專利名稱：具有抗微生物活性的模板固定的肽模擬物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了如下定義的引入12個a -氨基酸殘基的模板固定鏈的模板固定的^ -發(fā)夾肽模擬物，所述殘基根據(jù)其在鏈中的位置是Gly，或Pro，或特定的類型。這些模板固定的3-發(fā)夾模擬物具有選擇性的抗微生物活性。此外，本發(fā)明提供了有效的合成方法，通過該方法，可以根據(jù)需要以平行庫形式來制備這些化合物。這些3-發(fā)夾肽模擬物顯示出提高的功效、生物利用率、半衰期，最重要的是顯著提高的抗細(xì)菌活性(一方面)和紅細(xì)胞的溶血(另一方面)之間的比率。
背景技術(shù)：
不斷增加的微生物對已有抗生素的耐藥性問題刺激了開發(fā)具有新作用模式的新抗微生物劑的強烈興趣(H. Breithaupt, Nat. Biotechnol. 1999,17,1165-1169)。一類新興的抗生素是基于天然存在的陽離子肽(T. Ganz, R. I. Lehrer, Mol. Medicine Today 1999,5,292-297 ；R. M. Epand, H. J. Vogel, Biochim. Biophys. Actal999，1462，11-28)。這些包括二硫橋接的P -發(fā)夾和P -折疊肽(如蛋白溶菌素(protegrin) [V. N. . M. ；0. V. Shamova,H. A. Korneva, R. I. Lehrer, FEBSLett. 1993, 327, 231-236]，當(dāng)素[T. Nakamura, H. Furunaka,T. Miyata, F. Tokunaga, T. Muta, S. Iwanaga, M. Niwa, T. Takao, Y. Shimonishi, Y. J. Biol.Chem. 1988，263，16709-16713]，和防御素[R. I. Lehrer, A. K. Lichtenstein, T. Ganz，Annu.Rev. Immunol. 1993，11，105-128]，兩性a -螺旋肽(例如，殺菌肽、皮抑菌肽、馬加寧和蜂毒素[A. Tossi, L. Sandri, A. Giangaspero,Biopolymers 2000, 55,4-30]),以及其他線性和環(huán)狀結(jié)構(gòu)肽。盡管抗微生物陽離子肽的作用機理還沒有得到充分的了解，它們主要的相互作用位點是微生物細(xì)胞膜(H. ff. Huang, Biochemistry2000，39，8347-8352 )。暴露于這些試劑時，細(xì)胞膜經(jīng)歷透化作用，接著是快速細(xì)胞死亡。然而，目前不能排除更復(fù)雜的作用機理，例如，涉及受體介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)(M. Wu, E. Maier, R. Benz, R. E. Hancock, Biochemistry 1999,38,7235-7242)。這些陽離子肽中許多的抗微生物活性通常與其優(yōu)選的次級結(jié)構(gòu)相關(guān)，不管是在水溶液或是在膜樣環(huán)境中觀察到的(N. Sitaram, R. Nagaraj, Biochim. Biophys.Actal999，1462，29-54)。通過核磁共振(NMR)光譜的結(jié)構(gòu)研究已經(jīng)表明陽離子肽如蛋白溶菌素 I (A. Aumelas, M. Mangoni, C. Roumestand, L. Chiche, E. Despaux, G. Grassy,
B.Calas,A.Chavanieu,A. Eur. J. Biochem. 1996, 237, 575-583 ；R. L. Fahrner,T. Dieckmann,S. S. L. Harwig, R. I. Lehrer, D. Eisenberg, J. Feigon, J. Chem. Biol. 1996, 3, 543-550)和當(dāng)素 I (K. Kawano, T. Yoneya, T. Miyata, K. Yoshikawa, F. Tokunaga, Y. Terada,S. J. Iwanaga, S. J. Biol. Chem. 1990，265，15365-15367)由于兩個二硫橋的限制作用而呈現(xiàn)出明確的￠-發(fā)夾構(gòu)象。在缺乏這些二硫鍵中的一個或兩個的蛋白溶菌素類似物中，￠-發(fā)夾構(gòu)象的穩(wěn)定性下降，并且抗微生物活性降低(J.Chen，T. J. Falla, H. J. Liu,M. A. Hurst, C. A. Fujii, D. A. Mosca, J. R. Embree D. J. Loury, P. A. RadeI, C. C. Chang, L. Gu,J. C. Fiddes, Biopolymers2000, 55, 88-98 ；S. L. Harwig, A. Waring, H. J. Yang, Y. Cho,L. Tan, R. I. Lehrer, R. J. Eur. J. Biochem. 1996, 240, 352-357 ；M. E. Mangoni, A. Aumelas,P. Charnet, C. Roumestand, L. Chiche, E. Despaux, G. Grassy, B. Calas, A. Chavanieu, FEBSLett. 1996,383,93-98 ；H. Tamamura, T.Murakami, S.Noriuchi, K.Sugihara, A.Otaka,ff. Takada, T. Ibuka, M. Waki, N. Tamamoto, N. Fujii, Chem. Pharm. Bull. 1995,43,853-858)。對當(dāng)素 I 的類似物(H. Tamamura，R. Ikoma, M. Niwa, S. Funakoshi, T. Murakami, N. Fujii,Chem. Pharm. Bull. 1993，41，978-980)和兔防御素 NP-2 的發(fā)夾-環(huán)模擬物(S. Thennarasu,R. Nagaraj, Biochem. Biophys. Res. Comm. 1999, 254, 281-283)進行了相似的觀察。這些結(jié)果表明，￠-發(fā)夾結(jié)構(gòu)在這些蛋白溶菌素樣肽的抗微生物活性和穩(wěn)定性中起著重要作用。在偏愛a -螺旋結(jié)構(gòu)的陽離子肽的情況下，螺旋的兩性結(jié)構(gòu)似乎在確定抗微生物活性中起著關(guān)鍵作用(A. Tossi, L. Sandri, A. Giangaspero, A. Biopolymers2000, 55,4-30)。短桿菌肽S 是具有明確 P -發(fā)夾結(jié)構(gòu)的主鏈-環(huán)肽(S. E. Hull, R. Karlsson, P. Main, M. M. woolfson,E. J. Dodson, Nature 1978, 275，206-275)，呈現(xiàn)出有效的對抗革蘭氏陽性和革蘭氏陰 性細(xì)菌的抗微生物活性(L. H. Kondejewski, S. ff. Farmer, D. S. Wishart, R. E. Hancock,R. S. Hodges, Int. J. Peptide Prot. Res. 1996,47,460-466)。然而，短桿菌妝 S 的高 溶血活性阻礙了它作為抗生素的廣泛使用。NMR的最新結(jié)構(gòu)研究表明，高溶血活性明顯與該環(huán)狀0 -發(fā)夾樣分子的高度兩性性質(zhì)有關(guān)，但可以通過調(diào)整構(gòu)象和兩親性而使抗微生物活性和溶血活性分離(L. H. Kondejewski, M. Jelokhani-Niaraki, S. ff. Farmer, B. Lix, M. Kay,
B.D. Sykes, R. E. Hancock, R. S. Hodges, J. Biol. Chem. 1999, 274,13181-13192 ；C. McInnesL.H. Kondejewski, R. S. Hodges, B.D.Sykes, J. Biol. Chem. 2000,275,14287-14294)。最近報道了一種來自靈長類白血球的新環(huán)狀抗微生物肽RTD-I (Y. -Q. Tang,J. Yuan, G. OSdpayj K. Osapayj D. Tran, C. J. Miller, A. J. Oellette, M. E. Selsted,Sciencel999，286，498-502)。這個肽含有三個二硫橋，其用于將環(huán)肽主鏈限制成發(fā)夾幾何。這三個二硫鍵的斷裂導(dǎo)致抗微生物活性的顯著損失。還報道了含有環(huán)肽主鏈，以及多個二硫橋以加強兩性發(fā)夾結(jié)構(gòu)的蛋白溶菌素(J. P. Tam, C. Wu, J. -L. Yang, Eur. J. Biochem. 2000,267,3289-3300)和鱟素(J.-P. Tam，Y.-A. Lu，J. _L. Yang，Biochemistry2000，39，7159-7169 ；N. Sitaram, R. Nagarai j,Biochem. Biophys. Res. Comm. 2000, 267, 783-790)的類似物。在這些情況下，所有胱氨酸限制的去除并不總是導(dǎo)致大的抗微生物活性損失，但卻調(diào)整了溶膜選擇性(J. P. Tam, C. ffu, J. -L. Yang, Eur. J. Biochem. 2000，267，3289-3300)。設(shè)計新的選擇性陽離子抗微生物肽的關(guān)鍵問題是生物利用率、穩(wěn)定性和降低的溶血活性。天然存在的蛋白溶菌素和鱟素對人紅細(xì)胞產(chǎn)生明顯的溶血活性。這種情況對于蛋白溶菌素類似物如IB367也是如此(J. Chen, T. J. Falla, H. J. Liu, M. A. Hurst,
C.A. Fujii, D. A. Mosca, J. R. Embree, D. J. Loury, P. A. RadeI, C. C. Chang, L. Gu, J. C. Fiddes,Biopolymers 2000, 55,88-98 ；C. Chang, L. Gu, J. Chen, US-Pat :5, 916, 872,1999)。該高溶血活性基本上排除了將其體內(nèi)使用，并且表示臨床應(yīng)用中的一個嚴(yán)重缺點。另外，類似物的抗生素活性通常隨著鹽濃度的增加而明顯下降，使得在體內(nèi)條件下(約100-150mM NaCl)抗微生物活性明顯下降。蛋白溶菌素I在低和高鹽分析中呈現(xiàn)出對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌以及真菌的功效和類似活性。該寬抗微生物活性與快速作用模式，及其殺死耐受其它類別抗生素的細(xì)菌的能力相結(jié)合，使得它們成為開發(fā)臨床上有用的抗生素的有吸引力的目標(biāo)。對抗革蘭氏陽性細(xì)菌的活性通常高于對抗革蘭氏陰性細(xì)菌的活性。然而，蛋白溶菌素I還呈現(xiàn)出對抗人紅細(xì)胞的高溶血活性，并且因此對微生物細(xì)胞的低選擇性。定向CD實驗(ff. T. Heller, A. J. Waring, R. I. Lehrer, H. ff. Huang,Biochemistry 1998，37，17331-17338)表明蛋白溶菌素I在與膜相互作用時可以呈現(xiàn)出兩種不同的狀態(tài)，而且這些狀態(tài)明顯受到脂質(zhì)組成的影響。對環(huán)狀蛋白溶菌素類似物的研究(J.-P. Tam, C. ffu, J. -L. Yang, Eur.J. Biochem. 2000，267，3289-3300)已經(jīng)顯示，由主鏈環(huán)化和多個二硫橋引起的構(gòu)象剛性的增加可以產(chǎn)生溶膜選擇性，這使得抗微生物活性與溶血活性分開，至少在所研究系列的化合物中是如此。蛋白溶菌素I是具有酰胺化羧基末端和兩個二硫橋的18殘基線性肽。鱟素I含有17個殘基，也具有酰胺化羧基末端和含有兩個二硫橋。最近描述的主鏈-環(huán)狀蛋白溶菌素和鱟素類似物通常含有18個殘基和最高三個二硫橋(J. P. Tam, C. ffu, J. -L. Yang, Eur.J. Biochem. 2000，267，3289-3300 ； J. P. Tam，Y. -A. Lu，J. -L Yang，Biochemistry 2000，39，
7159-7169 ；N. Sitaram, R. Nagarai j, Biochem. Biophys. Res. Comm. 2000，267，783-790)。目前正在研究的抗菌肽(Cathelicidin) (37-殘基線性螺旋型陽離子肽)和類似物被用作囊性纖維化(CF)肺疾病的吸入治療劑(L. Saiman, S. Tabibi，T. D. Starner，P. San Gabriel，P. L Winokur, H. P. Jia，P. B. McGray, Jr.，B. F. Tack, Antimicrob. AgentandChemother. 2001,45, 2838-2844 ；R.E. W.Hancock, R. Lehrer, Trends Biotechnol. 1998，16,82-88) o超過80%的CF病人受到銅綠假單胞菌的慢性感染(C. A. Demko, P. J. Biard,P. B. Davies, J. Clin. Epidemiol. 1995,48,1041-1049 ；E. M. Kerem, R. Gold，H. Levinson,J. Pediatn 1990，116，714-719)。對抗假單胞菌的其它抗微生物肽(Y. H. Yau, B. Ho，N. S. Tan，M. L Ng, J. L Ding，Antimicrob. Agent and Chemother. 2001，45，2820-2825 和其中引用的參考文件)，如FALL-39，SMAP-29，和鱗翅目昆蟲殺菌肽呈現(xiàn)出較少的所需特性，如寬范圍pH內(nèi)的有效抗微生物活性、快速殺死率和低溶血活性。在以下描述的化合物中，引入了新的策略來穩(wěn)定呈現(xiàn)出選擇性抗微生物活性的主鏈-環(huán)狀陽離子肽模擬物中的￠-發(fā)夾構(gòu)象。這包括將陽離子和疏水性發(fā)夾序列移植到模板上，模板的功能是將肽環(huán)主鏈限制成發(fā)夾幾何。文獻中已經(jīng)描述了結(jié)合模板的發(fā)夾模擬物肽(D, Obrecht, M. Altorfer,J. A. Robinson, Adv. Med. Chem. 1999,4,1-68 ；J. A. Robinson, Syn. Lett. 2000,4,429-441),并且目前已經(jīng)建立了使用組合和平行合成方法產(chǎn)生P -發(fā)夾肽模擬物的能力(L. Jiang,K. Moehle, B. Dhanapal, D. Obrecht, J. A. Robinson, Helv. Chim. Acta. 2000,83, 3097-3112)。國際專利申請W002/070547A1和W02004/018503A1中已經(jīng)描述了抗菌的模板固定的肽模擬物及其合成方法，但這些分子沒有呈現(xiàn)出高的血漿穩(wěn)定性選擇性和特別高的功效。

發(fā)明內(nèi)容
在此所述的方法能夠合成和篩選大的發(fā)夾模擬物庫，這隨后明顯有助于結(jié)構(gòu)-活性研究，并因此發(fā)現(xiàn)具有有效選擇性抗微生物活性和對人紅細(xì)胞非常低的溶血活性的新分子。本方法能夠合成對各種多藥物耐藥性假單胞菌菌株具有新選擇性的3-發(fā)夾肽模擬物。本發(fā)明的P -發(fā)夾肽模擬物是具有以下通式的化合物
權(quán)利要求
1.以下通式的化合物
2.根據(jù)權(quán)利要求I的通式I的化合物，其中模板是dPix)-LPix)并且位置1-12的氨基酸殘基是 -Pl Thr ； -P2 Trp ； -P3 Ile ；-P4 Dab ；-P5 Lys ；-P6 Dab ；-P7 Dab ；-P8 Trp ；-P9 Dab ； -PlO Dab ； -PU Ala ;和 -PI2 Dab0
3.根據(jù)權(quán)利要求I的通式I的化合物，其中模板是DPr0-Lpix)并且位置1-12的氨基酸殘基是-Pl Thr ；-P2 Trp ；-P3 Ile ；-P4 Dab ；-P5 Lys ；-P6 Dab ；-P7 Dab ；-P8 Trp ；-P9 Dab ；-PlO Dab ； -PU Gly ;和 -PI2 Dab0
4.根據(jù)權(quán)利要求I的通式I的化合物，其中模板是DPr0-Lpix)并且位置1-12的氨基酸殘基是-Pl Thr ；-P2 Trp ；-P3 Ile ；-P4 Dab ；-P5 Lys ；-P6 Dab ；-P7 Dab ；-P8 Trp ；-P9 Dab ；-PlO Dab ； -PU Abu ;和 -PI2 Dab0
5.根據(jù)權(quán)利要求I的通式I的化合物，其中模板是DPr0-Lpix)并且位置1-12的氨基酸殘基是-Pl Thr ；-P2 Trp ；-P3 Ile ；-P4 Dab ；-P5 Lys ；-P6 Dab ；-P7 Dab ；-P8 Trp ；-P9 Dab ；-PlO Dab ； -PU Thr ;和 -P12 Dab o
6.根據(jù)權(quán)利要求I的通式I的化合物,其中模板是DPro-Lpro并且位置1_12的氨基酸殘基是-Pl Thr ；-P2 Tyr ；-P3 :Ile ；-P4 Dab ；-P5 Lys ；-P6 Dab ；-P7 Dab ；-P8 Trp ；-P9 Dab ；-PlO Dab ；-PII Ala ;和-P12 Dab o
7.根據(jù)權(quán)利要求I的通式I的化合物,其中模板是DPro-Lpro并且位置1_12的氨基酸殘基是-Pl Ala ；-P2 Trp ；-P3 Ile ；-P4 Dab ；-P5 Lys ；-P6 Dab ；-P7 Dab ；-P8 Trp ；-P9 Dab ；-PlO Dab ；-PII Ala ;和-PI2 Dab0
8.根據(jù)權(quán)利要求I的通式I的化合物，其中模板是DPr0-Lpix)并且位置1-12的氨基酸殘基是-Pl Thr ；-P2 Trp ；-P3 Ile ；-P4 Lys ；-P5 Lys ；-P6 Dab ；-P7 Dab ；-P8 Trp ；-P9 Dab ；-PlO Dab ； -PU Ala ;和 -PI2 Dab0
9.根據(jù)權(quán)利要求I的通式I的化合物，其中模板是DPr0-Lpix)并且位置1-12的氨基酸殘基是-Pl Thr ；-P2 Trp ；-P3 Ile ；-P4 Dab ；-P5 Lys ；-P6 Lys ；-P7 Dab ；-P8 Trp ；-P9 Dab ；-PlO Dab ； -PU Ala ;和 -PI2 Dab0
10.根據(jù)權(quán)利要求I的通式I的化合物，其中模板是DPIX)-LPIX)并且位置1-12的氨基酸殘基是-Pl Thr ；-P2 Trp ；-P3 Ile ；-P4 Dab ；-P5 Lys ；-P6 Dab ；-P7 Dab ；-P8 Trp ；-P9 Dab ；-PlO Dab ； -PU Ala ;和 -P12 :Lys0
11.根據(jù)權(quán)利要求I的通式I的化合物，其中模板是DPr0-Lpix)并且位置1-12的氨基酸殘基是-Pl Thr ；-P2 Trp ；-P3 Ile ；-P4 Gln ；-P5 Lys ；-P6 Dab ；-P7 Dab ；-P8 Trp ；-P9 Dab ；-PlO Dab ； -PU Ala ;和 -PI2 Dab0
12.根據(jù)權(quán)利要求I的通式I的化合物，其中模板是DPIX)-LPIX)并且位置1-12的氨基酸殘基是-Pl Thr ；-P2 Trp ；-P3 Val ；-P4 Dab ；-P5 Lys ；-P6 Dab ；-P7 Dab ；-P8 Trp ；-P9 Dab ；-PlO Dab ； -PU Ala ;和 -PI2 Dab0
13.根據(jù)權(quán)利要求I的通式I的化合物，其中模板是DPr0-Lpix)并且位置1-12的氨基酸殘基是-Pl Thr ；-P2 Trp ；-P3 Ile ；-P4 Dab ；-P5 Lys ；-P6 Dab ； -P7 Dab ； -P8 Trp ； -P9 Dab ； -PlO Dab ； -PU Hse ;和 -PI2 Dab0
14.根據(jù)權(quán)利要求I的通式I的化合物，其中模板是DPr0-Lpix)并且位置1-12的氨基酸殘基是 -Pl Thr ； -P2 Trp ； -P3 Ile ； -P4 Gln ； -P5 Lys ； -P6 Dab ； -P7 Dab ； -P8 Trp ； -P9 Dab ； -PlO Dab ； -PU Ala ;和 -P12 :Gln。
15.根據(jù)權(quán)利要求I的通式I的化合物，其中模板是DPr0-Lpix)并且位置1-12的氨基酸殘基是 -Pl Glu ； -P2 Trp ； -P3 Ile ； -P4 Dab ； -P5 Lys ； -P6 DDab ； -P7 Dab ； -P8 Trp ； -P9 Dab ； -PlO Dab ； -PU Ala ;和 -P12 :Gln。
16.根據(jù)權(quán)利要求I的通式I的化合物，其中模板是DPr0-Lpix)并且位置1-12的氨基酸殘基是 -Pl Glu ； -P2 Trp ；-P3 Ile ； -P4 Gln ； -P5 Lys ； -P6 Dab ； -P7 Dab ； -P8 Ser ； -P9 Dab ； -PlO Dab ；-PU Ala ;和-P12 SerD
17.含有根據(jù)權(quán)利要求I至16任一項的化合物和藥物學(xué)上惰性載體的藥物組合物。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的組合物，是適用于口服、局部、或注射的形式。
19.根據(jù)權(quán)利要求17的組合物，是適用于經(jīng)粘膜的形式。
20.根據(jù)權(quán)利要求17的組合物，是適用于經(jīng)皮、口腔或肺部給藥的形式。
21.根據(jù)權(quán)利要求17或18的組合物，是片劑、糖錠、膠囊、液體、凝膠、霜劑、膏劑、噴霧或栓劑的形式。
22.根據(jù)權(quán)利要求17或18的組合物，是溶液或懸浮液的形式。
23.根據(jù)權(quán)利要求17或18的組合物，是糖漿的形式。
24.根據(jù)權(quán)利要求I至16任一項的化合物的用途，用于制備治療或預(yù)防感染或與該感染相關(guān)的疾病的藥物。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的用途，其中所述感染與呼吸道疾病相關(guān)；與皮膚或軟組織疾病相關(guān)；與胃腸疾病相關(guān)；與眼疾病相關(guān)；與耳疾相關(guān)；與CNS疾病相關(guān)；與骨病相關(guān)；與心血管疾病相關(guān)；與gastrourinal疾病相關(guān)；與癌癥相關(guān)；或與H IV相關(guān)。
26.根據(jù)權(quán)利要求I至16任一項的化合物的用途，作為殺菌劑或防腐劑，用于食品、化妝品和藥物。
27.根據(jù)權(quán)利要求1-16任一項的化合物的制備方法，該方法包括 Ca)將適當(dāng)官能化的固體支持物與在所需終產(chǎn)物中處于位置5，6或7的氨基酸的適當(dāng)N-保護衍生物偶聯(lián)，可存在于所述N-保護氨基酸衍生物中的任何官能團同樣得到適當(dāng)保護； (b)從如此得到的產(chǎn)物中去除N-保護基團； (c)將如此得到的產(chǎn)物與在所需終產(chǎn)物中接近N-端氨基酸殘基的一個位置的氨基酸的適當(dāng)N-保護衍生物偶聯(lián)，可存在于所述N-保護氨基酸衍生物中的任何官能團同樣得到適當(dāng)保護； Cd)從如此得到的產(chǎn)物中去除N-保護基團； (e )重復(fù)步驟(c )和(d)直至N-端氨基酸殘基已被引入； (f)將如此得到的產(chǎn)物與具有以下通式的化合物偶聯(lián)
28.根據(jù)權(quán)利要求1-16任一項的化合物的制備方法，該方法包括 (a’ )將適當(dāng)官能化的固體支持物與具有以下通式的化合物偶聯(lián)
全文摘要
說明書和權(quán)利要求中限定了通式(I)的模板固定的β-發(fā)夾肽模擬物及其鹽，其中Z是模板固定的12個α-氨基酸殘基的鏈，這些殘基根據(jù)它們在鏈中的位置(從N-端氨基酸開始計數(shù))，是Gly或Pro，或是特定類型的，上述通式中剩余的符號亦是如此，該肽模擬物具有選擇性地抑制微生物如銅綠假單胞菌生長或殺滅微生物的特性。它們可以用作殺菌劑，用于食品、化妝品、藥物或其他含營養(yǎng)素的物質(zhì)，或作為藥物，用于治療或預(yù)防感染?？梢酝ㄟ^基于混合的固相和液相合成策略的方法來制備這些β-發(fā)夾肽模擬物。
文檔編號A61P13/00GK102796179SQ20121024558
公開日2012年11月28日 申請日期2007年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月16日
發(fā)明者F·貢貝特, D·奧伯萊希特, W·維利吉伯羅德, R·蒂亞斯, S·J·德馬科, J·A·羅賓遜, N·斯里尼瓦斯 申請人:波利弗爾有限公司, 蘇黎世大學(xué)