專利名稱：治療或預(yù)防癌癥的藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療或預(yù)防癌癥的方法和藥物以及抗癌藥物篩選方法。
背景技術(shù)：
人轉(zhuǎn)錄正輔因子4(PC4，也稱pl4、pl5、Subl的同源類似物等)是一種單鏈DNA結(jié)合蛋白，這種蛋白由127個氨基酸殘基組成且靠近N-端有數(shù)個絲氨酸富集區(qū)。PC4已被克隆并鑒定為一種能通過與許多序列特異性和細(xì)胞特異性調(diào)節(jié)子直接作用來介導(dǎo)許多基因的轉(zhuǎn)錄活化的通用正輔因子(參見文獻(xiàn)Ge等，Cell (1994) 78 :513-523 ；Kretzschmar, Μ.等， Cell (1994) 78 :525-534)。PC4直接作用的這些調(diào)節(jié)子包括許多核激素受體、腫瘤抑制子、 癌蛋白、以及腫瘤的發(fā)生過程和其他人類疾病的病變過程中所必須的重要因子。腫瘤抑制蛋白P53直接與PC4蛋白在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生相互作用，從而控制了 PC4的表達(dá)。另外，PC4作為P53的唯一激活子可以調(diào)節(jié)許多參與細(xì)胞周期、凋亡、DNA修復(fù)和其他細(xì)胞應(yīng)答的基因的轉(zhuǎn)錄(參見文獻(xiàn)Kishore A. H.等，Biochem. J. (2007) BJ20070390 ； Banerjee, S.等，Mol. Cell Biol. (2004)24:2052-2062)。PC4 的活性受到翻譯后修飾的進(jìn)一步調(diào)節(jié)，該翻譯后修飾的類型至少包括磷酸化修飾和乙?；揎?。PC4被磷酸化修飾之后，其與目標(biāo)激活因子作用的活性被抑制且能反向介導(dǎo)其輔激活因子的功能。質(zhì)譜分析結(jié)果表明體內(nèi)的PC4超磷酸化修飾主要由酪蛋白激酶II介導(dǎo)且僅發(fā)生在N-端絲氨酸富集區(qū)(參見文獻(xiàn) Ge 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91 :12691-12695) PC4 的乙?；揎椨蒔300介導(dǎo)且受到磷酸化修飾的抑制(Kumor, P. B. R.等，J. Biol. Chem. (2001)276 16804-16809)。到目前為止，大家還不清楚PC4在調(diào)節(jié)基因中所起的作用是否與癌癥或腫瘤的發(fā)生有關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明人采用了包括爪蟾卵母細(xì)胞系、人體組織、其他哺乳動物細(xì)胞系在內(nèi)的不同的模式生物體系，驚奇地發(fā)現(xiàn)PC4具有癌蛋白的功能且在細(xì)胞分化、腫瘤發(fā)育和病變的過程中起重要作用，見圖10示出的PC4的多種功能，所有這些功能，尤其是圖10中標(biāo)注下劃線的功能，都與癌癥發(fā)病機(jī)理相關(guān)或者是癌癥發(fā)病的基礎(chǔ)。特別是，發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)在很多惡性腫瘤組織中，如在肺癌組織、膀胱癌組織、結(jié)腸癌組織、乳腺癌組織、子宮內(nèi)膜癌組織、 甲狀腺癌組織、小腸癌組織中，都發(fā)現(xiàn)PC4在蛋白水平被活化。相反，在相應(yīng)的沒有經(jīng)歷過快速生長的正常組織中的PC4的蛋白水平?jīng)]有升高。在癌細(xì)胞系和其他轉(zhuǎn)化細(xì)胞系中還發(fā)現(xiàn)了 PC4RNA水平的升高，但是在原代細(xì)胞系中并沒有發(fā)現(xiàn)。例如，發(fā)明人測定了非洲爪蟾的變態(tài)發(fā)育過程中的PC4的表達(dá)水平。測定方法如下收集不同發(fā)育階段的非洲爪蟾的整體溶解產(chǎn)物，監(jiān)測每個溶解產(chǎn)物的蛋白含量，選取 50ug每個階段溶解產(chǎn)物中的總蛋白，上SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分析，然后將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維膜上，最后進(jìn)行蛋白印跡分析，即采用抗PC4的多克隆抗體來檢測被轉(zhuǎn)到硝酸纖維膜上的蛋白。測定結(jié)果如圖5A、圖5B和圖5C所示，PC4的表達(dá)水平與非洲爪蟾蜍變態(tài)發(fā)育過程相關(guān)，當(dāng)前變態(tài)發(fā)育開始時，PC4在56 58這個階段被顯著活化。發(fā)明人通過轉(zhuǎn)染檢測實(shí)驗(yàn)證明PC4與細(xì)胞死亡相關(guān)。將人PC4編碼區(qū)(野生型的或絲氨酸富集區(qū)突變型的人PC4編碼區(qū))與綠色熒光蛋白(GFP)的編碼區(qū)融合后，再亞克隆到包含有CMV啟動子哺乳動物表達(dá)載體(pcDNA3. 1)中，再將得到合成載體瞬時轉(zhuǎn)染到 HeLa 細(xì)胞(參見 Ge 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91 :12691-12695) 轉(zhuǎn)染后 M 小時，在激光共聚焦顯微鏡下觀測樣本，能觀察到PC4在轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞中所起的作用。結(jié)果如圖6A、圖6B、圖6C所示，圖6A是對照組(未轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞)的熒光檢測結(jié)果，圖6B 是轉(zhuǎn)染了野生型PC4的HeLa細(xì)胞的熒光檢測結(jié)果，圖6C是轉(zhuǎn)染了 N-端絲氨酸區(qū)突變型卩〇4( 04-八3，其不能被磷酸化，所以應(yīng)該是完全活化的)的HeLa細(xì)胞的熒光檢測結(jié)果。三幅圖對比可以看出，PC4位于細(xì)胞核中且能夠?qū)е氯旧w凝集和細(xì)胞凋亡，尤其是從圖6C 可以判斷PC4的過量表達(dá)引發(fā)了凋亡，這一點(diǎn)與癌蛋白的作用是一致的。另外，發(fā)明人還采用蛋白印跡分析法測定了許多組織中的PC4水平。收集手術(shù)后切除的不同的組織(惡性腫瘤組織的記為“T”，正常組織記為“N”，由美國國立衛(wèi)生研究院提供)，并快速冷藏到-80°C環(huán)境中直至使用。組織裂解液的制備過程如下向組織溶液中加入裂解緩沖液(裂解緩沖液體積為總體積的1/10)后，用微型高速攪拌器將其分散均勻。 離心后收集溶液部分。檢測所收集的溶液部分裂解物的蛋白濃度，可以采用Bradfort蛋白檢測方法(BioRad蛋白檢測儀)。為測定PC4的表達(dá)水平，取50ug正常組織或惡性組織的組織裂解物進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，最后進(jìn)行蛋白印跡分析，即采用抗人PC4的多克隆抗體來檢測被轉(zhuǎn)到硝酸纖維膜上的蛋白。 結(jié)果如圖8B所示，該結(jié)果表明在很多人體腫瘤組織中，如肺癌組織、膀胱癌組織、結(jié)腸癌組織、乳腺癌組織、子宮內(nèi)膜癌組織、甲狀腺癌組織和小腸癌組織，都發(fā)現(xiàn)了 PC4，但是在相應(yīng)的正常人體組織中都沒有檢測到PC4。發(fā)明人還采用免疫組織化學(xué)分析檢測了正常肺組織和肺癌組織中PC4蛋白的表達(dá)水平。用美國國立衛(wèi)生研究院提供的正常肺組織或肺癌組織切片的載玻片樣本做免疫組織化學(xué)分析。免疫組織化學(xué)分析過程如下先用二甲苯處理組織切片的載玻片，2次，每次 15分鐘；然后將其置入濃度依次遞減的(從100% 70%)的乙醇中，每次孵育5分鐘；在 95°C下烘干5分鐘后，依次用水和PBS漂洗，然后用3%牛奶封閉液進(jìn)行封片；加一抗(即抗PC4的抗體)，室溫孵育1小時；洗去多余的一抗后，向切片加標(biāo)記有熒光的二抗，室溫孵育30分鐘；最后，漂洗載玻片，放置在熒光顯微鏡下能檢測到PC4蛋白。如圖9A和圖9B所示，正常肺組織中沒有檢測到PC4蛋白，而在肺癌組織的所有癌細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)PC4蛋白的凝集。發(fā)明人在所有經(jīng)檢測的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系(cos、HeLaJ93)和三個乳腺癌細(xì)胞系 ((MCF7、MD231、MDA468)中都檢測到了 PC4的mRNA，但是在原代NIH3T3細(xì)胞系和非惡性的大鼠組織(腦組織m-Brain，睪丸組織m-Testis)沒有檢測到PC4的mRNA。檢測方法(Northern印跡分析)如下從上述這些不同細(xì)胞系或組織中提取總RNA且通過1 %的甲醛-瓊脂糖凝膠進(jìn)行分離，凝膠上的RNA轉(zhuǎn)到硝酸纖維膜上后，再將標(biāo)記有32P的人 PC4DNA(h-PC4probe)和人p52DNA(h_p52probe)作為探針分別與所提取的總RNA雜交(將膜置于探針溶液環(huán)境中孵育一段時間)，用溴化乙錠(EtBr)染色法分別檢測出各樣品總 RNA中PC4mRNA和p52mRNA的表達(dá)水平，即觀測染色后的28S和18S核糖體RNA(參見文獻(xiàn) Ge等，EMBO J. (1998) 17:6723-6729)。檢測結(jié)果如圖7A、圖7B、圖7C所示。所述的p52是另一種在上述的各種細(xì)胞系和組織中都存在的轉(zhuǎn)錄輔激活因子。發(fā)明人還將PC4在腫瘤組織中的活化與DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I的活化進(jìn)一步聯(lián)系起來，如圖8A、圖8B所示。所述的DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I是一種將DNA進(jìn)行解旋的酶且為一些抗癌藥物如NB-506，J-I09，J-382，DB-67 的靶點(diǎn)(參見文獻(xiàn)Pilch，B.等，Cancer Res. (2001)61 6876-6884 ；Chen, Α. Y.等，Mol. Cancer Thera. (2005)4 :317-324)。許多癌基因和腫瘤抑制基因編碼的蛋白，例如C-myc、P53、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I，也是大家熟知的能作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的蛋白，發(fā)明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，PC4能夠提高這些蛋白的活性。以上事實(shí)能得出一個結(jié)論除了能起到轉(zhuǎn)錄輔激活因子的作用，人轉(zhuǎn)錄正輔因子 4(PC4)還能作為一種癌蛋白來激活細(xì)胞發(fā)育、分化、惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤侵襲生長。實(shí)際上，一些采用DNA陣列方法的其他研究中，也發(fā)現(xiàn)了癌癥病變過程中PC4在RNA水平的活化(Das， C.等，Mol. Cell. Biol. (2006)26 :8303-8315 ；Kleivi, K. Mol. Cancer (2007)6 :1-16) 基于發(fā)現(xiàn)了 PC4作為一種癌蛋白能在不同類型的人腫瘤的形成過程中起到重要作用，發(fā)明人以PC4為研究靶點(diǎn)發(fā)明了一系列診斷癌癥的方法，預(yù)防、治療癌癥的方法和藥物，以及篩選抗癌藥物的方法。本發(fā)明提供了診斷受試者癌癥或其他惡性腫瘤的方法，該方法包含以下內(nèi)容從受試者身上收集合適的組織樣或液體樣，檢測所收集的樣本中作為生物標(biāo)記的PC4的表達(dá)水平，若其中的PC4的表達(dá)水平比對照樣的高，說明樣本為癌組織或惡性組織。為進(jìn)一步的確診，該方法還可以包含有檢測其他相關(guān)生物標(biāo)記的水平的步驟，例如檢測DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I的表達(dá)水平。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種檢測受試者是否患有癌癥或體內(nèi)是否存在惡性腫瘤細(xì)胞的方法，該方法包含以下內(nèi)容從受試者身上收集合適的樣本，檢測樣本中作為生物標(biāo)記的DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I的表達(dá)水平，若其中的DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I的水平比對照樣的高，說明樣本為癌組織或惡性組織。上述的“受試者”包括人、其他可能會患癌癥的動物。本發(fā)明提供了一種通過降低細(xì)胞內(nèi)PC4水平或抑制PC4的功能來預(yù)防或治療癌癥的藥物，該藥物中包含了有效劑量的合適的PC4拮抗劑。相應(yīng)的，根據(jù)本發(fā)明的發(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明還提供了一種治療癌癥的方法，即給患有癌癥的受試者使用上述包含了有效劑量的合適的PC4拮抗劑的藥物。經(jīng)發(fā)明人研究表明， 這類藥物或者說相應(yīng)的治療方法可以被用來治療肺癌、膀胱癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、甲狀腺癌、小腸癌和其他惡性腫瘤(參見圖8B)。上述的包含有合適的PC4拮抗劑的藥物不僅可以由于治療，也可以用于預(yù)防目的，防止人腫瘤的發(fā)生。上述的治療癌癥的方法包括化療、放療、免疫療法以及綜合治療。
上述的預(yù)防或治療癌癥的藥物可以單獨(dú)使用、也可以聯(lián)合其他一種或多種抗癌藥物使用，共同達(dá)到預(yù)防或治療癌癥的有效劑量。上述的預(yù)防或治療癌癥的藥物中可以加入藥學(xué)上接受的載體?；诂F(xiàn)有的生物學(xué)理論和技術(shù)，本發(fā)明進(jìn)一步提供了一些合適的PC4拮抗劑已修飾的或無功能的PC4多肽或蛋白、抗PC4的抗體、合適的反義核苷酸分子、合適的小分子干擾RNA分子(siRNA)。已修飾的或無功能的PC4多肽或蛋白上述的PC4拮抗劑可以選擇已修飾的或無功能PC4多肽或蛋白。PC4是大家所熟知的一種多功能蛋白，已經(jīng)證明了其綁定DNA以及在綁定DNA的同時與其他蛋白發(fā)生相互作用的能力。目前大家已認(rèn)識到一種已修飾的或無功能的PC4突變體或其中的部分片段可能被野生型的或者未修飾的PC4所顯性抑制，或者可能以隱性狀態(tài)存在于細(xì)胞中?；蛘撸研揎椀幕驘o功能的突變體、類似物或其中的部分片段可能與野生型或未修飾的蛋白競爭， 從而有效地削弱野生型或未修飾的蛋白的功能。例如，由于磷酸化的PC4是失活的(尤其是N-端絲氨酸富集區(qū)被磷酸化修飾后的PC4失活)，它也能夠被用來與未磷酸化的PC4 (活性形式)競爭從而達(dá)到治療目的；另外，目前研究表明，其中包含有第77個位點(diǎn)的苯丙氨酸單個氨基酸突變(F77P)或者與該突變等效的突變的PC4蛋白或多肽失去了與DNA綁定的活性，因此根據(jù)本發(fā)明的發(fā)明構(gòu)思，可以推斷這種無功能PC4多肽或蛋白具有抗癌方面的藥學(xué)用途。有這種類似功能的模擬肽或模擬肽組合物可能會成為一種急需有待研發(fā)的癌癥治療藥劑，由于它們能夠防止動物的免疫系統(tǒng)或蛋白代謝機(jī)制遭到破壞。本發(fā)明還進(jìn)一步提供了一些突變型PC4蛋白作為PC4拮抗劑(治療依賴于PC4的腫瘤的藥物)。之前已經(jīng)報導(dǎo)過N-端絲氨酸富集區(qū)對于PC4蛋白的活性來說是必需的，且受到酪氨酸激酶II的磷酸化作用的調(diào)節(jié)，刪除N-端區(qū)導(dǎo)致PC4蛋白的輔激活作用完全喪失(Ge 等，1994a ； 1994b ；Kretzschmar等，1994)。發(fā)明人通過制造一系列的單個氨基酸突變，定位了一些對PC4蛋白的活性來說是必不可少的重要氨基酸。由此，發(fā)明人篩選出7種突變型 PC4 蛋白，如圖 2 所示，mt-1 (K23I/K29A)、mt-2 (K35I/K41A)、mt-3 (R27A/K28I/K29A)、 mt-4 (R47N/K35I/K41A)、mt_5 (F77P)、mt_6 (K29A)、mt_7 (K41A)。經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究證明，除了已知的第77個位點(diǎn)發(fā)生了單個氨基酸突變(F77P)的PC4喪失了結(jié)合DNA的能力和轉(zhuǎn)錄活性， 在N-端基本區(qū)發(fā)生雙重突變(K23I/K29A和K35I/K41A)和三重突變(R27A/K28I/I^9A)的 PC4蛋白的活性也大大降低了，因此PC4突變體F77P、K23I/I^9A、K35I/K41A、R27A/I^8I/ K29A能用作抗癌藥物，通過與內(nèi)源的野生型PC4競爭來達(dá)到治療依賴于PC4的惡性腫瘤的效果。本發(fā)明還提供了與PC4的激活結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列同源的短多肽作為PC4拮抗劑。PC4，作為一個通用的轉(zhuǎn)錄輔激活因子，它的活性表現(xiàn)為與其他通用轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄激活因子、DNA模板之間的相互作用，因此激活結(jié)構(gòu)域?qū)τ赑C4實(shí)現(xiàn)其功能是必須的。由此，發(fā)明人設(shè)計合成了兩個多肽，它們的序列分別與兩個PC4激活結(jié)構(gòu)域氨基酸序列一致， 這兩個多肽能與野生型PC4競爭結(jié)合其他激活子，從而達(dá)到抑制PC4活性的作用。這兩個多肽序列為PC4的氨基酸序列中第16-30個氨基酸(DSDSEVDKKLKRKKQ，見SEQ ID NO. 3)和第洸-40 個氨基酸(KRKKQVAPEKPVKKQ，見 SEQ ID NO. 1)序列。本發(fā)明還提供了能與PC4結(jié)合的模擬激活結(jié)構(gòu)域多肽作為PC4拮抗劑。由于PC4的致癌活性是通過其作為轉(zhuǎn)錄輔激活因子去激活全部或絕大多數(shù)的癌基因、生長因子或其他致癌因子的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的(PC4與所述癌基因、生長因子或其他致癌因子的特異性激活子相互作用來激活它們的表達(dá))，因此，抑制PC4蛋白去結(jié)合內(nèi)源激活子能使PC4蛋白失去其輔激活子活性。發(fā)明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)了一個有15個氨基酸的兩親性螺旋多肽(amphipathic helix peptide, AH peptide)能夠模擬一種激活結(jié)構(gòu)域與PC4發(fā)生強(qiáng)相互作用，從而封閉了 PC4的激活子結(jié)構(gòu)域，抑制PC4與內(nèi)源激活子作用，抑制了 PC4的功能，達(dá)到治療目的。該多肽的序列為ELQELQELQALLQQQ，見SEQ ID NO. 5。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，PC4拮抗劑還包括連接有遷移結(jié)構(gòu)域的多肽或蛋白類 PC4拮抗劑。為了促進(jìn)多肽或蛋白類PC4拮抗劑進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，使得其能夠靶向核內(nèi)癌蛋白 PC4，可以通過將遷移結(jié)構(gòu)域(translocation domain, TLD)與重組單克隆抗體、突變型PC4 蛋白、與PC4的激活結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列同源的多肽、能與PC4結(jié)合的模擬激活結(jié)構(gòu)域或其他能夠抑制PC4活性的蛋白或多肽等融合來實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明采用了一種包含有12個氨基酸的短多肽作為遷移結(jié)構(gòu)域，其序列為 PLSSIFSRIGDP，見SEQ ID N0. 7，分子量為1288. 47，等電點(diǎn)pi = 6. 27。據(jù)報道，這種多肽對于乙型肝炎病毒的感染和一些其他蛋白的細(xì)胞滲透性來說是必不可少的(Oess and Hildt 2000 ；Stoeckl et al.，2006)。抗體本發(fā)明提供了一些能夠抑制PC4蛋白或抑制PC4蛋白和DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I (這兩個蛋白以下也稱靶蛋白)的生物學(xué)活性的中和抗體。本發(fā)明的抗體為基于現(xiàn)有生物學(xué)技術(shù)能夠得到的抗PC4抗體，優(yōu)選單克隆抗PC4抗體，也可以選擇包含有所述單克隆抗PC4抗體的多克隆抗體。所述的單克隆抗PC4抗體包括了 PC4的亞型特異性抗體。根據(jù)本發(fā)明的發(fā)明構(gòu)思，上述的單克隆抗PC4抗體為能夠特異性結(jié)合靶蛋白的抗體，抗體中的抗原結(jié)合片段也稱抗原性片段，抗原性片段可以是Fab片段、F (ab) 2片段、 Fab'片段、F(ab' ) 2片段、Fd片段、Fd'片段或者Fv片段。一般的單克隆抗PC4抗體中包含了抗原性片段，當(dāng)然單克隆抗PC4抗體也可以選擇這些抗原性片段(即單價抗體)。最好選擇抗原表位，即當(dāng)抗體進(jìn)入體內(nèi)后被抗原識別的位點(diǎn)。單克隆抗PC4抗體首選小鼠單克隆抗體或其中的抗原性片段、抗原表位。除了單價抗體，結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)(參考文獻(xiàn) Holt 等，Trends in Biotechnology (2003)21 :484-490)也適用于本發(fā)明的抗 PC4 抗體。若為治療人，應(yīng)該采用人源化抗體，最好是人源化天然抗體。制造已知抗原的抗體的方法有很多種，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知技術(shù)(參見美
(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)出片反的《Antibodies :A Laboratory Μειηιιει 》， Harlow and Lane, 1988 ；^ 利第 01/25437 號)?？梢圆捎皿w內(nèi)免疫法，用源自靶蛋白上的具有免疫原性的組分來免疫人或其他動物宿主，再從動物宿主中提取抗體；可以通過免疫人或除人以外的動物來獲得上述的抗體， 優(yōu)選哺乳動物，例如大鼠、小鼠、豚鼠、兔子、山羊、綿羊、豬，或者鳥類(如雞)，進(jìn)一步優(yōu)選小鼠。也可以采用體外免疫的方式從免疫細(xì)胞中提取抗體。體外免疫法優(yōu)選采用重組表達(dá)技術(shù)生產(chǎn)抗體，例如用合適的編碼抗PC4抗體的DNA來轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、感染或轉(zhuǎn)導(dǎo)適合的細(xì)胞系，得到重組系統(tǒng)能表達(dá)生產(chǎn)抗PC4抗體；也可以采用本領(lǐng)域所熟知的雜交瘤技術(shù)來制備抗體；或采用生物重建的方式，直接將已純化的重鏈和輕鏈構(gòu)建成抗體；特別是，還可以選擇化學(xué)合成的方法獲得合適的抗體，或者采用細(xì)胞內(nèi)免疫的方法(例如胞內(nèi)抗體技術(shù)，在胞內(nèi)表達(dá)抗PC4抗體)。另外，本發(fā)明的抗體還包括了嵌合抗體和雜合抗體。一些文獻(xiàn)中描述了制備嵌合抗體和雜合抗體的技術(shù)(Morrison 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1984)81 :6851-6855 ； Neuberger 等，Nature, (1984) 312 :604-608 ；Takeda 等，Nature (1985)，314 :452-454)。進(jìn)一步的，單鏈抗體也適用于本發(fā)明(參見發(fā)明人為Huston的兩個美國專利 第 5，476，786 號和第 5，132，405 號；Huston 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1988) 85 5879-5883 ；發(fā)明人為 Ladner 等人的第 4，946，778 號美國專利；Bird, Science. (1988) 242 423-426 ；Ward等，Nature. (1989)334 :544-546)。所述的單鏈抗體是一種由單一肽鏈組成的小分子抗體，合成方法在抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)(Fv)基因之間，用一段短肽基因?qū)烧哌B接成^Fv基因，該基因的表達(dá)產(chǎn)物可折疊成具有抗原結(jié)合能力的單鏈多肽。抗體的給藥途徑可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的一些藥物輸送途徑，例如直接注射可能比較適合將抗體釋放到需治療的位點(diǎn)。也可以采用其膜內(nèi)包裹有抗體的脂質(zhì)體，將脂質(zhì)體定向輸送到靶點(diǎn)，從而使這里的目標(biāo)基因的表達(dá)或功能被抑制。除了單克隆抗 PC4抗體，所述的脂質(zhì)體中還可以包含一些其他藥劑，例如上述的一些能夠被釋放到治療靶點(diǎn)的藥劑(參見文獻(xiàn)，Wolff 等，Biochem. et Biophys. Acta, (1984)802:259)。反義核苷酸分子在本發(fā)明還提供了采用反義寡聚核苷酸分子來抑制PC4基因或者抑制PC4基因和 DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I基因(這兩個基因以下簡稱目標(biāo)基因)的表達(dá)的方法。本領(lǐng)域公知的，細(xì)胞中的反義RNA的表達(dá)，特別是組成性表達(dá)，能夠抑制基因的表達(dá)(可能是通過阻斷翻譯或防止剪接的方式來抑制基因的表達(dá))?；谶@一點(diǎn)，干擾剪接使得那些保守性較差而產(chǎn)生較強(qiáng)特異性的內(nèi)含子序列能發(fā)揮作用，從而能抑制一個物種中相應(yīng)基因產(chǎn)物的表達(dá)，但不抑制其他物種中的這種基因產(chǎn)物的同源物的表達(dá)。術(shù)語“反義組分”是指與一個特定的mRNA分子充分互補(bǔ)的RNA或DNA分子。反義 RNA分子是特異的，反義RNA與mRNA發(fā)生分子雜交會導(dǎo)致mRNA的翻譯受到抑制。所述的分子雜交能在體內(nèi)環(huán)境下發(fā)生。本發(fā)明的反義RNA分子必須具有足夠的與目標(biāo)基因互補(bǔ)的能力，長度大約15 30個核苷酸，這樣一來反義RNA分子能與目標(biāo)基因(或者mRNA)雜交來抑制目標(biāo)基因的表達(dá)，無論雜交是發(fā)生在剪接水平、轉(zhuǎn)錄水平還是翻譯水平。本發(fā)明的反義 RNA分子選擇能夠與目標(biāo)cDNA中的包括編碼區(qū)序列、3’或5’非編碼區(qū)序列或其他內(nèi)含子序列在內(nèi)的任意一個部分雜交的RNA分子，或者是能夠與目標(biāo)mRNA雜交的RNA分子。至于如何設(shè)計反義核酸分子，在已知mRNA序列的基礎(chǔ)上，根據(jù)已有技術(shù)，反義核酸分子序列可以很容易地設(shè)計出來。本發(fā)明的反義RNA分子，可以采用轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的方式，由載體運(yùn)送進(jìn)入宿主細(xì)胞，所述的載體類型包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和質(zhì)粒，連接編碼反義RNA的DNA與合適的包含有啟動子的調(diào)節(jié)序列，連接后一同置入所述的載體中，從而反義RNA能在宿主細(xì)胞中表達(dá)。在一個實(shí)施方案中，包含有編碼反義RNA分子的cDNA片段的載體實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和組成性表達(dá)，或者這種表達(dá)可能是在組織特異性或發(fā)育特異性的啟動子的控制下實(shí)現(xiàn)的。也可以使用脂質(zhì)體將反義RNA分子運(yùn)送進(jìn)入細(xì)胞。針對體內(nèi)治療，目前現(xiàn)有的首選方法是直接將反義RNA分子運(yùn)送到靶點(diǎn)，而不是通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染其上構(gòu)建了編碼反義RNA分子的cDNA片段的表達(dá)載體。本發(fā)明的反義寡聚核苷酸分子具有15到30個堿基的長度，其序列決定了該反義寡聚核苷酸分子是否能夠與目標(biāo)cDNA中的包括編碼序列、3’或5’非編碼區(qū)或其他內(nèi)含子序列在內(nèi)的任意一個部分雜交，或者優(yōu)選的，是否能與目標(biāo)mRNA雜交。與目標(biāo)基因雜交的反義寡聚核苷酸分子的序列最好選用那些具有最強(qiáng)的反義能力的序列。反義寡聚核苷酸序列分子上的反義能力由以下幾個因素來決定反義寡聚核苷酸的長度、綁定親和性、目標(biāo)序列的可及性。在體外篩選反義能力強(qiáng)的反義寡聚核苷酸分子，可以通過體外檢測其抑制目標(biāo)蛋白翻譯的能力和抑制與目標(biāo)基因相關(guān)的顯型的能力，例如，抑制培養(yǎng)基中細(xì)胞增殖的能力。一般來說，目標(biāo)cDNA的大多數(shù)區(qū)域(5’和3’非編碼區(qū)，AUG起始區(qū)，編碼區(qū)，剪接點(diǎn)和內(nèi)含子序列)都能夠利用反義寡聚核苷酸來定位。本發(fā)明的反義寡聚核苷酸分子優(yōu)選那些穩(wěn)定的、有強(qiáng)抗核酸酶能力的、具有合適的藥物動力學(xué)性能使其能以無毒劑量到達(dá)目標(biāo)組織、且有能力穿過質(zhì)膜的寡聚核苷酸分子。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，反義RNA分子的化學(xué)修飾主要集中在磷酸二酯骨架、堿基、糖環(huán)， 這些修飾可以提高反義RNA分子的穩(wěn)定性或與目標(biāo)cDNA或mRNA雜交的能力。本發(fā)明的反義寡聚核苷酸分子優(yōu)選磷硫酰化反義寡聚核苷酸分子(反義寡聚核苷酸分子的磷酸二酯鍵被磷硫?；揎椇蟮玫搅琢蝓；戳x寡聚核苷酸分子)。磷硫酰化反義寡聚核苷酸分子的基本結(jié)構(gòu)也可以被修飾使其反義能力得到進(jìn)一步優(yōu)化。另外，也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了 N3’ -P5’氨基磷酸酯鍵能夠使得寡聚核苷酸分子在核酸酶的存在下穩(wěn)定且能提高反義寡聚核苷酸分子與RNA之間的綁定結(jié)合力。肽核酸鍵(PNA)全部取代了核糖和磷酸二酯骨架使其能夠在核酸酶的存在下穩(wěn)定，不會被RNA H酶切，且提高了反義寡聚核苷酸分子與目標(biāo)基因或 mRNA之間的親和力。關(guān)于堿基的修飾，經(jīng)證明，堿基被一些雜環(huán)修飾后，能增強(qiáng)反義寡聚核苷酸分子的反義能力且使得反義寡聚核苷酸分子不會被RNA H降解，例如，C-5噻唑修飾。 最后，也可以考慮糖環(huán)的修飾，例如用2’-氧-丙烷基、2’甲氧乙氧基取代核糖使得寡聚核苷酸能在體外細(xì)胞培養(yǎng)基中或體內(nèi)的環(huán)境中保持對核酸酶的穩(wěn)定性。本發(fā)明的反義寡聚核酸分子的給藥途徑應(yīng)選擇一些能提供最佳反義效果(根據(jù)上述的標(biāo)準(zhǔn)來測定)的途徑。反義寡聚核酸分子的體內(nèi)和體外測試結(jié)果表明以陽離子脂質(zhì)體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體為載體來輸送反義寡聚核酸或者直接給藥的藥效較好。另一種可能的給藥模式是利用能與靶細(xì)胞表面特異性標(biāo)記結(jié)合的抗體來將反義寡聚核酸分子靶向輸送到目的細(xì)胞?？贵w與靶細(xì)胞結(jié)合或與其上受體的結(jié)合都能達(dá)到靶向輸送的目的。小分子干擾RNA在本發(fā)明還進(jìn)一步提供了能夠抑制目標(biāo)基因表達(dá)的小分子干擾RNA(small interfering RNAs,簡稱siRNA，也稱RNAi，也稱RNA干擾核酸)。小分子干擾RNA是一種雙鏈RNA分子，典型長度為21個核苷酸(nt)，若其與目標(biāo)基因同源，則可以干擾目標(biāo)基因的表達(dá)。RNAi技術(shù)與真核細(xì)胞中的序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)過程有關(guān)。一般來說，這個過程中涉及到特定序列的mRNA降解，該降解由與這段特定序列同源的雙鏈RNA(dsRNA) 所引發(fā)。例如，與特定的單鏈mRNA(SS mRNA)序列相對應(yīng)的長dsRNA的表達(dá)會使得遺傳信息的傳遞變得不穩(wěn)定，從而干擾了相應(yīng)基因的表達(dá)。引入與任意選定基因mRNA的全部或絕大部分序列相對應(yīng)的dsRNA都會抑制該基因的表達(dá)。據(jù)目前的研究看來，當(dāng)一段長dsRNA表達(dá)時，它首先被核糖核酸酶III酶切成長度僅為21 22個堿基對的短dsRNA。因此，siRNA 會因?yàn)檫@些與之同源的短dsRNA的引入或表達(dá)受到直接影響。哺乳細(xì)胞中至少有兩條途徑受到dsRNA的影響。在序列特異性途徑中，如上所述的，初始dsRNA先被酶切成多個小分子干擾 RNA(siRNA)。這些siRNA由長度約為21個核苷酸的正義鏈和反義鏈組成，每條鏈由19個起干擾作用的核苷酸和3’端的兩個游離核苷酸組成。小分子干擾RNA被認(rèn)為是能夠提供了一定的序列信息使得相應(yīng)特定序列的mRNA被靶向降解。相反，而非特異性途徑可以由任意序列的dsRNA引發(fā)，只要該dsRNA長度至少大于30個堿基對。非特異途徑的引發(fā)是由于dsRNA激活了兩個酶PKR酶和2' ,5'寡腺苷酸合成酶0' ,5' -AQ。PKR酶處于活性狀態(tài)時，可以通過磷酸化翻譯起始因子eIF2來關(guān)閉所有蛋白的合成；2'，5'寡腺苷酸合成酶能合成一種激活核糖核酸酶L(RNase L)的分子，而RNase L是一種能降解所有mRNA的非特異性酶。非特異性途徑通常代表宿主對外界壓力和病毒感染的反應(yīng)，一般來說，非特異性途徑的作用最好是被降到最低水平。很明顯，較長的dsRNA只能誘導(dǎo)非特異性途徑，因此，長度不足30個堿基對的dsRNA最好是通過RNA干擾(RNAi)即序列特異性途徑來影響基因的表達(dá)(參見Hunter等，J. Biol. Chem. (1975) 250 :409-417 ；Manche 等，Mol. Cell. Biol. (1992) 12 :5239-5248 ；Minks 等，J. Biol. Chem. (1979)254:10180-10183 ；Elbashir 等，Nature Q001) 411 :494-498)。經(jīng)證明，RNA干擾是一種降低基因表達(dá)水平的有效手段，且對大多數(shù)類型的細(xì)胞都適用，例如HeLa細(xì)胞，NIH/3T3細(xì)胞，COS細(xì)胞，293細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞。特別是與采用反義核酸相比，siRNA能將目的基因表達(dá)降到更低水平，并且事實(shí)上，siRNA經(jīng)常能使得目的基因完全不表達(dá)(參見Bass，Nature (2001) 411 =428-429) 0另外，對于降低哺乳細(xì)胞中目的基因表達(dá)水平，同等條件下，siRNA的有效劑量比反義RNA的有效劑量低幾個數(shù)量級 (Elbashir 等，Nature (2001) 411 :494-498)。RNA干擾優(yōu)選長度小于30個堿基對的雙鏈寡聚核苷酸，進(jìn)一步優(yōu)選長度為25、24、 23、22、21、20、19、18、17個堿基對的雙鏈RNA。長度為21個堿基對的siRNA效果較好。包含有游離的3’端siRNA效果較好。典型的游離3’端有兩個游離的核苷酸，這兩個核苷酸可以由任何類型的核糖核苷酸殘基組成，優(yōu)選2 ‘-脫氧核糖核苷酸，在細(xì)胞培養(yǎng)基中和轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，采用2'-脫氧核糖核苷酸組成的游離3’端不僅降低了 RNA合成成本，并可增強(qiáng) 7 siRNA抵抗核酸酶酶切的能力(參見Elbashi等，Nature 0001)411 :494-498)。較長dsRNA分子，例如具有50個、75個、100個甚至是500個或更多的堿基對的大分子dsRNA，也可以在本發(fā)明的特定的實(shí)施方案中得到應(yīng)用。為達(dá)到RNA干擾效果所采用的 dsRNA的標(biāo)準(zhǔn)濃度約為0. 05nm、0. lnm、0. 5nm、l. OnmU. 5nm、25nm或100nm，雖然也可以采用其他濃度，這取決于所處理的細(xì)胞類型、所針對的目標(biāo)基因以及其他相關(guān)因素。較長dsRNA分子的合成可以從啟動子轉(zhuǎn)錄合成長鏈dsRNA，所述的啟動子如本領(lǐng)域熟知的T7RNA聚合酶啟動子。抑制單個目標(biāo)基因的長dsRNA分子的合成從體外轉(zhuǎn)錄本的啟動子下游的目標(biāo)位點(diǎn)起，向兩個不同方向同時合成互補(bǔ)的RNA分子，并隨即組裝成相應(yīng)的dsRNA。在設(shè)計上述這些dsRNA分子時，必須考慮到每個RNA分子都應(yīng)該包含有一部分與目標(biāo)基因mRNA同源的核苷酸序列。siRNA的基本合成方法采用化學(xué)方法合成或者構(gòu)建合適的表達(dá)載體在體外或體內(nèi)合成?；瘜W(xué)方法合成的標(biāo)準(zhǔn)RNA由21個核糖核苷酸組成。合成的siRNA可以采用凝膠分離方法進(jìn)行純化。(Elbashir 等，Genes Dev (2001) 15 :188-200)。在設(shè)計siRNA序列時，可以選擇與目標(biāo)基因mRNA的編碼序列相鄰的任意一段核苷酸序列作為特異性序列，也就是說，設(shè)計本發(fā)明的siRNA時可以選擇與PC4mRNA上的編碼序列相鄰的任意一段核苷酸序列作為特異性序列。另外，如何從這些核苷酸序列中挑選最佳的特異性序列了？ 一般采用一些現(xiàn)有的序列設(shè)計軟件。首先利用這些軟件程序預(yù)測目標(biāo)基因mRNA的二級結(jié)構(gòu)，再來挑選那些很可能出現(xiàn)在折疊mRNA上的裸露單鏈區(qū)的序列。設(shè)計合適的siRNA的所采用的方法和材料，可以參考美國專利第6，251，588號文件中記載的相應(yīng)內(nèi)容。雖然mRNA通常被認(rèn)為是線性分子，其核苷酸序列中包含了直接指導(dǎo)蛋白合成的信息，但實(shí)際上，大部分的mRNA都顯示出包含有很多二級和三級立體結(jié)構(gòu)。RNA上的二級結(jié)構(gòu)單元是通過同一 RNA分子中的不同區(qū)域之間發(fā)生相互作用而形成，所述的相互作用主要是Watson-Crick類型的相互作用。重要的二級結(jié)構(gòu)單元包括雙鏈RNA (dsRNA)以及內(nèi)環(huán)區(qū)中由分子內(nèi)形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)、發(fā)夾結(jié)構(gòu)、以及突環(huán)結(jié)構(gòu)。當(dāng)二級結(jié)構(gòu)單元之間發(fā)生相互作用或二級結(jié)構(gòu)單元與單鏈區(qū)發(fā)生作用時所形成的更為復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)為三級結(jié)構(gòu)單元。很多研究者測定大量RNA雙鏈體結(jié)構(gòu)中的結(jié)合能量，因而得出了一系列能夠用來預(yù)測RNA 二級結(jié)構(gòu)的規(guī)則(例如參見 Jaeger 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86 :7706 ；Turner 等， Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. (1988) 17 :167)。這些規(guī)則能幫助識別 mRNA 結(jié)構(gòu)單元， 特別是對于識別裸露單鏈區(qū)域，這些mRNA上的裸露單鏈區(qū)域可能會成為siRNA、核酶或反義RNA所靶向的最佳靶片段。相應(yīng)的，識別PC4mRNA上的最佳靶片段能用來設(shè)計基于本發(fā)明構(gòu)思的具有RNA干擾效果的dsRNA寡聚核苷酸、合適的核酶和錘頭形核酶組合物。上述的具有RNA干擾效果的dsRNA寡聚核苷酸可以連同一個異源的靶基因一起通過載體試劑轉(zhuǎn)染的方式導(dǎo)入細(xì)胞，所述的載體試劑如本領(lǐng)域熟知的脂質(zhì)體一例如Life Technologies公司生產(chǎn)的針對貼壁細(xì)胞系的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000。靶向內(nèi)源基因的dsRNA寡聚核苷酸的轉(zhuǎn)染載體可以選用Life Technologies公司生產(chǎn)的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Oligofectamine。轉(zhuǎn)染效率還可以通過如下方式檢測將dsRNA寡聚核苷酸和hGFP-encoding pAD3在哺乳細(xì)胞系共轉(zhuǎn)染表達(dá)后，利用熒光顯微鏡技術(shù)檢測其轉(zhuǎn)染效率 (參見 Kehlenback 等，J. Cell. Biol. (1998) 141 :863-874)。dsRNA 導(dǎo)入細(xì)胞后，其 RNA 干擾效率可以采用很多方法來檢測。這些方法包括蛋白印跡分析(Western blot analysis)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和Northern雜交分析(Northern blot analysis)，所述的蛋白印跡分析是指等待內(nèi)源基因庫完成一次周轉(zhuǎn)代謝，新一輪蛋白合成被抑制后，采用抗體來識別目標(biāo)基因產(chǎn)物(PC4)的方法；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)和Northern雜交分析可以測定目標(biāo)基因mRNA (PC4mRNA)的水平。關(guān)于RNAi技術(shù)所采用的試劑、方法和應(yīng)用在美國專利第6278039、5723750和 5244805號中有進(jìn)一步介紹，列在此處可作參考。本發(fā)明的另一個目的是提供抗癌藥物的篩選方法，該方法是基于PC4是一種癌蛋白且可以作為抗癌藥物靶點(diǎn)這一科學(xué)發(fā)現(xiàn)?；趩幼拥暮Y選方法本發(fā)明的篩選抗癌藥物的方法，該方法包含以下兩個依次發(fā)生的步驟(1)提供一種基因構(gòu)建體，其包含PC4基因的啟動子序列以及與該啟動子序列有效連接的報告基因；( 將候選藥物和所述的基因構(gòu)建體混合置于適合所述的報告基因表達(dá)的環(huán)境中，其中，抑制報告基因表達(dá)的候選藥物為抗癌藥物。PC4基因啟動子序列，參見圖1A。與該啟動子序列有效連接的合適報告基因，可以選擇如熒光素酶基因或綠色熒光蛋白基因。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該能認(rèn)識到，除了本申請文件中所提供的示范序列以外，還有許多合適的PC4基因啟動子序列或一些PC4基因的其他順式作用轉(zhuǎn)錄因子也能應(yīng)用到基于本發(fā)明構(gòu)思的抗癌藥物篩選方法。除了上述的基于啟動子的篩選方法，本發(fā)明的抗癌藥物篩選方法還可以采用基于蛋白活性的檢測方法。依賴于PC4蛋白的轉(zhuǎn)錄活性檢測方法本發(fā)明還提供了一種篩選抗癌藥物的方法，該方法包含以下兩個依次發(fā)生的步驟(1)提供一種檢測PC4蛋白的轉(zhuǎn)錄水平的試驗(yàn)；( 向上述的試驗(yàn)中加入候選藥物，其中，降低PC4轉(zhuǎn)錄水平的候選藥物為一種抗癌藥物(參見Ge和Roeder，Cell (1994) 78 513-523)。基于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)-DNA相互作用的檢測方法本發(fā)明還提供了另一種篩選抗癌藥物的方法，該方法包含以下兩個依次發(fā)生的步驟(1)提供檢測PC4與蛋白之間相互作用或PC4與DNA之間相互作用的試驗(yàn)；(2)向上述的試驗(yàn)中加入候選藥物，其中，降低PC4與蛋白之間相互作用或PC4與DNA之間相互作用的候選化合物為抗癌藥物(參見Ge，Nucleic Acids Res. (2000) 28，e3)。優(yōu)選高通量系統(tǒng)(HTQ篩選抑制PC4蛋白活性的化合物。在高通量篩選檢測中，通常應(yīng)用熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(fluorescence resonance energy transfer,FRET)來對分子動力學(xué)(例如蛋白-蛋白相互作用、蛋白-DNA 相互作用、蛋白構(gòu)象轉(zhuǎn)化等)進(jìn)行定量?；跓晒夤舱衲芰哭D(zhuǎn)移技術(shù)的高通量篩選檢測系統(tǒng)一般采用96孔板或384孔板標(biāo)準(zhǔn)。篩選本發(fā)明的抑制PC4蛋白活性的化合物用標(biāo)記有熒光的兩親性螺旋(AH)結(jié)構(gòu)域多肽作為能量供體，標(biāo)記熒光的PC4蛋白作為能量受體。一旦PC4和兩親性螺旋結(jié)構(gòu)域多肽形成復(fù)合體，即由于兩個分子之間的相互作用力使得供體和受體之間距離很近(距離約1 lOnm)，此時觀測到的主要是PC4的發(fā)射光，因?yàn)榉肿娱g的熒光共振能量從兩親性螺旋結(jié)構(gòu)域多肽轉(zhuǎn)移到PC4蛋白。兩親性螺旋結(jié)構(gòu)域多肽的激發(fā)光和PC4的發(fā)射光受到熒光密度讀板儀的監(jiān)測。任何化合物的抑制PC4蛋白活性的作用都能通過監(jiān)測所讀取的熒光密度的變化來測定。一般篩選兩類化合物1)小分子合成物；幻天然化合物。當(dāng)然，這些化合物還需得到進(jìn)一步證實(shí)，證明其能夠成為一種有潛力的治療依賴于PC4的惡性腫瘤的候選抗癌藥。本發(fā)明的診斷癌癥或篩選抗癌藥物的方法是基于蛋白質(zhì)或基于核酸的檢測方法， 這些方法都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)方法?？筆C4抗體和抗拓?fù)洚悩?gòu)酶I抗體都是一些熟知的且能在市場上買到的抗體。例如，與納米金粒子共價交聯(lián)的抗體，可以從 Bioassayfforks公司買到(Ijamsville，Maryland)，這種抗體能夠用來快速地定量地監(jiān)測 PC4蛋白的水平或拓?fù)洚悩?gòu)酶I的水平。同樣的，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)能夠在RNA 水平監(jiān)測PC4和拓?fù)洚悩?gòu)酶I的活化水平。綜上所述，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了 PC4與癌癥相關(guān)，開拓了抗癌研究新領(lǐng)域，且由此發(fā)明了一系列的癌癥診斷方法與試劑(基于檢測PC4的表達(dá)水平)，以及治療和預(yù)防癌癥的方法與藥物(基于抑制PC4的功能與表達(dá))、篩選抗癌藥物的方法等。


圖1A、圖1B、圖IC提供了人PC4基因的序列信息；其中，圖IA提供了人PCkDNA 序列以及啟動子區(qū)域，啟動子區(qū)域標(biāo)注了下劃線(參見GenBank序列號NM_006713)；圖IB 提供了人PC4編碼區(qū)的DNA序列；圖IC提供了人PC4蛋白(127個氨基酸)的氨基酸序列， 第77個氨基酸(F 苯丙氨酸，被標(biāo)注了下劃線)位點(diǎn)若發(fā)生單個氨基酸突變，會使得PC4喪失與單鏈DNA結(jié)合的能力；圖2示出了 PC4N-端區(qū)突變分析圖譜，所述N-端區(qū)包含基本區(qū)和第77個氨基酸； 其中，WT表示野生型，mt表示突變型，mt-1 7分別代表了本發(fā)明的7個不同的突變型PC4 蛋白；圖3A、圖3B、圖3C示出了 PC4突變體(mt_l 7)的功能分析圖譜；其中，圖3A示出了各種純化的重組PC4蛋白的檢測標(biāo)準(zhǔn)化；圖:3B示出了圖3A所檢測的各種蛋白的電泳遷移率變動分析(EMSA)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，即檢測各蛋白與dsRNA的結(jié)合活性)，圖中的PC4+DNA是指PC4與dsDNA的復(fù)合體；圖3C示出了圖3A所檢測的各種蛋白的體外轉(zhuǎn)錄檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果， 其中pG5HM是依賴于PC4的轉(zhuǎn)錄模板，pML Δ 53是不依賴于PC4的轉(zhuǎn)錄模板；圖4Α、圖4Β、圖4C、圖4D、圖4Ε、圖4F示出了野生型PC4蛋白和各種突變型PC4蛋白的蛋白陣列分析結(jié)果；其中圖譜左側(cè)的5和40代表了兩個不同的蛋白濃度(單位pmol)， 圖4C示出了各蛋白與轉(zhuǎn)錄因子TFIIA(p55)之間的相互作用結(jié)果；圖4E示出了各蛋白與轉(zhuǎn)錄因子Spl之間的相互作用結(jié)果；圖4F示出了各蛋白與ssDNA之間的相互作用結(jié)果；圖4A 示出了麗春紅(Ponceau S)染色結(jié)果，該實(shí)驗(yàn)是檢測各蛋白是否已成功轉(zhuǎn)到硝酸纖維膜上； 圖4B示出了抗-PC4抗體(anti-PC4)與各蛋白之間的相互作用結(jié)果，該實(shí)驗(yàn)是為了檢測轉(zhuǎn)到膜上的各蛋白的量是否一致；圖4D是空白對照結(jié)果，檢測各蛋白與(^14(1-94)之間是否有非特異性結(jié)合；圖5A、圖5B、圖5C的結(jié)果說明了 PC4的表達(dá)水平與非洲爪蟾變態(tài)發(fā)育的關(guān)系； 每列凝膠條帶代表不同的變態(tài)發(fā)育階段；其中，圖5A和圖5B分別示出了 2 58和56 64各階段的PC4的表達(dá)水平，圖5A中“0”代表了卵母細(xì)胞(oocytes)，“E”代表了胚胎 (embryos)，PC4-P表示磷酸化的PC4蛋白(失活的)；圖5C示出了 PC4活化與非洲爪蟾分化發(fā)育的關(guān)系，其中示出了甲狀腺激素(T3和T4)的表達(dá)水平曲線和甲狀腺激素受體 (TRaand TR β)的表達(dá)水平曲線與PC4表達(dá)水平曲線作為對照；
圖6A是對照組(未轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞)熒光檢測結(jié)果；圖6B是轉(zhuǎn)染了野生型PC4 的HeLa細(xì)胞的熒光檢測結(jié)果，圖6C是轉(zhuǎn)染了絲氨酸區(qū)突變型PC4 (PC4- Δ S)的熒光檢測結(jié)果，闡明了當(dāng)PC4被轉(zhuǎn)染到Hela細(xì)胞中時，PC4位于細(xì)胞核中且能導(dǎo)致染色體凝集和細(xì)胞死亡。圖7示出了 PC4mRNA的檢測結(jié)果；所選擇的檢測樣品如下轉(zhuǎn)化細(xì)胞系(cos，HeLa and 293)、三個乳腺癌細(xì)胞系((MCF7，MD231and MDA468)、原代細(xì)胞系(NIH3T3)、大鼠正常組織(腦m-brain和睪丸組織m-Testis)；圖7A表示各樣品中總RNA的豐度測量結(jié)果；圖 7B示出了 p52mRNA的表達(dá)水平(即p52的表達(dá)譜)作為對照；圖7C示出了 PC4mRNA的表達(dá)水平；圖8A和圖8B分別示出了各種腫瘤組織以及相應(yīng)的正常組織中DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I和PC4的蛋白印跡分析結(jié)果，其中，Kidn (腎組織)、Lung(肺組織)、Bladd(膀胱組織)、Colon (結(jié)腸組織)、Prost (前列腺組織)、Breast (乳腺組織)、Pancrs (胰腺組織)、 Endomt (子宮內(nèi)膜組織)、Thyro (甲狀腺組織)、S-Bow (小腸組織)，N表示正常組織，T表示惡性組織(腫瘤)，PC4a表示具有活性的野生型，PC4b表示具有活性的亞野生型；圖9A和圖9B分別示出了檢測人體正常肺組織和肺癌組織中PC4表達(dá)水平的免疫組織化學(xué)分析結(jié)果；圖10示出了 PC4的多種功能；所有的這些功能尤其是標(biāo)注下劃線的與癌癥相關(guān)或者與癌癥的發(fā)病機(jī)理相關(guān)，因此PC4可能會成為很多抗癌藥物的治療靶點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例和附圖來進(jìn)一步闡述本發(fā)明。實(shí)施例1突變型PC4蛋白發(fā)明人通過制造一系列的單個氨基酸突變，定位了一些對PC4蛋白的活性來說是必不可少的重要氨基酸。由此，發(fā)明人篩選出可以作為PC4拮抗劑的7種突變型PC4 蛋白，如圖 2 所示圖譜，mt-1 (K23I/K29A)、mt_2 (K35I/K41A)、mt_3 (R27A/K28I/K29A)、 mt-4 (R47N/K35I/K41A)、mt_5(F77P)、mt_6(K29A)、mt_7 (K41A)。發(fā)明人還將上述7種突變型PC4蛋白進(jìn)行了重組構(gòu)建、表達(dá)、純化、鑒定，具體如下。突變體的重組構(gòu)建方法將細(xì)菌表達(dá)載體中的PC4野生型區(qū)置換成包含有特定點(diǎn)突變的雙鏈寡聚核苷酸從而產(chǎn)生各種不同的突變構(gòu)建體(包含有特定點(diǎn)突變的雙鏈寡聚核苷酸可以商業(yè)合成得到)。每個突變構(gòu)建體都要進(jìn)行測序分析且在E coli中表達(dá)后才能被確認(rèn)。在Ecoli 中的表達(dá)PC4蛋白(包括野生型和突變型)可以通過如下的2步純化法得到第一步P11 磷酸纖維素離子交換層析；第二步肝素親和層析。純化后蛋白的濃度可以通過Bradford 方法測定，純度可以通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測定。純化后的PC4蛋白(WT， mt-1 7)上SDS-PAGE，電泳結(jié)果如圖3A所示。采用以下方法檢測純化后PC4蛋白的活性1)電泳遷移率變動分析實(shí)驗(yàn)(結(jié)果見圖:3B) ；2)體外轉(zhuǎn)錄檢測實(shí)驗(yàn)(結(jié)果見圖3C) ；3)蛋白陣列分析(結(jié)果見圖4)，這三種方法具體操作如下1)采用電泳遷移率變動分析法(Electrophoresis mobility shift assay,EMSA) 檢測PC4蛋白綁定dsDNA的能力EMSA的操作如下配置20ul反應(yīng)體系(其中包含有IOng已純化的各種PC4蛋白樣品)和標(biāo)記有32P的長度為64bp的dsDNA探針(來源于腺病毒主要晚期啟動子區(qū))，將兩者混合后所得的反應(yīng)混合物置于4°C溫育1小時后，上8%聚丙烯酰胺凝膠電泳，通過放射自顯影可以檢測到移動的PC4-dsDNA復(fù)合體。如圖:3B所示，mt-l、mt-2、mt-3、mt-5都喪失了與dsDNA綁定的能力。2)體外轉(zhuǎn)錄檢測實(shí)驗(yàn)利用從HeLa細(xì)胞或從一個重組體系中純化的通用轉(zhuǎn)錄因子，如TFIIA，TFIIB， TFIID，TFIIF，TFIIH，RNA聚合酶II等來在體外重建轉(zhuǎn)錄檢測實(shí)驗(yàn)。這個體外轉(zhuǎn)錄體系的激活依賴于PC4和其他激活子(參見Ge等，1996)。除了上述的這些通用轉(zhuǎn)錄因子，該轉(zhuǎn)錄體系還包含一個響應(yīng)激活子的模板(PG5HM是依賴于PC4的轉(zhuǎn)錄模板)、一個不依賴于激活子的基本模板(PML Δ 53是不依賴于PC4的轉(zhuǎn)錄模板)和32P_CTP。該轉(zhuǎn)錄體系中30°C溫育 1小時后，萃取新合成的RNAs，將其進(jìn)行SDS-PAGE分析，再放射自顯影。結(jié)果如圖3C所示， mt-1、mt-2、mt-3、mt-5基本喪失了 PC4蛋白作為轉(zhuǎn)錄輔激活子的功能。3)蛋白陣列分析實(shí)驗(yàn)蛋白陣列分析實(shí)驗(yàn)是基于“通用蛋白陣列”(也稱UPA)的方法(參見文獻(xiàn)Ge 2000)。將大量已純化的蛋白在按一定排列規(guī)律固定在硝酸纖維膜上，形成密集的點(diǎn)陣列， 每點(diǎn)直徑約1mm，包含有10 IOOng的蛋白(取決于蛋白的大小)。與點(diǎn)陣列上的PC4蛋白發(fā)生相互作用的靶蛋白能夠利用特異抗體(例如抗轉(zhuǎn)錄因子TFIIA、Gal4、Spl的抗體) 檢測出來，結(jié)果圖4C、圖4D、圖4E。若檢測蛋白與DNA的相互作用，利用放射自顯影技術(shù)監(jiān)測標(biāo)記有32P-ClCTP的探針 DNA和已被綁定的DNA。結(jié)果如圖4F所示。由圖4可以看出，第77位點(diǎn)的苯丙氨酸對于PC4結(jié)合SSDNA來說是必不可少的。 另外，F(xiàn)77P突變型PC4與轉(zhuǎn)錄因子TFIIA和Spl的相互作用顯著增強(qiáng)。綜上所述，除了第77個位點(diǎn)發(fā)生了單個氨基酸突變(F77P)的PC4喪失了結(jié)合DNA 的能力和轉(zhuǎn)錄活性，上述結(jié)果證明在N-端基本區(qū)發(fā)生雙重突變(K23I/K29A和K35I/K41A) 和三重突變(R27A/K28I/I^9A)的PC4蛋白的活性也大大降低了，因此PC4突變體F77P、 K231/K29A,K351/K41A,R27A/K281/K29A能用作抗癌藥物，通過與內(nèi)源的野生型PC4競爭來達(dá)到治療依賴于PC4的癌癥的效果。實(shí)施例2與PC4的激活結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列同源的短多肽發(fā)明人設(shè)計合成了兩種多肽，它們的序列分別與兩個PC4激活結(jié)構(gòu)域氨基酸序列一致，經(jīng)發(fā)明人通過上述的蛋白陣列分析(蛋白-蛋白之間相互作用檢測實(shí)驗(yàn))和體外轉(zhuǎn)錄檢測實(shí)驗(yàn)證明了這兩種多肽能與野生型PC4競爭結(jié)合其他激活子，從而達(dá)到抑制PC4活性的作用。PC4-AD15，序歹Ij KRKKQVAPEKPVKKQ，見 SEQ ID No. 1 ；以及相應(yīng)的連接有遷移結(jié)構(gòu)域的短多肽，如TLD-AD15，序列PLSSIFSRIGDPKRKKQVAPEKPVKKQ,見 SEQ ID No. 2 ；PC4-S15，序歹Ij DSDSEVDKKLKRKKQ,見 SEQ ID No. 3 ；以及相應(yīng)的連接有遷移結(jié)構(gòu)域的短多肽，如TLD-S15，序列 PLSSIFSRI⑶PDSDSEVDKKLKRKKQ,見 SEQ ID No. 4。實(shí)施例3與PC4結(jié)合的模擬激活結(jié)構(gòu)域多肽兩親性螺旋多肽(序列為ELQELQELQALLQQQ，見SEQ ID No.幻能夠模擬一種激活結(jié)構(gòu)域與PC4發(fā)生強(qiáng)相互作用，封閉了 PC4的激活結(jié)構(gòu)域，抑制PC4與內(nèi)源激活子相互作用，從而抑制PC4活性；以及相應(yīng)的連接有遷移結(jié)構(gòu)域的短多肽，如TLD-AH15，序列 PLSSIFSRIGDPELQELQELQALLQQQ,見 SEQ ID No. 6。實(shí)施例4利用基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)的高通量篩選檢測系統(tǒng)篩選抑制PC4蛋白活性的化合物。篩選本發(fā)明的抑制PC4蛋白活性的化合物用標(biāo)記有熒光的兩親性螺旋(AH)結(jié)構(gòu)域多肽作為能量供體，標(biāo)記熒光的PC4蛋白作為能量受體。一旦PC4和兩親性螺旋結(jié)構(gòu)域多肽形成復(fù)合體，即由于兩個分子之間的相互作用力使得供體和受體之間距離很近(距離約1 lOnm)，此時觀測到的主要是PC4的發(fā)射光，因?yàn)榉肿娱g的熒光共振能量從兩親性螺旋結(jié)構(gòu)域多肽轉(zhuǎn)移到PC4蛋白。兩親性螺旋結(jié)構(gòu)域多肽的激發(fā)光和PC4的發(fā)射光受到熒光密度讀板儀的監(jiān)測。任何化合物的抑制PC4蛋白活性的作用都能通過監(jiān)測所讀取的熒光密度的變化來測定。一般篩選兩類化合物1)小分子合成物；幻天然化合物。當(dāng)然，這些化合物還需得到進(jìn)一步證實(shí)，證明其能夠成為一種有潛力的治療依賴于PC4的惡性腫瘤的候選抗癌藥。小分子合成物包括商業(yè)上可合成得到的和一些科研機(jī)構(gòu)內(nèi)部研發(fā)出來的。將入選的化合物保存在96孔板或384孔板中，并建立一個它們的詳細(xì)數(shù)據(jù)庫。反應(yīng)板上的每個孔都有10 50ul包含濃度為ImM的待檢測化合物(384孔板用IOul，96孔板用50ul)反應(yīng)混合物，且反應(yīng)混合物中還包含了標(biāo)記有熒光的PC4蛋白和兩親性螺旋結(jié)構(gòu)域多肽。每個板上都有4個陽性對照孔(用濃度為IOmM未標(biāo)記的兩親性螺旋結(jié)構(gòu)域多肽替代標(biāo)記了熒光的)和4個陰性對照(用水來替代熒光標(biāo)記的作為能量供體的兩親性螺旋結(jié)構(gòu)域多肽)。 用熒光密度讀板儀(Molecular Dynamics公司生產(chǎn)的)讀取0D535的光密度值。篩選出來的陽性分子的抗癌效果需采用不同的檢測方法來進(jìn)一步證實(shí)，所述的不同的檢測方法包括體外蛋白-蛋白相互作用檢測、轉(zhuǎn)錄檢測以及臨床試驗(yàn)前采用細(xì)胞模型和動物模型進(jìn)行的藥效檢測。大部分的處方藥都是天然化合物，市面上可以買到的50%以上的抗癌藥和抗感染藥都源于天然產(chǎn)物。為鑒定天然化合物能否抑制PC4蛋白的活性，可以選取一些來源于土壤微生物、 海洋微生物、植物或其他自然界物質(zhì)的化合物，利用基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)的高通量系統(tǒng)對它們篩選檢測。篩選出來的原材料可以再進(jìn)一步純化、鑒定、且在一些上述的不同的檢測系統(tǒng)中再進(jìn)一步確認(rèn)。上述的發(fā)明內(nèi)容和實(shí)施例只為闡明本發(fā)明的發(fā)明構(gòu)思和要點(diǎn)，不能以此來限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例以及結(jié)合本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)所作的等效變化或修飾，這些都是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。再者，這里所有引用的教材或其他文獻(xiàn)出版物等都已在文中相應(yīng)位置標(biāo)注。參考文獻(xiàn)1. 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權(quán)利要求
1.一種治療或預(yù)防癌癥的藥物，所述的藥物包含了有效劑量的PC4拮抗劑，其特征在于所述的PC4拮抗劑為單克隆抗PC4抗體或含有所述單克隆抗PC4抗體的多克隆抗體，所述單克隆抗PC4抗體為小鼠單克隆抗PC4抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療或預(yù)防癌癥的藥物，其特征在于所述的單克隆抗PC4 抗體為抗原性片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的治療或預(yù)防癌癥的藥物，其特征在于所述抗原性片段為 Fab片段、F (ab) 2片段、Fab’片段、F (ab’)2片段、Fd片段、Fd’片段或者Fv片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的治療或預(yù)防癌癥的藥物，其特征在于所述的抗原性片段為抗原表位。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療或預(yù)防癌癥的藥物。該藥物包含了有效劑量的人轉(zhuǎn)錄正輔因子4(PC4)拮抗劑，特別是，所述的PC4拮抗劑為抗PC4的抗體，所述抗PC4的抗體為小鼠單克隆抗PC4抗體。該藥物通過抑制PC4的表達(dá)水平或功能來達(dá)到治療或預(yù)防癌癥的目的。
文檔編號A61P35/00GK102274509SQ20111022976
公開日2011年12月14日 申請日期2008年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月7日
發(fā)明者葛輝 申請人:蘇州愛生基因有限公司