV)、水痘帶狀皰疹病毒(VZV)、細(xì)胞肥大病毒(CMV)、EB病毒(EBV)和人體皰疹病毒6(HHV6)。HSV1和HSV2是人類的一些最常見的感染因素。大部分這些病毒能夠存在于宿主的神經(jīng)細(xì)胞中;一旦被感染后，個體則處于感染的復(fù)發(fā)臨床表現(xiàn)的危險之中，這會導(dǎo)致身體上和心理上的痛苦。
HSV感染經(jīng)常是以皮膚、口和/或生殖器的廣泛的和衰弱的損害為特征。初次感染會是臨床癥狀不明顯的，雖然它們趨向于變得比先前暴露于病毒的個體的感染更嚴(yán)重。HSV引起的眼部感染會導(dǎo)致角膜感染會導(dǎo)致角膜炎或白內(nèi)障，因而危害宿主的視力。在新生兒和免疫損害的病人(包括AIDS病人)中的感染或感染滲透到中樞神經(jīng)系統(tǒng)被證實會導(dǎo)致死。
病毒的傳染是通過宿主和受體的直接身體接觸進行的，因而，HSV感染的擴散被認(rèn)為是一個非常重要的社會問題，尤其是在目前還無法獲得有效的疫苗的情況下。
水痘帶狀皰珍病毒(VZV)是引起水痘和帶狀皰疹的皰疹病毒。水痘是在沒有免疫的宿主中產(chǎn)生的主要疾病，對于幼童來說通常是一種輕度的疾病，其癥狀為泡狀疹和發(fā)燒。帶狀皰疹是疾病的復(fù)發(fā)形式，其出現(xiàn)于先前感染過水痘帶狀皰疹病毒的成人。帶狀皰疹的臨床表現(xiàn)為神經(jīng)痛和分布單側(cè)皮膚的泡狀皮疹。炎癥的擴散會引起麻痹或驚厥。如果腦膜被損壞會出現(xiàn)昏迷。在免疫缺乏患者中，VZV會傳播引起嚴(yán)重的或甚至致死的疾病。VZV與為移植或治療惡性腫瘤而接受免疫抑制藥物的患者有重要的關(guān)系，并且是由于其損壞的免疫系統(tǒng)引起的獲得性免疫缺乏綜合癥(AIDS)患者的嚴(yán)重的并發(fā)癥。
與其他皰疹病毒一樣，CMV感染導(dǎo)致了病毒和宿主的終身關(guān)系，在初次感染后，病毒會散發(fā)許多年。由于妊娠期間母親的感染而引起的先天性感染會導(dǎo)致如下臨床結(jié)果，如死亡或嚴(yán)重的疾病(小頭、肝脾腫大、黃疸、精神發(fā)育遲緩)、導(dǎo)致失明的視網(wǎng)膜炎或在不太嚴(yán)重的情況下，發(fā)育遲緩和易受胸廓和耳朵感染。在免疫損害的患者中，如由于惡性腫瘤、由于移植過程而用免疫抑制藥物進行治療或感染了人體免疫缺乏病毒(HIV)，CMV感染會引起視網(wǎng)膜炎、肺炎、胃腸失調(diào)和神經(jīng)疾病。由于CMV以潛體形式存在于50-80%的成人人體中，并且在免疫損害的患者中會再活化，因此AIDS患者的CMV感染是發(fā)病的主要原因。
EB病毒(EBV)引起傳染性的單核細(xì)胞增多癥和毛狀粘膜白斑病，其也被認(rèn)為是人體癌癥，如鼻咽癌、免疫母細(xì)胞性淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤的病原因素。
HHV6已被證實是腎和骨髓移植患者的腎排斥和間質(zhì)性肺炎的病原因素。其也被證實抑制了骨髓移植患者的干細(xì)胞計數(shù)。
另一類世界范圍內(nèi)最重要的病毒病原體是肝炎病毒，尤其是B型肝炎病毒(HBV)。HBV與原發(fā)的肝細(xì)胞性癌有病原學(xué)上的關(guān)系，被認(rèn)為導(dǎo)致了全世界80%的肝癌。在美國每年有超過一萬人因為HBV疾病而住院，并且平均有250人死于暴發(fā)性的疾病。據(jù)估計美國有500，000-1000000傳染性帶菌者。通常超過25%的帶菌者發(fā)展為慢性肝炎，并常常變?yōu)楦斡沧?。HBV感染的臨床反應(yīng)包括頭痛、發(fā)燒、不適、惡心、嘔吐、厭食和腹痛。病毒的復(fù)制通常經(jīng)持續(xù)數(shù)周或數(shù)月的恢復(fù)過程通過免疫應(yīng)答來控制，但感染可能是更嚴(yán)重的會導(dǎo)致上文所述的持續(xù)的慢性肝炎。
在RNA病毒中，近年來逆轉(zhuǎn)錄病毒被認(rèn)為尤其重要。逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)成RNA病毒的亞族，為了進行復(fù)制首先必須把基因組的RNA逆轉(zhuǎn)錄成DNA(“轉(zhuǎn)錄過程”通常描述為由DNA合成RNA)。一旦呈DNA形式，病毒基因組被摻入宿主細(xì)胞基因組，使其利用宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄/翻譯機制進行復(fù)制。一旦摻入后，事實上難以區(qū)分病毒DNA和宿主DNA，在這種狀態(tài)下，病毒可以與細(xì)胞壽命同樣長的時間存在。
一種逆轉(zhuǎn)錄病毒，人體免疫缺乏病毒(HIV)已經(jīng)可重復(fù)地從患有AIDS或常常具有AIDS前癥狀的病人體中分離獲得。AIDS是免疫抑制或免疫破壞疾病，其使患者易感染致死的機會致病菌的感染。在特征上AIDS與T-細(xì)胞，尤其是帶有OKT4表面標(biāo)記的輔助誘導(dǎo)細(xì)胞群的漸進排除有關(guān)。HIV是細(xì)胞病變的，顯示優(yōu)先感染和破壞帶有OKT4標(biāo)記的T-細(xì)胞，因而目前人們普遍認(rèn)為HIV是AIDS的病原體。
另一類被認(rèn)識作為日益嚴(yán)重的國際健康問題的病原因素的RNA病毒是非A、非B型肝炎病毒。至少80%的慢性輸血后非A、非B型肝炎已被證實是由于目前鑒定為C型肝炎的病毒，在臨床對于血制品進行的B型肝炎篩選過程中發(fā)現(xiàn)事實上所有輸血后肝炎可能都是由這種病毒引起的。而約一半的急性C型肝炎感染都是在幾個月后自身消散，其余的變?yōu)槁?，即使不是全部但是許多這類慢性活性肝炎接著發(fā)生的是潛伏的硬變和肝細(xì)胞性癌。C型肝炎病毒基因組的結(jié)構(gòu)最近已被闡明，病毒的特征為與黃色病毒類似種類的單鏈RNA。
柯薩奇病毒屬于腸道病毒屬，它們具有包含在二十面體核苷中的單鏈RNA基因組?？滤_奇病毒感染愈來愈被認(rèn)為是成人和幾童原發(fā)心肌炎的病因。
柯薩奇感染還與腦膜炎、胸膜痛、皰疹性咽峽炎、手足和口疾病、呼吸疾病、眼病、糖尿病和病毒后疲勞綜合癥有關(guān)。在上述的后幾種病例中病毒RNA在肌肉和menocytes中被檢測到。
歐洲專利說明書No.EP-A-421777和No.EP-A-409575披露了某些4’硫代-嘧啶核苷和它們作為抗病毒劑的應(yīng)用。
如下式(Ⅰ)的化合物落入國際專利說明書No.W091/04033公開的化合物的寬范圍內(nèi)，但該說明書沒有特別披露式(Ⅰ)化合物或它們在治療病毒感染中的應(yīng)用。
我們?nèi)缃耋@訝地和出乎意料地發(fā)現(xiàn)，如下式(Ⅰ)化合物和其生理機能衍生物和其任何的溶劑化物適宜于作為抗病毒劑。
因此，本發(fā)明提供了式(Ⅰ)化合物
其中R1表示-鹵素、-NR2R3，其中R2和R3可以是相同的或不同的，每個代表H、C1-6烷基、C3-6環(huán)烷基、C2-6烯基、苯基或苯基C1-3烷基(其中苯基部分可任意地被選自鹵素、C1-6烷氧基、硝基、氰基、氨基和C1-6烷基的一個或多個取代基取代)，或R2R3和與它們相連的N原子連接在一起形成3-、4-、5-、6-或7-元雜環(huán)，所述雜環(huán)除上述N原子外還任意地含有一個或多個任意地選自O(shè)和N的雜原子;
-S(＝O)nR4，其中n為0、1或2，R4代表C1-6烷基、C3-6環(huán)烷基、C3-6環(huán)烷基C1-3烷基、C1-4烷氧基、苯基或苯基C1-3烷基(其中苯基部分可任意地被選自鹵素、C1-6烷氧基、硝基、氰基、氨基和C1-6烷基的取代基取代)，或當(dāng)n為0時，R4代表H;-S(＝O)mOR4a，其中m為0、1或2，R4a代表C1-6烷基、C3-6環(huán)烷基、C3-6環(huán)烷基C1-3烷基、C1-4烷氧基、苯基或苯基C1-3烷基(其中苯基部分可任意地被選自鹵素、C1-6烷氧基、硝基、氰基、氨基和C1-6烷基的取代基取代);
-OR5，其中R5代表C1-6烷基、C3-6環(huán)烷基、C3-6環(huán)烷基 C1-3烷基、苯基或苯基C1-3烷基(其中苯基部分可任意地被選自鹵素、C1-6烷氧基、硝基、氰基、氨基和C1-6烷基的取代基取代);-C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基;
其前提是，當(dāng)R1代表-NR2R3時，R2和R3不同時為H;
或它們的鹽、酯或其他生理機能衍生物或其任何的溶劑化物。
另一方面，本發(fā)明提供了如上式(Ⅰ)的化合物，其中R1表示-NR2R3，其中R2和R3可以是相同的或不同的，每個代表H、C1-6烷基、C3-6環(huán)烷基、苯基或苯基C1-3烷基(其中苯基部分可任意地被選自鹵素、C1-6烷氧基、硝基、氰基、氨基和C1-6烷基的一個或多個取代基取代);或R2R3和與它們相連的N原子連接在一起形成3-、4-、5-、6-或7-元雜環(huán)，所述雜環(huán)除上述N原子外還任意地含有一個或多個任意地選自O(shè)和N的雜原子;-S(＝O)nR4，其中n為0、1或2，R4代表C1-6烷基、C3-6環(huán)烷基、C3-6環(huán)烷基C1-3烷基、C1-4烷氧基、苯基或苯基C1-3烷基(其中苯基部分可任意地被選自鹵素、C1-6烷氧基、硝基、氰基、氨基和C1-6烷基的取代基取代)，或當(dāng)n為0時，R4代表H;-S(＝O)mOR4，其中m為0、1或2，R4代表C1-6烷基、C3-6環(huán)烷基、C3-6環(huán)烷基C1-3烷基、C1-4烷氧基、苯基或苯基C1-3烷基(其中苯基部分可任意地被一個或多個選自鹵素、C1-6烷氧基、硝基、氰基、氨基和C1-6烷基的取基取代);
-OR5，其中R5代表C1-6烷基、C4-6環(huán)烷基、C3-6環(huán)烷基 C1-3烷基、苯基或苯基C1-3烷基(其中苯基部分可任意地被一個或多個選自鹵素、C1-6烷氧基、硝基、氰基、氨基和C1-6烷基的取基取代);
其前提是，當(dāng)R1代表-NR2R3時，R2和R3不同時為H;
或它們的鹽、酯或其他生理機能衍生物或其任何的溶劑化物。
本發(fā)明還進一步提供了式(Ⅰ)的化合物，其中R1代表鹵素;-OR5，其中R5代表C1-6烷基、C3-6環(huán)烷基、C3-6環(huán)烷基C1-3烷基;-NR2R3，其中R2和R3可以是相同的或不同的，每個代表H、C3-6環(huán)烷基、C1-6烷基或C2-6烯基，或R2、R3和與它們相連的N原子一起形成4-、5-或6-元雜環(huán)，所述雜環(huán)任意地含有除上述N原子外的一個或多個任意地選自O(shè)和N的雜原子;-S(＝O)nR4，其中n為0和R4表示H、C1-6烷基、C3-6環(huán)烷基、C3-6環(huán)烷基C1-3烷基;
其前提是，當(dāng)R1為-NR2R3時，R2和R3不同時為H;
或其的鹽、酯或其他生理機能衍生物或其任何的溶劑化物。
本發(fā)明的優(yōu)選化合物包括如下化合物，其中R1代表鹵素;-OR5，其中R5代表C1-4烷基、C3-6環(huán)烷基、C3-6環(huán)烷基C1-3烷基;-NR2R3，其中R2是H或C1-3烷基和R3為C3-6環(huán)烷基、C1-6烷基、C2-6烯基;或R2、R3和與它們相連的N原子一起形成4-、5-或6-元雜環(huán)，所述雜環(huán)任意地含有除上述N原子以外的一個或多個任意地選自O(shè)和N的雜原子;-S(＝O)nR4，其中n為0和R4表示H或C1-6烷基;或其的鹽、酯或其他生理機能衍生物或其任何的溶劑化物。在這些化合物中，優(yōu)選的是如下化合物，其中R1代表-NR2R3，其中R2為H，R3為C3-6環(huán)烷基。
尤其優(yōu)選的式(Ⅰ)化合物包括如下化合物，其中R1代表-OR5，其中R5代表甲基、乙基、丙基、環(huán)丙基、環(huán)丙基甲基;-NR2R3，其中R2是H或甲基，R3為環(huán)丙基、乙基、正丙基、異丙基、烯丙基、哌啶基、吡咯烷基、硫基或甲硫基;
或其鹽、酯或其他的生理機能衍生物或其任何的溶劑化物。
具體的優(yōu)選式(Ⅰ)化合物包括2-氨基-6-環(huán)丙基甲氧基-9-(2-脫氧-4-硫代-β-D-紅-五呋喃糖基)-9H-嘌呤;
2-氨基-9-(2-脫氧-4-硫代-β-D-紅-五呋喃糖基)-6-甲氧基-9H-嘌呤;
2-氨基-9-(2-脫氧-4-硫代-β-D-紅-五呋喃糖基)-6-甲硫基-9H-嘌呤;
2-氨基-9-(2-脫氧-4-硫代-β-D-紅-五呋喃糖基)-6-(環(huán)丙基甲基氨基)-9H-嘌呤;
2-氨基-9-(2-脫氧-4-硫代-β-D-紅-五呋喃糖基)-6-(乙基甲基氨基)-9H-嘌呤;
2-氨基-9-(2-脫氧-4-硫代-β-D-紅-五呋喃糖基)-6-異丙基氨基-9H-嘌呤;
2-氨基-9-(2-脫氧-4-硫代-β-D-紅-五呋喃糖基)-6-N-哌啶子基-9H-嘌呤;
2-氨基-9-(2-脫氧-4-硫代-β-D-紅-五呋喃糖基)-6-正丙基氨基-9H-嘌呤;
2-氨基-9-(2-脫氧-4-硫代-β-D-紅-五呋喃糖基)-6-N-吡咯烷基-9H-嘌呤;
2-氨基-9-(2-脫氧-4-硫代-β-D-紅-五呋喃糖基)-6-烯丙基氨基-9H-嘌呤;
或其鹽、酯或其他生理機能衍生物的它們的任何的溶劑化物。
尤其優(yōu)選的式(Ⅰ)化合物包括2-氨基-6-(環(huán)丙基氨基)-9-(2-脫氧-4-硫代-β-D-紅-五呋喃糖基)-9H-嘌呤和其鹽、酯或其他的生理機能衍生物的其任何的溶劑化物。這些化合物尤其用于抵抗動物(該術(shù)語包括人、土拔鼠和鴨)感染HBV和CMV。
本文所用的術(shù)語“烷基”作為基團或基團的一部分指的是直鏈或支鏈烷基。術(shù)語鹵素指的是氯、溴、氟或碘，優(yōu)選的是氯。
式(Ⅰ)化合物和它們的生理機能衍生物和任何的溶劑化物在下文中統(tǒng)稱為本發(fā)明的化合物。
本文所用的術(shù)語“生理機能衍生物”指的是式(Ⅰ)化合物的生理上可接受的鹽、酯或這類酯的鹽或在給藥于受體時能夠提供(直接或間接)這類化合物或其抗病毒活性代謝產(chǎn)物或殘余物的任何其他化合物。例如，在5′位置由潛在地可水解的基團，如?；蛲榛鍻H的H同樣屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
作為生理機能衍生物包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的式(Ⅰ)化合物的優(yōu)選的酯包括羧酸酯，其中酯基的羧酸部分的非羰基部分選自直鏈或支鏈烷基(例如，甲基、正丙基、叔丁基或正丁基)、環(huán)烷基、烷氧基烷基(例如，甲氧基甲基)、芳烷基(例如芐基)、芳氧基烷基(例如，苯氧基甲基)、芳基(例如，苯基，任意地被例如鹵素、C1-4烷基或C1-4烷氧基或氨基取代);磺酸酯，如烷基或芳烷基磺?；?例如甲磺?；?;氨基酸酯(例如，L-異戊氨酰基或L-異亮氨?；?和一、二或三磷酸酯。在這些酯中，除非另有說明，否則任何存在的烷基部分一般含有1-18個碳原子，尤其是1-6個碳原子，更尤其為1-4個碳原子。在酯中存在的任何環(huán)烷基部分一般含有3-6個碳原子。在該酯中存在的任何芳基部分包含任意取代的苯基。以上任何化合物的任何附注同樣包括了其生理機能衍生物的附注。
對于治療應(yīng)用，式(Ⅰ)化合物的酯應(yīng)是生理上可接受的，然而，生理上不可接受的酯也可發(fā)現(xiàn)用作中間體。所有的酯，包括非生理上可接受的酯也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
式(Ⅰ)化合物的生理上可接受的鹽和其生理上可接受的衍生物的實例包括由合適的堿得到的鹽，例如堿金屬(例如Na或K)、堿土金屬(例如Mg或Ca)、銨和NX4+(其中X是C1-4烷基)的鹽。H原子或氨基的生理上可接受的鹽包括如下酸的鹽，酸包括有機羧酸，如乙酸、乳酸、富馬酸、酒石酸、馬來酸、羥乙磺酸、乳糖酸和琥珀酸;有機磺酸，例如甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸和對-甲苯磺酸和無機酸，如鹽酸。硫酸、磷酸和氨基磺酸。含有羥基的化合物的生理上可接受的鹽由所述化合物的陰離子與合適的陽離子例如Na+NH4和NX4+(其中X是C1-4烷基)組合而成。
對于治療應(yīng)用，式(Ⅰ)化合物的鹽應(yīng)是生理上可接受的，即，其應(yīng)是由生理上可接受的酸或堿得到的鹽。然而，非生理上可接受的酸或堿的鹽也可在生理上可接受的化合物的制備或提純過程中用作，例如中間體。所有的鹽，無論是否從生理上可接受的酸或堿獲得，均在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明還提供用了于治療，尤其是用作抗病毒劑，例如，用于治療或預(yù)防肝炎病毒感染，如HBV感染或皰疹病毒感染，如上文所提到的那些，尤其是CMV、HSV1、HSV2或VZV感染的本發(fā)明的化合物。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了用于治療或預(yù)防逆轉(zhuǎn)錄病毒感染，尤其是HIV感染的本發(fā)明的化合物。
根據(jù)本發(fā)明可被治療或預(yù)防的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的實例包括人體逆轉(zhuǎn)錄病毒感染，例如，人體免疫缺乏病毒(HIV)，例如，HIV-1或HIV-2，和人體T細(xì)胞親淋巴性病毒(HTLV)，例如HTLV-Ⅰ或HTLV-Ⅱ感染。本發(fā)明的化合物尤其適用于治療AIDS和與其有關(guān)的臨床癥狀，如與AIDS相關(guān)的綜合癥(ARC)、進行性發(fā)生的淋巴結(jié)病(RGL)、卡波齊內(nèi)瘤、血小板減少性紫癜;AIDS相關(guān)的神經(jīng)病學(xué)癥狀，如多發(fā)性硬化或熱帶下肢輕癱以及抗HIV抗體陽性和HIV陽性癥狀，包括無癥狀患者的癥狀。
可根據(jù)本發(fā)明治療的其它臨床癥狀的例子包括由上文所述的HIV、HSV1和2、VZV、CMV、EBV、HHV6、HBV、柯薩奇病毒和C型肝炎病毒感染引起的那些癥狀。
本發(fā)明還提供了用于治療或預(yù)防柯薩奇病毒或C型肝炎病毒感染的本發(fā)明的化合物。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供(a)治療或預(yù)防所感染的動物，例如哺乳動物(包括人)的病毒感染的癥狀或效果的方法，其包括用治療有效量的本發(fā)明的化合物治療上述動物。根據(jù)本發(fā)明的特殊實施方案，病毒感染是肝炎感染，尤其是HBV感染或皰疹病毒感染，如CMV、HSV1、HSV2、VZV、EBV或HHV6。
(b)治療或預(yù)防被感染的動物，例如哺乳動物(包括人)的HIV感染的癥狀或效果的方法，其包括用治療有效量的本發(fā)明的化合物治療上述動物。
(c)治療或預(yù)防被感染的動物，例如哺乳動物(包括人)的柯薩奇病毒或C型肝炎病毒感染的癥狀或效果的方法，其包括用治療有效量的本發(fā)明的化合物治療上述動物。
(d)預(yù)防動物，例如哺乳動物(包括人)的病毒感染，尤其是HBV、CMV、HSV1、HSV2、VZV、EBV、HHV6、C型肝炎病毒或柯薩奇病毒感染的方法，其包括用治療有效量的本發(fā)明的化合物治療上述動物。
(e)本發(fā)明的化合物在藥物生產(chǎn)中的應(yīng)用，所述藥物是用于治療或預(yù)防病毒感染，尤其是HBV感染，皰疹病毒感染，包括CMV、HSV1、HSV2、VZV、EBV和HHV6，逆轉(zhuǎn)錄病毒感染，如HIV0感染、C型肝炎病毒感染或柯薩奇病毒感染。
本發(fā)明的化合物可單獨使用或與其它用于治療上述感染或癥狀的治療劑結(jié)合使用。本發(fā)明的結(jié)合治療包括給藥至少一種式(Ⅰ)化合物或其生理機能衍生物和至少一種其他生理上可接受的藥劑。活性成份或生理上可接受的藥劑可一起或單獨地給藥，當(dāng)單獨給藥時，可同時進行或以任何順序進行。為獲得所需的結(jié)合治療效果應(yīng)選擇活性成份和生理上可接受的藥劑的量和給藥的相對時間。優(yōu)選的是，結(jié)合治療包括給藥式(Ⅰ)化合物或其生理機能衍生物和一種下文提到的藥劑。
這類其他的治療劑的實例包括對治療HIV感染或有關(guān)癥狀有效的藥劑，如3’-疊氮-3’-二脫氧胸苷(zidovudine)、其他2’，3’-二脫氧核苷，如2’，3’-二脫氧胞苷、2’，3’-二脫氧腺苷和2’，3’-二脫氧肌苷、carbovir、無環(huán)核苷(例如無環(huán)烏苷)、2’，3’-二脫氫胸苷，蛋白酶抑制劑，如N-叔丁基-脫氫-2-[-2(R)-羥基-4-苯基-3(S)-[[N-(2-喹啉羰基)-L-天冬酰胺?；鵠丁基]-(4aS，8aS)異喹啉-3(S)-甲酰胺(Ro 31-8959);oxathiolane核苷類似物，如(-)-順-1-(2-羥甲基)-1，3-oxathiolan-5-基)-胞嘧啶(3TC)或順-1-(2-(羥甲基)--1，3-oxathiolan-5-基)-5-氟胞嘧啶(FTC)、3’-脫氧-3’-氟胸苷、2’，3’-二脫氧-5-乙炔基-3’-氟尿苷、5-氯-2’，3’-二脫氧-3’-氟尿苷、(-)-順-4-[2-氨基-6-(環(huán)丙基氨基)-9H-嘌呤-9-基]-2-環(huán)戊烯-1-甲醇、三唑核苷、9-[4-羥基-2-(羥甲基)丁-1-基]-鳥嘌呤(H2G);tat抑制劑，例如7-氯-5-(2-吡咯基)-3H-1，4-苯并二氮雜草-2(H)-酮(Ro5-3335)，或7-氯-1，3-二氫-5-(1H-吡咯-2-基)-3H-1，4-苯并二氮雜草-2-胺(Ro24-7429);干擾素，如α-干擾素;腎分泌物抑制劑，如羥基磺胺;核苷轉(zhuǎn)移抑制劑，如，潘生丁、己酮可可堿、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、Procysteine、α-trichosanthin、膦甲酸以及免疫dulator、如白細(xì)胞介素Ⅱ、粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞菌落刺激因子，促紅細(xì)胞生成素、可溶的CD4和其基因工程衍生物。其他對于治療HBV感染有效的治療藥劑的實例包括carbovir、oxathiolane核苷類似物，例如(一)-順-1-(2-羥甲基)-1，3-oxathiolan-5-基)胞嘧啶(3TC)或順-1-(2-(羥甲基)-1，3-oxathiolan-5-基-5-氟-胞嘧啶(FTC)、2’，3’-二脫氧-5-乙炔基-3’-氟尿苷、5-氟-2’，3’-二脫氧-3’-氟尿苷、1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-丙炔基尿嘧啶、無環(huán)鳥苷、和干擾素，如α-干擾素。其他用于治療皰疹病毒感染的有效的治療劑的實例包括無環(huán)鳥苷、9-[4-羥基-2-(羥甲基)丁基]鳥嘌呤(H2G)、9-[4-羥基-3-(羥甲基)丁-1-基]鳥嘌呤(penciclovir)、famciclovir、penciclovir的二乙酸酯、BVaraU、1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-丙炔基尿嘧啶、2-[(2-氨基-1，6-二氫-6-氧-9H-嘌呤-9-基)甲氧基]-乙基L-纈氨酸酯、膦甲酸和膦乙酸、ganciclovir、(S)-1-(3-羥基-2-膦酰基甲氧基丙基)胞嘧啶(HPMPC)、Oxetanocin G.2’-脫氧-5-碘尿苷、E-5-2-溴乙烯基-2’-脫氧尿苷(BVDU)和9-(3-羥基丙氧基)鳥嘌呤。
更優(yōu)選的結(jié)合治療包括給藥一種上述藥劑和上述式(Ⅰ)優(yōu)選亞組的化合物。最優(yōu)選的結(jié)合治療包括結(jié)合使用一種上述的藥劑和一種本文特殊命名的化合物。
本發(fā)明還提供了本發(fā)明化合物(本文也稱之為活性成份)的藥物制劑，其可通過適合于所治療的臨床癥狀的任何合適途徑給藥以治療包括人在內(nèi)的哺乳動物(受體)，合適的途徑包括口腔(包括頰和舌下)、直腸、鼻、局部(包括頰、舌下和皮膚)、陰道和腸胃外(包括皮下、肌肉、靜脈和皮內(nèi))。顯然，優(yōu)選的途徑將隨著受體的癥狀、體重、年令和性別、感染的性質(zhì)和所選的活性成份而變化。
用于治療上述應(yīng)用和適應(yīng)癥(包括HBV、HIV、HSV1、HSV2、CMV、VZV、EBV、HHV6、C型肝炎病毒或柯薩奇病毒感染)的所需的本發(fā)明化合物的用量將取決于許多因素，其包括所治療的癥狀的嚴(yán)重程度和受體的情況，最終將由負(fù)責(zé)醫(yī)生自行處理。
然而，對于每種應(yīng)用和適應(yīng)癥，合適的有效劑量通常為0.05至100mg每公斤受體體重每天，優(yōu)選的為0.1-50mg每公斤受體體重每天，最優(yōu)選的為0.5-20mg每公斤受體體重每天。最佳劑量為約2-5mg每公斤體重每天。對于治療HBV感染，合適的有效劑量優(yōu)選地為0.05-20mg每公斤體重每天。對于CMV感染，劑量優(yōu)選地為0.5-20mg每公斤體重每天。除非另有說明，所有活性成份的重量是以式(Ⅰ)的母體化合物計算。在式(Ⅰ)化合物的生理機能衍生物或其任何的溶劑化物的情況下，數(shù)字應(yīng)按比例增加。所需劑量優(yōu)選地以一天內(nèi)以適合的間隔如二、三、四、五、六或更多個亞劑量給藥。這些亞劑量可以單位劑量形式給藥，例如，每個單位劑量形式含有1至1500mg、優(yōu)選地為5至1000mg，最優(yōu)選地為10至700mg活性成份。此外，如果受體的癥狀需要的話，所述劑量可以連續(xù)輸液形式給藥。
盡管活性成份能單獨給藥，但優(yōu)選地以藥物制劑給藥。本發(fā)明的制劑包含至少一種如上定義的活性成份與一種或多種藥物可接受的載體和任意地一種或多種其他治療劑。每種載體在制劑的其他成份相容和對患者無害方面必須是“可接受的”。
本發(fā)明的制劑包括適合于任何上述可方便地以單位劑量形式給藥途徑施用的那些制劑，這些制劑可由制藥學(xué)技術(shù)的任何已知方法制備。這類方法包括使活性成份與構(gòu)成一種或多種輔助成份的載體相混合的步驟。通常制劑可通過使活性成份與液體載體或細(xì)粉碎的固體載體或兩者均勻地和緊密地混合，然后，如果需要，成形產(chǎn)物而制備。
適用于口服的本發(fā)明的制劑可以可分離的單位如各含有預(yù)定量的活性成份的，膠囊、扁囊劑或片劑的形式給藥;分離的單位也可以是粉劑或顆粒劑;含水或非水液體中的溶液或懸浮劑;水包油乳劑或油包水乳劑。活性成份可作為大丸劑、糖果劑或糊劑給藥或包含在微脂粒中給藥。
片劑可通過任意地與一種或多種輔助成份一起進行壓制或模制而制備。壓制的片劑可通過在合適的機器中壓制自由流動形式的活性成份，如與任意的粘合劑(如，吡咯烷酮、明膠、羥丙基甲基纖維素)、潤滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、崩解劑(例如，淀粉乙醇酸鈉、交聯(lián)吡咯烷酮、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉)或表面活性劑或分散劑的混合的粉末或顆粒而制備。模制的片劑可通過在合適的機器中模壓濕的粉狀化合物與惰性液體稀釋劑的混合物而制備。片劑可任意地涂復(fù)或劃痕，片劑可通過使用例如不同比例的羥丙基甲基纖維素以提供所需的釋放曲線或使其在加入水中時可溶解或起泡來配制以使其達到緩慢或控制的釋放活性成分。片劑可任意地以帶有腸溶衣的形式給藥以使其在腸而不是在胃中逐份釋放。
適用于口服的制劑還包含用來中和胃酸的緩沖劑。該緩沖劑可選自各種有機或無機試劑，如與它們的共軛鹽混合的弱酸或堿。
膠囊可通過在合適的填充機器中填充疏松或壓緊的粉末和任意的一種或多種添加劑而制備。合適的添加劑的實例包括與用于片劑相同的粘結(jié)劑，如吡咯烷酮、明膠、潤滑劑、惰性稀釋劑和崩解劑。膠囊也可配制成含有小丸或可分離的亞單元以提供活性組分的緩慢或控制的釋放。這可通過將藥物與擠出助劑(例如微晶纖維素)與稀釋劑(如乳糖)的濕混合物擠壓和團成球狀而得到，隨后得到的球體用半透膜(例如乙基纖維素、Eudragit WE30D)涂復(fù)以獲得持續(xù)的緩釋性能。
食用泡沫或打成泡沫制劑理想地包含50-70%食用油，尤其是植物油，其包括玉米油、花生油、葵花籽油、橄欖油和豆油;2-10%一種或多種表面活性劑，尤其是卵磷脂、多元醇、多元醇聚合物酯，包括甘油基脂肪酸酯、多甘油基脂肪酸酯(例如十甘油四油酸酯)或脫水山梨醇脂肪酸酯(例如脫水山梨醇單硬脂酸酯);1-4%的推進劑，其適用于咽下，特別是壓縮氣體推進劑，尤其是氮氣、一氧化二氮或二氧化碳，或氣態(tài)烴，尤其是丙烷、丁烷或異丁烷;0.5-30%一種或多種顆粒尺寸為10-50微米(直徑)的粘度調(diào)節(jié)劑，尤其是粉狀的糖或膠態(tài)二氧化硅;和可有可無的0.5-1%的一種或多種適當(dāng)?shù)姆嵌拘缘纳?、調(diào)味劑或增甜劑。在這類制劑中活性成份優(yōu)選地以10-46%的濃度存在，有利地為30%。上述的食用泡沫或打成泡沫制劑可用常規(guī)方法制備，例如，混合食用油、表面活性劑和任何其他可溶的成分，加入粘度調(diào)節(jié)劑，研磨混合物形成均勻的分散液和懸浮液，將活性成份與研磨的混合物混合直到完成分散，最后，在上述混合物計量裝入適合的分散容器后，在混合物中加入計量的推進劑。
用于本發(fā)明局部給藥的藥物制劑可配制成軟膏、乳劑、懸浮劑、洗劑、粉劑、溶液、糊劑、凝膠、噴霧劑、氣霧劑或油。此外，制劑可包括包敷料，如用活性成份和任意地一種或多種賦形劑或稀釋劑浸漬的繃帶或絆創(chuàng)膏。
適用于經(jīng)皮給藥的組合物可以適合于較長時間保持與受體的表皮緊密接觸的可分離的貼劑形式給藥。這類貼劑合適地含有1)在任意地緩沖的含水溶液;2)溶解在粘合劑或3)分散在聚合物中的活性化合物?；钚曰衔锏暮线m濃度為約1%至35%，優(yōu)選為約3%至15%。作為一種特殊的可能性，活性化合物可通過Pharmaceutical Research，3(6)，318(1986)中描述的離子電滲療法由上述貼劑提供。
對于眼睛或其他外部組織，例如口和皮膚的感染，制劑優(yōu)選地以局部的軟膏或乳劑施用，其活性成份的含量為，例如，0.075-20% w/w，優(yōu)選地為0.2-15% w/w，最優(yōu)選地為0.5-10% w/w。在配制于軟膏時，活性成份與石蠟和水溶性軟膏基質(zhì)一起使用。此外，活性成份可與水包油乳劑基質(zhì)或油包水基質(zhì)一起配制在乳劑中。
如果需要的話，乳劑基質(zhì)的水相可包括，例如40-45% w/w的多羥基醇，即含有兩個或更多個羥基的醇，如丙二醇、丁-1，3-二醇、甘露糖醇、山梨醇、丙三醇和聚乙二醇和它們的混合物。局部制劑可包含改善活性成份通過皮膚或其他感染部位的吸收或滲透的化合物。這類皮膚滲透改善劑的實例包括二甲基亞砜和相關(guān)的類似物。
本發(fā)明乳劑制劑的油相可僅僅含有乳化劑(或者稱為乳化劑)，但根據(jù)需要可包含至少一種乳化劑與脂肪或油或兩者的混合物。優(yōu)選的是，親水乳化劑與作為穩(wěn)定劑的親油乳化劑一起存在，同樣優(yōu)選的是，同時含有油和脂肪。乳化劑與或不與穩(wěn)定劑一起構(gòu)成所謂的乳化石蠟，石蠟與油和/或脂肪一起構(gòu)成所謂的形成乳劑制劑的油相的乳化軟膏基質(zhì)。
適用于本發(fā)明制劑的乳化劑和乳化液穩(wěn)定劑包括Tween 60、Span80、cetostearyl醇、十四醇、甘油單硬脂酸酯和十二烷基硫酸鈉。
制劑的適當(dāng)?shù)挠突蛑镜倪x擇基于獲得所需的化妝品性能，因為活性成份在大多數(shù)用于藥物乳化液制劑的油中的溶解度很低。乳劑應(yīng)優(yōu)選地是非油賦、非污斑和可洗的產(chǎn)物，并且有合適的稠度以避免從管或其他容器中漏出?？墒褂弥辨溁蛑ф湹囊换蚨榛?，如二異己二酸酯、異十六基十八酸酯、椰子脂肪酸的丙二醇酯、異丙基十四酸酯、癸基油酸酯、異丙基棕櫚酸酯、丁基硬脂酸酯、2-乙基己基棕櫚酸酯或稱為Crodamol CAP的支鏈酯的混合物，最后三種是優(yōu)選的酯。根據(jù)所需的性質(zhì)，它們可單獨使用或結(jié)合使用。此外，高熔點類脂，如白色軟石蠟和/或液態(tài)石蠟或其他礦物油也可使用。
適用于眼睛局部給藥的制劑包括眼滴劑，其中活性成份溶解或懸浮于合適的載體中，尤其是含水溶劑。在這種制劑中活性成份的存在濃度為0.5-20%，有利的是0.5-10%，尤其是約1.5% w/w。
適用于口部局部給藥的制劑包括錠劑，其含有在調(diào)味物質(zhì)，通常為蔗糖和阿拉伯膠或黃蓍膠中的活性成份;錠劑，其含有在惰性物質(zhì)，如明膠和甘油，或蔗糖和阿拉伯膠中的活性成份;和漱口液，其包含在合適的液體載體中的活性成份。
用于直腸給藥的制劑可以含有合適的基質(zhì)的栓劑施用，所述基質(zhì)包括可可脂或高級脂肪醇(例如硬石蠟、European Pharmacopoeia)或甘油三酯和飽和脂肪酸(例如，Witepsol)。
適用于鼻給藥的其中載體是固體的制劑包括顆粒尺寸例如20-500微米的粗粉米，其以如下方式給藥，其中將鼻吸藥置于緊靠鼻孔通過鼻道從粉末容器中迅速吸入而獲得鼻吸藥。其中載體是液體的合適的制劑可作為鼻噴霧劑或鼻滴劑(含有活性成份的水或油溶液)給藥。
通過吸入給藥的合適的制劑包括細(xì)顆粒粉或合劑，其可由各種類型的計量劑量的加壓氣溶膠、噴霧器或吸入器產(chǎn)生。
對于經(jīng)口的肺給藥，粉末或液滴的顆粒尺寸通常為0.5-10μm，優(yōu)選為1-5μm，以確保進入枝氣管分枝。對于鼻給藥，10-500μm的顆粒尺寸是優(yōu)選的以確保在鼻腔中的停留。
計量劑量吸入器是加壓的氣溶膠分散器，其通常含有在液化推動劑中的活性成份的懸浮液或溶液制劑。在使用過程中，這些裝置通過適合于提供計量體積，通常為10-150μl;的閥排出制劑以產(chǎn)生含有活性成份的細(xì)顆粒噴霧。合適的推進劑包括丙烷和丁烷、通常稱之為“CFS”的某些氯氟碳化合物，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或它們的混合物。制劑可附加地含有共溶劑，例如乙醇、表面活性劑，如油酸或脫水山梨醇三油酸酯、抗氧化劑和/或合適的調(diào)味劑。
噴霧器是商業(yè)上可得到的裝置，其將活性成份的溶液或懸浮液轉(zhuǎn)變成氣溶膠治療合劑，這是通過由窄文丘里孔加速加壓的氣體，如空氣或氧氣或通過超聲攪拌而完成。用于噴霧器的合適的制劑由在液體載體中的活性成份組成，其含量是少于制劑的40% w/w，優(yōu)選少于20% w/w。載體通常為水或稀釋的含水醇溶液，優(yōu)選地通過添加例如NaCl使之與體液等滲。任意的添加劑包括防腐劑(如果制劑不是無菌制備的)，例如，甲基羥基苯甲酸酯、抗氧化劑、香味劑、揮發(fā)性油、緩沖劑和表面活性劑。
用于吸入給藥的合適的制劑包括細(xì)粉碎的粉末，其可通過吸入器提供或以鼻吸藥的方式進入鼻腔。在吸入器中，粉末包含在由明膠或塑料制成的膠囊或藥筒，其可就地戳破或打開，粉末或者presnete入徑吸氣吸入裝置的空氣或由手動操作的泵提供。在吸入器中使用的粉末包含的或者是單獨的活性成份或者是活性成份、合適的粉末稀釋劑(如乳糖)和任意的表面活性劑的粉末混合物?；钚猿煞萃ㄟ^包含制劑的0.1-100% w/w。
用于吸入的加壓氣溶膠制劑優(yōu)選地被這樣處理，以使每個計量劑量含有0.05-5mg的本發(fā)明化合物。同樣，用于吸入的粉末制劑被如此處理以使每個單元劑量含有0.5-50mg。用于噴霧的溶液或懸浮液制劑被如此處理以提供1-1500mg的劑量。本發(fā)明的化合物或制劑可由這些裝置每天給藥一次或若干次，每次根據(jù)各種情況提供一或若干劑量，例如三或四劑量。
途用于陰道給藥的制劑可作為陰道栓劑、棉塞、乳劑、凝膠、糊劑、泡沫或噴霧制劑存在，這些制劑含有除活性成份之外的現(xiàn)有技術(shù)中已知的合適的載體。
適用于腸胃外給藥的制劑包括含水和非水無菌注射液，其可含有抗氧化劑、緩沖劑、殺菌劑和溶質(zhì)，其使制劑與受體的血液等滲;和可含有懸浮劑和增稠劑的含水或非水無菌懸浮液。制劑可存在于單位劑量或多劑量容器中，如密封的安瓶和小瓶。可以凍干狀態(tài)貯存，其在使用前僅僅需要添加用于注射的無菌液體載體，例如水。臨時作成的注射溶液和懸浮液可由前文所述的無菌散劑、顆粒劑和片劑制備。
優(yōu)選的單位劑量制劑是含有活性成份的上文提到的日劑量或亞劑量或其合適的部分。
人們可以理解，除上述特定提到的成份外，本發(fā)明的制劑可包含考慮上述制劑類型的現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)的其他試劑，例如用于口服的制劑可含有香味劑。
式(Ⅰ)的化合物可通過普通有機化學(xué)，尤其是核苷合成的現(xiàn)有技術(shù)中已知的各種方法制備。起始物質(zhì)是已知的或易于從商業(yè)來源獲得，或本身由已知和常規(guī)技術(shù)制備。
本發(fā)明進一步包括式(Ⅰ)化合物或式(Ⅰ)化合物的鹽、酯或生理機能衍生物和其溶劑化物的制備方法，其包括(A)使式(Ⅱ)的嘌呤堿
其中R1為如上文所定義或其功能等價物，與如下式(Ⅲ)的化合物反應(yīng)
其中R6和R7是相同的或不同的，每個代表H或羥基保護基團，A是磷酸基團或其鹽或除(Ⅱ)以外的嘧啶或嘌呤部分或離去基團，以形成式(Ⅰ)化合物;或(B)使如下式(Ⅳ)的化合物與一種或多種試劑和/或在使R8轉(zhuǎn)化為所需的R1基團的條件下反應(yīng)
其中R6和R7如上文中所定義，R8代表式(Ⅰ)中定義的R1的前體;
和隨后或同時進行一步或多步如下任意的轉(zhuǎn)化過程(ⅰ)除去任何殘余的保護基團;
(ⅱ)在形成式(Ⅰ)化合物時，將其轉(zhuǎn)化為式(Ⅰ)化合物的鹽、酯或其他生理機能衍生物;或(ⅲ)在形成式(Ⅰ)化合物的鹽、酯或其他生理機能衍生物或其任何溶劑化物時，將衍生物轉(zhuǎn)化為式(Ⅰ)化合物或式(Ⅰ)化合物的不同衍生物;
(ⅳ)如果需要，分離出式(Ⅰ)化合物或其被保護的衍生物或式(Ⅰ)化合物的生理可接受的衍生物的α和β異頭物。
在上述的本發(fā)明的方法中，式(Ⅱ)、(Ⅲ)和(Ⅳ)的起始化合物以及上述的試劑和條件選自核苷合成化學(xué)的現(xiàn)有技術(shù)中已知的那些。這些轉(zhuǎn)化過程的實例在下文中指導(dǎo)性地描述，人們應(yīng)理解，根據(jù)所需的式(Ⅰ)化合物，它們可以常規(guī)的方式作出改進。尤其是在另外產(chǎn)生易變基團的不需要的反應(yīng)的轉(zhuǎn)化過程中，這些基團可以常規(guī)的方式保護，隨后在轉(zhuǎn)化過程完成后除去保護基團。
按照用于進行方法(A)的條件，式(Ⅱ)的嘌呤堿和式(Ⅲ)化合物可任意地用常規(guī)保護基團保護，例如，?；?，尤其是烷酰基(例如乙?；?、取代的烷?；缤檠趸轷；?、芳?；?如苯甲?；?、醚基，包括三烷基甲硅烷基(例如叔丁基二甲基甲硅烷基)或其他基團，如芳烷基(例如芐基)或磷酸酯基。
這些基團可通過酸或堿水解、氫解或酶催化而除去。酰基通常通過堿水解除去，而甲硅烷基通過酸水解或氟化物離子處理除去。芳烷基，例如芐基，有利地是通過催化氫解除去。
進行方法(A)通常采用兩種方法，即酶催化和化學(xué)方法。
方法(A)可酶催化進行，通過，例如，使合適的式(Ⅱ)嘌呤堿(其中R1如前文所定義或其功能等價物，例如鹽或保護的衍生物(參見上文))與式(Ⅲ)化合物反應(yīng)，在式(Ⅲ)中，R6和R7是相同或不同的，每個代表H或羥基保護基團(參見上文)，A是嘧啶或嘌呤部分(除(Ⅲ)以外)、磷酸酯基團或其鹽。
在其中A是嘧啶或嘌呤部分(除(Ⅱ)以外)的情況下，反應(yīng)可在(ⅰ)磷酸化酶，如嘌呤核苷磷酸化酶和胸苷磷酸化酶和無機磷酸或其鹽;或(ⅱ)轉(zhuǎn)移酶，例如，反-N-脫氧核糖酶存在下進行。為了得到本發(fā)明的化合物，在應(yīng)用該方法時，式(Ⅲ)的化合物應(yīng)為其β-形式。
反-N-脫氧核糖酶可用標(biāo)準(zhǔn)生物化學(xué)技術(shù)由表達乳桿菌酶的大腸桿菌菌株SS70-8/15分離得到，該菌由American Type CultureCollection(ATCC)Rockville，MD 20852-1776(登記號No.ATCC69016，1992年6月17日)得到。
在其中A代表磷酸基團或其鹽的情況下，反應(yīng)可在單磷酸化酶，如嘌呤核苷磷酸化酶存在下進行。為了得到本發(fā)明的化合物，在應(yīng)用該方法時，式(Ⅲ)化合物應(yīng)為其α-形式。
保護基團也可用于酶催化方法，但事實上，我們發(fā)現(xiàn)這是不必要的，在某些情況下事實上對總產(chǎn)率不利。
方法(A)可在催化劑存在下，例如氯化錫(Ⅳ)或路易士酸(例如二溴化汞或三甲基甲硅烷基三氟甲烷磺酸酯)，在合適的溶劑中，例如甲苯、乙腈、1，2-二氯乙烷或氯仿在低溫、室溫或高溫下，如-78℃至回流溫度，優(yōu)選地為0°至25℃，通過例如使如上定義的式(Ⅱ)化合物與式(Ⅲ)化合物反應(yīng)而化學(xué)實現(xiàn)，在式(Ⅲ)中，R6和R7是相同的或不同的，每個代表H或羥基保護基團，A代表合適的離去基團，如鹵原子，例如氯或酰氧基，如乙酰氧基。
與酶催化方法相反，我們發(fā)現(xiàn)，化學(xué)方法(a)中式(Ⅱ)和(Ⅲ)的化合物可有利地被保護(參見上文)和(b)所形成的式(Ⅰ)化合物是α-和β-異頭物的混合物。本發(fā)明的β-異頭物可通過技術(shù)人員熟知的或在化學(xué)文獻中易于找到的方法，例如，通過硅膠柱色譜法或HPLC，異頭分離得到。
其中R1如上文所定義或是任何功能等價物的式(Ⅱ)化合物可以由商業(yè)上得到，例如，由Aldrich Chemical Company得到，或由技術(shù)人員已知的或從化學(xué)文獻易于找到的常規(guī)方法制備，例如，通過Robins等人的J.Amer.Chem.Soc.1957，79，490-494和Montgomery和Temple的J.Amer.Chem.Soc.1961，83，630-635中描過的方法或類似方法。
例如，合適的嘌呤堿可由其中6位取代基為合適的離去基團，例如氯的相應(yīng)的嘌呤通過所述基團的親核位移制備。因此，其中6位取代基是甲氧基或環(huán)丙基甲氧基的嘌呤可通過在堿，如氫化鈉存在下分別用甲醇或環(huán)丁醇處理相應(yīng)的6-氯嘌呤制備，而其中6位取位基是環(huán)丙基氨基、哌啶基或吡咯烷基的嘌呤可通過在合適的溶劑中用合適的胺，即環(huán)丙胺、哌啶或吡咯烷分別處理相應(yīng)的6-氯嘌呤而制備。
2-氨基-6-氯嘌呤前體可由商業(yè)上獲得(Aldrich ChemicalCo.)或由技術(shù)人員已知的或從化學(xué)文獻中易于找到的方法制備。
其中A是嘧啶或嘌呤部分的式(Ⅲ)化合物可由技術(shù)人員熟知的或從化學(xué)文獻中易于找到的方法制備。例如，2’-脫氧-4’-硫代尿苷可由Secrist J.A.Ⅲ等人的J.Med.Chem.34，2361-2366(1991)中描述的方法制備，而2’-脫氧-4’-硫代腺嘌呤可由WO 91/04033中描述的方法制備。
其中R6和R7如上文所定義而A表示離去基團，例如氯和乙酰氧基的式(Ⅲ)化合物可由常規(guī)方法制備，通常采用歐洲專利說明書NO.EP-A-409575中描述的方法，其內(nèi)容列為本文參考文獻。
其中A代表磷酸基團的式(Ⅲ)化合物可由類似于化學(xué)文獻中得到的方法化學(xué)制備或由其中A是嘌呤部分的式(Ⅲ)化合物通過用磷酸化酶，例如胸苷磷酸化酶處理制備。
對于方法(B)，在其中前體基團R8代表保護基團的情況下，可采用上文描述的用于方法(A)的常規(guī)保護基團。
本發(fā)明的酯可通過現(xiàn)有技術(shù)中的已知方法制備。例如，通過用合適的酯化劑，例如，用合適的酰基鹵，例如?；然蛩狒幚硎?Ⅰ)的母體化合物。
式(Ⅰ)化合物的一、二或三磷酸酯可由式(Ⅰ)的母體化合物通過常規(guī)的化學(xué)方法或酶催化方法，例如，使用核苷激酶或磷酸轉(zhuǎn)移酶，在核苷酸三磷酸酯(例如ATP)存在下經(jīng)一、二和三磷酸衍生物逐漸磷酰化制備。
式(Ⅰ)化合物通過以常規(guī)方式與合適的烷基化劑反應(yīng)可被轉(zhuǎn)化成式(Ⅰ)的相應(yīng)的生理上可接受的醚。
式(Ⅰ)化合物(包括其酯)可以常規(guī)的方式，例如，通過用合適的堿處理轉(zhuǎn)化成生理上可接受的鹽。式(Ⅰ)化合物的酯或鹽可通過，例如水解，轉(zhuǎn)化成母體化合物。
如下實施例僅用來舉例說明本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明的范圍，實施例中所用的術(shù)語“活性成份”指的是式(Ⅰ)化合物或其生理上的機能衍生物或其任何的溶劑化物。
A.由大腸桿菌制備反-N-脫氧核糖酶(E.C.2.4.2.6)
大腸桿菌菌株SS70-8/15在富集介質(zhì)，如含有150g/ml氨芐青霉素的Luria液體培養(yǎng)基中生長過夜(15-20小時)。在4℃經(jīng)離心從生長介質(zhì)中收集細(xì)菌，細(xì)胞片狀沉淀物用冷的100mM磷酸鈉緩沖液(PH 6.0)洗滌。通過將洗過的細(xì)胞片狀沉淀物重新懸浮于0.6-0.8體積的冷的100mM磷酸鈉緩沖液隨后將細(xì)胞懸浮液通過12-14Kpsi的French吐絲器制備細(xì)胞萃取物。在70Ti轉(zhuǎn)子和50Krpm離心分離90分鐘除去全細(xì)胞和細(xì)胞碎片。由離心得到的上清液是高速上清液(HSS)。通過加入冷的100mM磷酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)HSS的A260至180。稀釋的HSS調(diào)節(jié)至0.2% PEI(聚乙烯亞胺)，在4℃。培養(yǎng)15-30分鐘，隨后離心分離。得到的上清液經(jīng)PEI沉淀后調(diào)節(jié)至(NH4)2SO4的30%飽和度，在4℃培養(yǎng)60-90分鐘，然后離心分離成片狀沉淀物和蛋白質(zhì)。用30%(NH4)2SO4沉淀的蛋白質(zhì)緩慢溶解于100mM磷酸鈉緩沖液(PH6.0)，然后對2-6升同樣的緩沖液進行透析。
透析后，離心除去所形成的沉淀物，含有酶的上清液在60℃的水浴中加熱5-10分鐘，隨后在冰/水漿液中培養(yǎng)20分鐘。離心除去加熱處理過程中形成的沉淀物，上清液含有用于核苷合成的反-N-脫氧核糖酶。
每種酶制備過程的反-N-脫氧核糖酶活性用脫氧肌苷和胞嘧啶作基質(zhì)在Cardinaud，R.1978.來自Lactobacillus helveticus的核苷脫氧核糖基轉(zhuǎn)移酶，Methods Enzymol.51∶446-455中描述的黃嘌呤氧化酶偶聯(lián)試驗體系中確定。
大腸桿菌菌株SS70-8/15在1992年6月17日寄存在AmericanType Culture Collection(ATCC)Rockville，MD 20852-1776，登記號No.ATCC 69016。
B.2’-脫氧-4’-硫代-嘌呤核苷的酶催化制備方法改性的嘌呤堿如US 5068320、Koszalka，G.W.等人的“用作水痘帶狀皰疹病毒的選擇性抑制劑的腺嘌呤阿拉伯糖的6-N-取代衍生物”，Antimicrobial Agents and Chemotherapg，35，1991，1437-1443和Burns，C.L.等人的“用作人體免疫缺乏病毒的細(xì)胞病變效應(yīng)抑制劑的新的6-烷氧基嘌呤2’，3’-二脫氧核苷”，J.Med.Chem.1993，36(3)，378-384中描述的那樣通過2-氨基-6-氯嘌呤(Aldrich)中的氯的取代來制備。
適當(dāng)取代的嘌呤加入900ml pH6.0的檸檬酸緩沖液中得到1mM嘌呤堿溶液。緩沖液通過將9.46g(45mmol)檸檬酸加入900ml蒸餾去離子水并用NaOH調(diào)節(jié)至最終pH6.0而制備。將2’脫氧-4’-硫代尿苷的α/β混合物(1∶1)(Secrist，J.A.Ⅲ，等人的J.Med.Chem.，34，2361-2366(1991)，列為本文參考文獻)加入得到5mMβ化合物的濃度。通過在聲處理下將混合物加熱至50℃得到溶液。加入反-N-脫氧核糖酶(2051單位/ml)至5單位酶/反應(yīng)物ml的最終濃度。將反應(yīng)混合物保持在50℃。在四天內(nèi)每天加入等量的嘌呤堿，五天后通過超聲過濾除去酶，凍干除去水。得到的白色粉末殘余物用甲醇(500ml)制成漿并過濾。固體用甲醇徹底漂洗(3×100ml，直到在濾液中不存在UV活性)。收集的濾液用Dowex AG-1(OH形式)樹脂(200ML)制成漿并過濾。用甲醇洗凈樹脂直到在濾液中不存在UV活性，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去溶劑。將粘稠的殘余物溶解于100ml甲醇中，加入硅膠(～20ml)。產(chǎn)物用快速色譜法，5×30cm柱，95∶5CH2Cl2∶CH3OH作洗脫液提純，提純的產(chǎn)物凍干脫水得到白色粉末的核苷。
實施例12-氨基-9-(2-脫氧-4-硫代-β-D-紅-五呋喃糖基)-6-甲氧基-9H-嘌呤由2-氨基-6-氯嘌呤(Aldrich Chemical Co.，milwaukee，WI 53233)和甲醇制備的2-氨基-6-甲氧基嘌呤被加入如上所述(實施例B)的pH6.0的檸檬酸緩沖液中。
1HNMR(DMSO-d6)δ2.34-2.37(m，1)，2.52-2.58(m，1)，3.36-3.39(m，1)，3.54-3.58(m，1)，3.68-3.74(m，1)，3.96(s，3)，4.45-4.48(m，1)，5.13(t，1，J＝5.5)，5.30(d，1，J＝3.8)，6.13(t，1，J＝6.9)，6.50(s，2)，8.20(s，1).UV(pH＝7)λmax281(ε＝11.0);λmax252(ε＝9.7);λmin263(ε＝6.5);λmin232(ε＝10.3).(pH＝13)λmax281(ε＝10.4);λmax252(ε＝9.0);λmin263(ε＝6.0);λmin233(ε＝6.0).MS(El)m/z298(M+H).
實施例22-氨基-6-(環(huán)丙基氨基)-9-(2-脫氧-4-硫代-β-D-紅-五呋喃糖基)-9H-嘌呤由環(huán)丙胺對2-氨基-6-氯嘌呤(Aldrich Chemical Co.，milwaukee，WI 53233)的氯基團的親核置換制備的2-氨基-6-環(huán)丙基氨基嘌呤被加至如上所述的(實施例B)pH6.0檸檬酸緩沖液中。
熔點98-126℃[α]D20-73.8(c＝0.50，DMF).1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.54-0.68(m，4)，2.27-2.35(m，1)，2.50-2.60(m，1)，3.01(br，s，1)，3.31(m，1)，3.51-3.59(m，1)，3.67-3.73(m，1)，4.46(t，1，J＝3.3)，5.15(t，1，J＝5.5)，5.27(d，1，J＝3.8)，5.90(s，2)，6.10(dd，1，J＝6.5，7.9)，7.36(d，1，J＝2.3)，8.01(s，1).UV(pH＝7)λmax285(ε＝15.2);λmin246(ε＝6.4);sh265(ε＝10.3).(pH＝13)λmax297(ε＝14.2);λmin274(ε＝7.2);sh258(ε＝11.1).MS(El)m/z323(M+H).
CHNOS-0.5HO計算值C，47.12;H，25.36;S，9.68。實驗13 18 6 22值C，46.87;H，5.81;N，25.18;S，9.72.
實施例32-氨基-9-(2-脫氧-4-硫代-β-D-紅-五呋喃糖基)-6-甲硫基-9H-嘌呤由Sigma Chemical Co.得到的2-氨基-6-甲硫基-9H-嘌呤被加至如上所述的(實施例B)pH6.0的檸檬酸緩沖液中。
197-199℃.[α]20D-94.4(c＝0.50，DMF).1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ2.27-2.35(m，1)，2.50-2.60(m，1)，2.6(s，3)，(m，1)，3.54(m，1)，3.74(m，1)，4.47(m，1)，5.13(t，1，J＝6.0)，5.31(d，1，J＝2.0)，6.13(dd，1)，6.58(s，2)，8.26(s，1).UV(pH＝7)λmax285(ε＝15.1);λmin246(ε＝6.4);sh265(ε＝10.3).(pH＝13)λmax297(ε＝14.2);λmin274(ε＝7.2);sh258(ε＝11.1).MS(EI)m/z314(M+H).
C11H15N5O2S2.0.5H2O計算值C，40.98;H，5.00;N，21.72實驗值C，40.93;H，4.72;N，21.69.
實施例42-氨基-9-(2-脫氧-4-硫代-β-D-紅-五呋喃糖基)-6-(環(huán)丙基甲基氨基)-9H-嘌呤由2-氨基-6-氯嘌呤(Aldrich Chemical Co.，milwaukee，WI 53233)和環(huán)丙基甲胺制備的2-氨基-6-(環(huán)丙基甲基氨基)-9H-嘌呤被加至如上所述的(實施例B)的pH6.0檸檬酸緩沖液中。
熔點72-76℃.[α]20D-78.0(c＝0.50，DMF).1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.64-0.69(m，2)，0.78-0.84(m，2)，2.27-2.35(m，1)，2.49-2.58(m，1)，3.2(m，1)，3.32(s，3)，3.53-3.59(m，1)，3.66-3.74(m，1)，4.46(m，1)，5.13(t，1，J＝5.5)，5.27(d，1，J＝3.7)，5.89(br s，2)，6.13(dd，1，J＝7.9，7.9)，8.04(s，1).MS(EI)m/z337(M+H).
C14H20N6O2S.1H2O計算值C，47.74;H，6.32;N，23.53;S，8.98.
實驗值C，47.82;H，6.17;N，23.47;S，9.04.
實施例52-氨基-9-(2-脫氧-4-硫代-β-D-紅-五呋喃糖基)-6-(乙基甲基氨基)-9H-嘌呤由2-氨基-6-氯嘌呤(Aldrich Chemical Co.，milwaukee，WI 53233)和乙基甲胺制備的2-氨基-6-(乙基甲基氨基)-9H-嘌呤被加至如上所述的(實施例B)的pH6.0的檸檬酸緩沖液中。
熔點78-82℃.[α]20D-84.0(c＝0.50，DMF).1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ1.18(t，3，J＝7.0)，2.31-2.35(m，1)，2.49-2.53(m，1)，3.26(br，s，3)，3.3(m，1)，3.53-3.59(m，1)，3.66-3.71(m，1)，3.94(br s，2)，4.46(m，1)，5.14(t，1，J＝5.5)，5.27(d，1，J＝3.7)，5.86(br s，2)，6.11(dd，1，J＝6.3，7.9)，8.03(s，1).MS(EI)m/z325(M+H).
C13H20N6O2S.0.5H2O.計算值0.1C2H6OC，46.90;H，6.44;N，24.86.
實驗值C，46.98;H，6.38;N，25.09.
實施例62-氨基-9-(2-脫氧-4-硫代-β-D-紅-五呋喃糖基)-6-異丙基氨基-9H-嘌呤由2-氨基-6-氯嘌呤(Aldrich Chemical Co.，milwaukee，WI 53233)和異丙胺制備的2-氨基-6-異丙基氨基-9H-嘌呤被加至如上所述的(實施例B)的pH6.0的檸檬酸緩沖液中。
熔點81-85℃.[α]20D-71.8(c＝0.50，DMF).1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ1.16(d，6，J＝6.5)，2.26-2.34(m，1)，2.25-2.58(m，1)，3.3(m，2)，3.53-3.59(m，1)，3.66-3.73(m，1)，4.45(m，1)，5.14(t，1，J＝5.5)，5.26(d，1，J＝3.7)，5.84(br s，2)，6.10(dd，1，J＝8.0，8.1)，6.95(br s，1H)，8.00(s，1).MS(EI)m/z325(M+H).
C13H20N6O2S.0.5H2O.計算值0.5C2H6OC，47.18;H，6.79;N，23.58;S，9.00.
實驗值C，46.85;H，6.60;N，23.69;S，9.08.
實施例72-氨基-9-(2-脫氧-4-硫代-β-D-紅-五呋喃糖基)-6-環(huán)丙基甲氧基-9H-嘌呤由2-氨基-6-氯嘌呤(Aldrich Chemical Co.，milwaukee，WI 53233)和甲醇制備的2-氨基-6-環(huán)丙基甲氧基-9H-嘌呤被加至如上所述的(實施例B)的pH6.0檸檬酸緩沖液中。
1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.30(m，2)，0.58(m，2)，1.30(m，1)，2.32-2.38(m，1)，2.54-2.61(m，1)，3.3(m，1)，3.53-3.60(m，1)，3.68-3.74(m，1)，4.21(d，2，J＝7.3)，4.47(m，1)，5.13(t，1，J＝5.5)，5.30(d，1，J＝3.7)，6.14(m，1)，6.45(s，2)，8.20(s，1).MS(EI)m/z338(M+H).
實施例82-氨基-9-(2-脫氧-4-硫代-β-D-紅-五呋喃糖基)-6-N-哌啶子基-9H-嘌呤由2-氨基-6-氯嘌呤(Aldrich Chemical Co.，milwaukee，WI 53233)和哌啶制備的2-氨基-6-N-哌啶子基-9H-嘌呤被加至pH6.0的上述(實施例B)的檸檬酸緩沖液中。
α]20D-75.0(c＝0.50，DMF).1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ1.52(br m，4)，1.63(m，2)，2.27-2.35(m，1)，2.49-2.57(m，1)，3.3(m，1)，3.51-3.59(m，1)，3.66-3.74(m，1)，4.09(br m，4)，4.45(m，1)，5.14(t，1，J＝5.5)，5.27(d，1，J＝3.7)，5.89(br s，2)，6.11(dd，2，J＝4.4，6.1)，8.03(s，1).MS(EI)m/z351(M+H).
C15H22N6O2S.0.1H2O計算值0.4CH2Cl2C，49.72;H，6.23;N，22.59;S，8.62.
實驗值C，50.03;H，6.40;N，22.20;S，8.97.
實施例92-氨基-9-(2-脫氧-4-硫代-β-D-紅-五呋喃糖基)-6-正丙基氨基-9H-嘌呤由2-氨基-6-氯嘌呤(Aldrich Chemical Co.，milwaukee，WI 53233)和丙胺制備的2-氨基-6-正丙基氨基-9H-嘌呤被加到上述(實施例B)的pH6.0檸檬酸緩沖液中。
1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.87(t，3，J＝7.2)，1.55(h，2，J＝32.4)，2.31-2.34(m，1)，2.49-2.53(m，1)，3.26(br s，3)，3.3(m，1)，3.53-3.59(m，1)，3.66-3.70(m，1)，4.46(m，1)，5.15(t，1，J＝5.5)，5.26(d，1，J＝3.7)，5.85(br s，2)，6.10(dd，1，J＝8.1，8.0)，8.00(s，1).MS(EI)m/z325(M+H).
C13H20N6O2S.0.8H2O計算值C，46.08;H，6.43;N，24.80.
實驗值C，46.17;H，6.19;N，24.62.
實施例102-氨基-9-(2-脫氧-4-硫代-β-D-紅-五呋喃糖基)-6-N-吡咯烷基-9H-嘌呤由2-氨基-6-氯嘌呤(Aldrich Chemical Co.，milwaukee，WI 53233)和吡咯烷制備的2-氨基-6-N-吡咯烷基-9H-嘌呤被加至上述(實施例B)的pH6.0的檸檬酸緩沖液中。
1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ1.90(br s，4)，2.28-2.35(m，1)，2.49-2.57(m，1)，3.3(m，1)，3.48-3.59(m，1)，3.67-3.71(m，1)，3.90(br s，1)，4.46(m，1)，5.14(t，1，J＝5.5)，5.27(d，1，J＝3.7)，5.89(br s，2)，6.10(dd，1，J＝7.8，7.9)，8.01(s，1).MS(EI)m/z337(M+H).
C14H20N6O2S.1.0H2O計算值C，47.44;H，6.26;N，23.71.
實驗值C，47.51;H，6.22;N，23.67.
實施例112-氨基-9-(2-脫氧-4-硫代-β-D-紅-五呋喃糖基)-6-烯丙基氨基-9H-嘌呤由2-氨基-6-氯嘌呤(Aldrich Chemical Co.，milwaukee，WI 53233)和烯丙胺制備的2-氨基-6-烯丙基氨基-9H-嘌呤被加至上述(實施例B)的pH6.0的檸檬酸緩沖液中。
1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ2.28-2.33(m，1)，2.49-2.57(m，1)，3.3(m，1)，3.53-3.59(m，1)，3.67-3.72(m，1)，4.06(br s，1)，4.46(m，1)，5.01-5.12(m，2)，5.15(t，1，J＝5.5)，5.26(d，1，J＝3.7)，5.89(br s，2)，5.93(m，1)，6.10(dd，1，J＝8.0，8.0)，7.39(br s，1)，8.02(s，1).
實施例12片劑制劑如下制劑A、B和C通過將成份與吡咯烷酮溶液濕造粒，然后加入硬脂酸鎂并壓制而制備。
制劑A
mg/片 mg/片(a)活性成份 250 250(b)乳糖B.P. 210 26(c)吡咯烷酮B.P. 15 9(d)淀粉乙醇酸鈉 20 12(e)硬脂酸鎂 5 3500 300制劑Bmg/片 mg/片(a)活性成份 250 250(b)乳糖 150 -(c)微晶纖維素 60 26(d)吡咯烷酮B.P. 15 9(e)淀粉乙醇酸鈉 20 12(f)硬脂酸鎂 5 3500 300制劑Cmg/片活性成份 100乳糖 200淀粉 50吡咯烷酮 5硬脂酸鎂 4359
如下制劑D和E通過直接壓制混合的成份而制備。制劑E中的乳糖是直接壓制型(Dairy Crest-“Zeparox”)制劑Dmg/片活性成份 250預(yù)膠凝化的淀粉NF15 150400制劑Emg/片活性成份 250乳糖 150微晶纖維素 100500制劑F(控制釋放的制劑)制劑通過將成份(如下與吡咯烷酮的溶液濕造粒，然后加入硬脂酸鎂并壓制而制備。
mg/片(a)活性成份 500(b)羥丙基甲基纖維素 100(Methocel K4M Premlum)(c)乳糖B.P. 53(d)吡咯烷酮B.P. 28(e)硬脂酸鎂 7700
藥物釋放在6-8小時內(nèi)發(fā)生，在12小時后完成。
實施例13膠囊制劑制劑A膠囊制劑通過混合上文實施例2中的制劑D的成份并將混合物充入兩部分的硬明膠膠囊中而制備。制劑B(在下)以類似方式制備。
制劑Bmg/膠囊(a)活性成份 250(b)乳糖B.P. 143(c)淀粉乙醇酸鈉 25(d)硬脂酸鎂 2420制劑Cmg/膠囊(a)活性成份 250(b)聚乙二醇4000B.P. 350600制劑Dmg/膠囊活性成份 250卵磷脂 100花生油 100450
制劑D的膠囊通過將活性成份分散在卵磷脂和花生油中并將混合物充入軟質(zhì)彈性明膠膠囊中而制備。
制劑E(控制釋放的膠囊)如下控制釋放的膠囊制劑是通過用擠出機將成份(a)、(b)和(c)擠出，隨后使擠出物成球狀并干燥，然后將干燥的小丸涂上釋放控制薄膜并將其充填入兩部分的硬質(zhì)明膠膠囊而制備。
mg/膠囊(a)活性成份 250(b)微晶纖維素 125(c)乳糖B.P. 125(d)乙基纖維素 43543實施例14注射制劑制劑A活性成份 0.200gHCl溶液，0.1M或NaOH溶液，0.1M平衡至pH 4.0-7.0無菌水平衡至 10ml將活性成份在35-40℃溶解于大部分的水中，根據(jù)需要用HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH至4.0-7.0之間。隨后加水達到批量的體積，通過無菌微孔過濾器裝入無菌10ml棕色玻璃小瓶(類型1)，并采用無菌閉合和過密封來密封。
制劑B活性成份 0.125無菌無熱原的pH7的磷酸緩沖液平衡至 25ml實施例15肌肉注射活性成份 0.20g芐醇 0.10g糖糠醛(Glycofurol)75 1.45g注射用水平衡至 3.00ml將活性成份溶解于糖糠醛中，隨后加入芐醇并溶解，加水至3ml?；旌衔锝?jīng)無菌微孔過濾器過濾，密封在無菌3ml棕色玻璃小瓶(類型1)中。
實施例16糖漿活性成份 0.25g山梨醇溶液 1.50g丙三醇 2.00g苯甲酸鈉 0.005g調(diào)味劑Peach17.42.3169 0.0125ml純水平衡至 5.00ml將活性成份溶解于丙三醇和大部分純水的混合物中，在溶液中加入苯甲酸鈉水溶液，然后加入山梨醇溶液，最后加入調(diào)味劑。用純水加至所需體積并充分混合。
制劑B活性成份 0.125g無菌無熱原，pH7的磷酸鹽緩沖液平衡至 25ml實施例17栓劑mg/栓劑活性成份(63μm)＊250硬脂肪B.P.(Witepsol H15-Dynamit Nobel) 17702020＊活性成份作為粉末使用，其中至少90%的顆粒為63μm(直徑)或更小。
將五分之一的Witepsol H15在蒸汽夾套容器內(nèi)在45℃(最高溫度)熔化，活性成份通過200μ篩篩分，在用裝有切割頭的Silverson攪拌下將活性成份加入到熔化的基質(zhì)中，直到獲得均勻的分散液。保持混合物45℃，在懸浮液中加入其余的Witepsol H15，攪拌以確保均勻混合。使全部懸浮液通過250μm不銹鋼篩，在攪拌條件下使之冷卻至40℃，在38-40℃的溫度下，將2.0g混合物充入合適的2ml塑料模具內(nèi)，使栓劑冷卻至室溫。
實施例18陰道栓劑mg/陰道栓劑活性成份(631m) 250脫水葡萄糖 380馬鈴薯淀粉 363硬脂酸鎂 71000將上述成份直接混合，將得到的混合物直接壓制制備陰道栓劑。
實施例19抗病毒活性(a)HBV試驗(方法1)式(Ⅰ)化合物的抗HBV活性由用于評價效率的高容量試驗測定。
將來自在96孔板中的生長HBV生產(chǎn)細(xì)胞(HepG2.2.15，P5A細(xì)胞線)的上清液用于涂有HBV表面抗原(HBsAg)的特定單克隆抗體的微滴板孔。存在于上清液中的病毒顆粒與抗體結(jié)合并保持不動，期間其他碎片通過洗滌除去。這些病毒顆粒隨后變性成釋放HBV DNA束，其隨后由聚合酶鏈反應(yīng)放大并且由比色雜交捕獲試驗檢測。定量結(jié)果通過標(biāo)準(zhǔn)曲線與含有已知HBV DNA含量的細(xì)胞上清液的稀釋液的擬合得到。通過比較未處理對照細(xì)胞上清液與含有式(Ⅰ)化合物的上清液的HBV DNA含量，得到抗HBV效率的測量結(jié)果。
HBV的免疫和捕獲產(chǎn)生HBV的細(xì)胞，2500細(xì)胞/孔，在96孔培養(yǎng)皿上在RPMI/10%牛胎兒血清/2mM谷氨酰胺(RPMI/10/2∶)中接種。在第1、3、5和7天用在RPMI/10/2中的式(Ⅰ)化合物的稀釋液補充培養(yǎng)基至最終體積150μl。在園底微滴板的每個孔中加入50μl鼠單隆抗HBsAG抗體(10μg/PBSml)。在4℃培養(yǎng)過夜后，吸出溶液，代之以100μl PBS中的0.1% BSA溶液。將樣品在37℃培養(yǎng)2小時，采用Nunc Washer用PBS-0.01% Tween-20(PBS/T)洗滌三次，用Pro/Pette在所有孔中加入10μl在PBS中的0.035%Tween20。用Pro/Pette將含有細(xì)胞外病毒粒子DNA的細(xì)胞上清液(25μl)移入孔中，最終Tween濃度為0.01%。在2排孔中加入25μl在RPMI/10/2中的HBV標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基稀釋液用作用于定量分析的內(nèi)標(biāo)曲線，將板密封在4℃培養(yǎng)過夜。樣品用PBS/T洗滌5次，用PBS洗滌兩次，吸出洗液。最后，用Pro/Pette在每個孔中加入25μl 0.09N NaOH/0.01% NP40，將樣品孔密封，在37℃培養(yǎng)60分鐘，隨后用25μl 0.09N HCL/100mM tris(pH8.3)中和樣品。
聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)用Perkin Elmer PCR藥盒對5μl樣品進行聚合酶鏈反應(yīng)(Saiki，R.K.等人。Science，239(4839)487-91(1988))。PCR在“MicroAmp管”中補充到25μl的最終體積。引物選自HBV基因組中的保存區(qū)域，由若干順序的定位測定。一件引物在5主型末端被生物素化，以便于PCR產(chǎn)物的雜交捕獲檢測。所有引物從Synthecell Corp.，Rockville，MD 20850購買。
PCR產(chǎn)物的雜交捕獲檢測
PCR產(chǎn)物用辣根過氧化酶標(biāo)記的低核苷酸探針(Synthecell Corp.，Rockville，MD 20850)檢測，PCR產(chǎn)物用Holodiniy，M.等人在Bio Techniques，12(1)37-39(1992)中的方法在涂有抗生蛋白鏈菌素的微滴板孔中直接雜交于變性PCR產(chǎn)物的生物素化束。改進包括使用25K PCR反應(yīng)體積和NaOH變化過程來代替加熱。在雜交過程中生物素部分與板束縛的抗生蛋白鏈菌素的同時結(jié)合用以“捕獲”雜交。未束縛的標(biāo)記的探針在束縛(雜交)辣根過氧化酶的比色測定之前被洗去。存在于原始樣品中的HBV DNA的量通過與標(biāo)準(zhǔn)相比較而計算。隨后將這些值與未處理細(xì)胞培養(yǎng)物相比較而確定抗HBV活性的程度。
IC50(半數(shù)抑制濃度)是導(dǎo)致HBV DNA降低50%的化合物的量。
(b)用于HIV對抗病毒化合物感受性評價的HeLa-CD4+細(xì)胞試驗HIV對抑制劑的感受性如Larder，B.A.，Chesebro，B.& Richman，D.D.Antimicrob.Agents Chemother.1990 34，436-441描述的那樣通過HT4-6C細(xì)胞單細(xì)胞層的感染測定。細(xì)胞首先在24孔多孔板上以每孔5×104細(xì)胞接種，在37℃的生長培養(yǎng)基(DMEM10)中培養(yǎng)過夜。單細(xì)胞層用在含有5%牛胎兒血清與抗生素(DMEM5)的0.2ml的DMEM中的100-200pfu的無細(xì)胞病毒感染，在37℃培養(yǎng)1小時以使病毒吸附。隨后在每個孔中加入0.3m DMEM5(含或不含抑制劑)，培養(yǎng)物在37℃培養(yǎng)2-3天。用在PBS中的10%甲醛溶液固定單細(xì)胞層，用0.25%結(jié)晶紫色染色以觀察病毒噬菌斑。多核巨細(xì)胞(噬菌斑)的單個焦點用染色方法顯示。ID50值由噬菌斑減數(shù)的百分?jǐn)?shù)對抑制劑濃度的曲線圖獲得。
(c)HSV試驗皰疹單式病毒1(HSV1)和2(HSV2)在多孔淺盤的Vero細(xì)胞的單細(xì)胞層中試驗。所用的病毒菌株對于HSV-1和HSV-2分別為SC16和186?；衔锏幕钚杂墒删邷p數(shù)試驗測定，其中細(xì)胞單細(xì)胞層用合適的HSV懸浮液感染，然后覆蓋上膠凝形式的營養(yǎng)羧甲基纖維素以確保病毒不擴散至整個培養(yǎng)物中。在營養(yǎng)羧甲基纖維素覆蓋層中加入已知體積克分子濃度的一定濃度范圍的化合物。在每一濃度下的噬菌斑數(shù)目以對照組的百分?jǐn)?shù)表示，畫出劑量一反應(yīng)曲線。
(d)CMV試驗人體細(xì)胞肥大病毒(HCMV)在多孔淺盤中在MRC5細(xì)胞(人體胚肺)的單細(xì)胞層中試驗，使用標(biāo)準(zhǔn)CMV菌株AD 169?；衔锏幕钚栽谑删邷p數(shù)試驗中測定，其中，單細(xì)胞層用HCMV懸浮液感染，然后覆蓋上營養(yǎng)羧甲基纖維素(膠凝形式)以確保病毒不擴散至整個培養(yǎng)物中。在營養(yǎng)覆蓋層中加入已知體積克分子濃度的一定濃度范圍的化合物。在每一藥物濃度下的噬菌斑數(shù)目用對照組的百分?jǐn)?shù)表示，畫出劑量一反應(yīng)曲線。
(e)MCMV試驗鼠細(xì)胞肥大病毒(MCMV)在多孔淺盤中培養(yǎng)的鼠成纖維細(xì)胞細(xì)胞線3T3克隆A31的單細(xì)胞層中試驗，使用MCMV菌株Osborn?；衔锘钚栽谑删邷p數(shù)試驗中測定，其中細(xì)胞單細(xì)胞層用MCMV懸浮液感染，然后覆蓋上營養(yǎng)羧甲基纖維素以確保病毒不擴散至整個培養(yǎng)物中。在營養(yǎng)覆蓋層中加入已知體積克分子濃度的一定濃度范圍的化合物。在每一藥物濃度下的噬菌斑數(shù)目以沒有藥物的對照組的百分?jǐn)?shù)表示，畫出劑量一反應(yīng)曲線。
(f)VZV試驗水痘帶狀皰疹病毒(VZV)的臨床分離物在MRC-5細(xì)胞的單細(xì)胞層中試驗，MRC-5細(xì)胞由人體胚肺組織中得到。使用噬菌斑減數(shù)試驗，其中，用病毒原種的懸浮液感染多孔淺盤中的細(xì)胞單細(xì)胞層。在孔中加入在已知體積克分子濃度試驗下的一定濃度范圍的化合物。在每一濃度下的噬菌斑數(shù)目用對照組的百分?jǐn)?shù)表示，構(gòu)成劑量-反應(yīng)曲線。從這些曲線可測定每種藥物的50%抑制濃度。
(g)HBV試驗(方法2)材料病毒/細(xì)胞所用的細(xì)胞線由肝胚細(xì)胞瘤細(xì)胞Hep G2得到，其用含有四個B型肝炎病毒基因組，亞型ayw的5’-3’串聯(lián)復(fù)制的質(zhì)粒傳染以產(chǎn)生命名為2∶2∶15的細(xì)胞線(Sells等人，PNAS 84 1005-1009，1987)。這些細(xì)胞帶有作為染色體集成順序和游離基因的Hep B DNA。這些細(xì)胞實質(zhì)上產(chǎn)生少量的病毒顆粒，較高的病毒生產(chǎn)克隆P5A由2.2.15細(xì)胞在試驗應(yīng)用中得到。
培養(yǎng)基細(xì)胞在含有0.5%青霉素和鏈霉素、2mM L-谷氨酰胺和10%胎牛犢血清的RPM1 1640中生長。
方法試驗在24孔板上進行，在板上用約2.5×104細(xì)胞/孔接種，并在37℃下在5%CO2中生長5天，單細(xì)胞層隨后用RPM1 1640 0.5%青霉素和鏈霉素、2mM L-谷氨酰胺和2%含有所需濃度的試驗化合物的FCS)培養(yǎng)5天。每48小時用含試驗化合物的新鮮培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基。將板培養(yǎng)10天，除去培養(yǎng)基，在0.5ml PBS中從孔中挖出細(xì)胞，細(xì)胞在5000rpm下造粒5分鐘，排出上清液，將細(xì)胞在-20℃冷凍。將細(xì)胞解凍，重新懸浮于500μl溶菌緩沖液(150mM NaCl，20mM Tris/HCl pH7.4，10mM EDTA和0.6% SDS)中并加入50μl蛋白酶K(20mg/ml)，樣品在37℃培養(yǎng)2小時。在Autogen 540DNA萃取器中萃取DNA并溶解在最終體積為50μl的水中。DNA用限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ在37℃消化16小時，在1%瓊脂糖凝膠上分離DNA片段。分離的DNA通過毛細(xì)管吸濾轉(zhuǎn)移至hybond N+尼龍薄膜(Amersham International)在預(yù)雜交之后，在50%甲酰胺存在下，在42℃，用B型肝炎B基因組的核區(qū)的32P標(biāo)記的陽性菌株RNA轉(zhuǎn)錄本，亞型ayw雜雜交過夜。在徹底洗滌后，污斑暴露于X-射線薄膜，由Milli Pore 610成象儀分析復(fù)制中間體DNA的雜交強度。比較不含試驗化合物的對照組樣品和已知陽性化合物的結(jié)果。
(h)細(xì)胞毒性細(xì)胞毒性在細(xì)胞生長抑制試驗中測試。在96孔微滴盤上生長的Vero細(xì)胞的亞融合培養(yǎng)物暴露于不同的藥物稀釋液，每天用四唑鎓(MTT)的吸收測定受體培養(yǎng)物每天的細(xì)胞生存性。在96小時抑制50%細(xì)胞生存性所需的濃度稱之為CCID50。
權(quán)利要求
1.式(Ⅰ)的化合物
其中R1表示-鹵素、-NR2R3，其中R2和R3可以是相同的或不同的，每個代表H、C1-6烷基、C3-6環(huán)烷基、C2-6烯基、苯基或苯基C1-3烷基(其中苯基部分可任意地被選自鹵素、C1-6烷氧基、硝基、氰基、氨基和C1-6烷基的一個或多個取代基取代)，或R2R3和與它們相連的N原子連接在一起形成3-、4-、5-、6-或7-元雜環(huán)，所述雜環(huán)除上述N原子外還任意地含有一個或多個任意地選自O(shè)和N的雜原子；-S(=O)nR4，其中n為0、1或2，R4代表C1-6烷基、C3-6環(huán)烷基、C3-6環(huán)烷基、C1-3烷基、C1-4烷氧基、苯基或苯基C1-3烷基(其中苯基部分可任意地被選自鹵素、C1-6烷氧基、硝基、氰基、氨基和C1-6烷基的取代基取代)，或當(dāng)n為0時，R4代表H；-S(=O)mOR4a，其中m為0、1或2，R4a代表C1-6烷基、C3-6環(huán)烷基、C3-6環(huán)烷基C1-3烷基、C1-4烷氧基、苯基或苯基C1-3烷基(其中苯基部分可任意地被選自鹵素、C1-6烷氧基、硝基、氰基、氨基和C1-6烷基的取代基取代)；-OR5，其中R5代表C1-6烷基、C3-6環(huán)烷基、C3-6環(huán)烷基C1-3烷基、苯基或苯基C1-3烷基(其中苯基部分可任意地被選自鹵素、C1-6烷氧基、硝基、氰基、氨基和C1-6烷基的取代基取代)；-C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基；其前提是，當(dāng)R1代表-NR2R3時，R2和R3不同時為H；或它們的鹽、酯或其他生理機能衍生物或其任何的溶劑化物。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中R1代表鹵素;-OR5，其中R5代表C1-4烷基、C3-6環(huán)烷基、C3-6環(huán)烷基C1-3烷基;-NR2R3，其中R2是H或C1-3烷基和R3為C3-6環(huán)烷基、C1-6烷基、C2-6烯基;或R2、R3和與它們相連的N原子一起形成4-、5-或6-元雜環(huán)，所述雜環(huán)任意地含有除上述N原子以外的一個或多個任意地選自O(shè)和N的雜原子;-S(＝O)nR4，其中n為0和R4表示H或C1-3烷基;或其鹽、酯或其他生理機能衍生物或其任何的溶劑化物。
3.權(quán)利要求1或2的化合物，其中R1代表-NR2R3，其中R2是H，R3是C3-6環(huán)烷基，或其鹽、酯或其他生理機能衍生物或其任何的溶劑化物。
4.權(quán)利要求1的化合物，其選自2-氨基-6-環(huán)丙基甲氧基-9-(2-脫氧-4-硫代-β-D-紅-五呋喃糖基)-9H-嘌呤;2-氨基-9-(2-脫氧-4-硫代-β-D-紅-五呋喃糖基)-6-甲氧基-9H-嘌呤;2-氨基-9-(2-脫氧-4-硫代-β-D-紅-五呋喃糖基)-6-甲硫基-9H-嘌呤;2-氨基-9-(2-脫氧-4-硫代-β-D-紅-五呋喃糖基)-6-(環(huán)丙基甲基氨基)-9H-嘌呤;2-氨基-9-(2-脫氧-4-硫代-β-D-紅-五呋喃糖基)-6-(乙基甲基氨基)-9H-嘌呤;2-氨基-9-(2-脫氧-4-硫代-β-D-紅-五呋喃糖基)-6-異丙基氨基-9H-嘌呤;2-氨基-9-(2-脫氧-4-硫代-β-D-紅-五呋喃糖基)-6-N-哌啶子基-9H-嘌呤;2-氨基-9-(2-脫氧-4-硫代-β-D-紅-五呋喃糖基)-6-正丙基氨基-9H-嘌呤;2-氨基-9-(2-脫氧-4-硫代-β-D-紅-五呋喃糖基)-6-N-吡咯烷基-9H-嘌呤;2-氨基-9-(2-脫氧-4-硫代-β-D-紅-五呋喃糖基)-6-烯丙基氨基-9H-嘌呤;或其鹽、酯或其他的生理機能衍生物或其任何的溶劑化物。
5.2-氨基-6-(環(huán)丙基氨基)-9-(2-脫氧-4-硫代-β-D-紅-五呋喃糖基)-9H-嘌呤。
6.2-氨基-6-(環(huán)丙基氨基)-9-(2-脫氧-4-硫代-β-D-紅-五呋喃糖基)-9H-嘌呤的生理機能衍生物。
7.權(quán)利要求1至5的任何之一所要求的化合物或其生理機能衍生物在治療中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1至5的任何之一所要求的化合物或其生理機能衍生物在制備用于治療或預(yù)防病毒感染的藥物中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求8的應(yīng)用，其中病毒感染選自皰疹病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、肝炎病毒、柯薩奇病毒和C型肝炎病毒感染。
10.權(quán)利要求9的應(yīng)用，其中皰疹病毒感染是選自皰疹單純性病毒1、皰疹單純性病毒2、水痘帶狀皰疹病毒、肥大細(xì)胞病毒、EB病毒和人體皰疹病毒6感染。
11.權(quán)利要求10的應(yīng)用，其中皰疹病毒感染是肥大細(xì)胞病毒。
12.權(quán)利要求9的應(yīng)用，其中肝炎病毒感染是B型肝炎病毒感染。
13.藥物制劑，其含有至少一種權(quán)利要求1至5的任何之一所要求的式(Ⅰ)化合物或其生理機能衍生物和至少一種藥物可接受的載體。
14.權(quán)利要求13的制劑，其為單位劑量形式。
15.權(quán)利要求14的制劑，其為片劑或膠囊形式。
16.權(quán)利要求1至6的任何之一化合物的制備方法其包括(A)使式(Ⅱ)的嘌呤堿
其中R1如權(quán)利要求1中限定或其功能等同物，與如下式(Ⅲ)的化合物反應(yīng)
其中R6和R7是相同的或不同的，每個代表H或羥基保護基團，A是磷酸基團或其鹽或除(Ⅱ)以外的嘧啶或嘌呤部分或離去基團，以形成如權(quán)利要求1限定的式(Ⅰ)化合物;或(B)使如下式(Ⅳ)的化合物與一種或多種試劑和/或在使R8轉(zhuǎn)化為所需的R1基團的條件下反應(yīng)
其中R6和R7如上文中所定義，R8代表權(quán)利要求1中定義的R1的前體;和隨后或同時進行一步或多步如下任意的轉(zhuǎn)化過程(ⅰ)除去任何殘余的保護基團;(ⅱ)在形成式(Ⅰ)化合物時，將其轉(zhuǎn)化為式(Ⅰ)化合物的鹽、酯或其他生理機能衍生物;或(ⅲ)在形成式(Ⅰ)化合物的鹽、酯或其他生理機能衍生物或其任何溶劑化物時，將衍生物轉(zhuǎn)化為式(Ⅰ)化合物或式(Ⅰ)化合物的不同衍生物;(ⅳ)如果需要，分離出式(Ⅰ)化合物或其被保護的衍生物或式(Ⅰ)化合物的生理上可接受的衍生物的α和β異頭物。
全文摘要
本發(fā)明涉及某些新的2′-脫氧-4′-硫代-嘌呤核苷、它們的生理機能衍生物、它們的制備方法、含有它們的藥物制劑和在治療中，尤其在病毒感染的治療或預(yù)防中的應(yīng)用。
文檔編號A61K31/7076GK1087089SQ9310952
公開日1994年5月25日 申請日期1993年7月1日 優(yōu)先權(quán)日1992年7月2日
發(fā)明者G·W·科薩爾卡, N·A·范德拉倫, C·A·弗里曼, S·A·肖特 申請人:惠爾康基金會集團公司