專利名稱：針對sars冠狀病毒基因的反義核酸序列及其藥物用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種針對SARS冠狀病毒基因的反義核酸序列及含有該反義核酸序列的藥物及其用途。
背景技術(shù)：
嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥(以下簡稱SARS)，又稱非典型性肺炎，是由一種新的冠狀病毒引起的一種傳染病，最先爆發(fā)于中國廣東，隨后向周邊國家和地區(qū)蔓延，截止到2003年5月17日，已經(jīng)擴(kuò)散到32個(gè)國家和地區(qū)，共報(bào)道了超出7000例的SARS病例。其發(fā)病特征為高燒、全身不適、頭疼、干咳、呼吸困難、血氧過少、肺部出現(xiàn)空洞，能夠發(fā)現(xiàn)全身性間隙浸潤液，嚴(yán)重的需要采用插管法或呼吸機(jī)幫助病人進(jìn)行呼吸，死亡率高達(dá)15％左右(Kanchan Anand，JohnZiebuhr，Parvesh Wadhwani and et al.，Science，2003，Science 3001763-1767；)。SARS臨床診斷表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞減少、白細(xì)胞減少、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和乳酸脫氫酶水平升高。
世界衛(wèi)生組織負(fù)責(zé)傳染病的執(zhí)行干事戴維·海曼于2003年4月16日宣布，經(jīng)過全球科研人員的通力合作，正式確認(rèn)冠狀病毒的一個(gè)變種是引起非典型肺炎的病原體，科學(xué)家將其命名為“SARS病毒”。SARS冠狀病毒是一種正義、單鏈RNA病毒，是RNA病毒中基因組最大的病毒，它本身沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu)，不能自主復(fù)制，但一旦進(jìn)入人體細(xì)胞，就能利用細(xì)胞中的各種資源在宿主細(xì)胞中不斷進(jìn)行復(fù)制(QIN E’de，ZHU Qingyu，YU Man and et al.，A complete sequenceand comparative analysis of a SARS-associated virus(Isolate BT01)，Chinese Science Bulletin，2003，48(10)941-948；Marco A.Marra，StevenJ.M.Jones，Carol ine R.Astell and et al.，The Genome Sequence of theSARS-Associated Coronavirus，2003，Science 3001399-1404；ChristianDrosten，Stephan Gunther，Wolfgang Preiser and et al.，Identificationof a novel coronaviral in patients with severe acute respiratory syndrome，the New England Journal of Medicine，April 10，2003)。SARS冠狀病毒主要通過呼吸道傳播，由于病毒的寄生特性，很難找到合適的藥物，因?yàn)樗幬镌跉⑺啦《镜耐瑫r(shí)，往往也會(huì)誤傷健康細(xì)胞(Paul A.Rota，M.Steven Oberste，Stephan S.Monroe and et al.，Characterization of a Novel CoronavirusAssociated with Severe Acute Respiratory Syndrome，2003，Science 3001394-1399；)。
反義核酸是在原核細(xì)胞和真核細(xì)胞內(nèi)天然存在的一種基因表達(dá)的抑制物(Mizuno，T.Chou，M-Y.and Inouye M.，1984，PNAS，81，1966-1970；HeywoodS.M.，1986，Nucleic Acids Research，14，6771-6772)，這些核酸片段的功能是結(jié)合到互補(bǔ)的mRNA序列上，阻止mRNA翻譯蛋白質(zhì)分子的過程(PatersonB.M.，Roberts B.E.and Kuff E.L.，1977，PNAS，74，4370-4374)。反義寡聚核苷酸是一小段人工合成的核苷酸片段，它的堿基順序與人們選擇作為阻斷目標(biāo)基因的某一段，依照堿基配對法則可以與存在于細(xì)胞質(zhì)中的特定基因的mRNA結(jié)合，阻斷其復(fù)制或翻譯成蛋白質(zhì)分子。
在細(xì)胞內(nèi)部，一個(gè)拷貝的基因會(huì)產(chǎn)生200-300條mRNA，翻譯出10萬個(gè)具有生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)分子。傳統(tǒng)藥物一般是作用于具有生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)分子空間構(gòu)型上的一兩個(gè)位點(diǎn)，由于蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，藥物可作用的靶位點(diǎn)又很少，因而特異性不會(huì)非常高。而反義核酸是通過堿基配對的原理來識別所作用的靶基因，從理論上說，一條長度為17個(gè)堿基的反義核酸分子，其堿基排列順序在人體全部基因中是唯一的。所以，長度超過17個(gè)堿基的反義核酸分子在人體全部基因中的結(jié)合位點(diǎn)即是唯一的，這就使反義核酸具有高度的特異性。毒理學(xué)研究也證明，反義核酸在體內(nèi)具有很低的毒性。所以與傳統(tǒng)藥物相比，反義核酸藥物具有高選擇性、高效性以及低副作用等優(yōu)點(diǎn)，特別是在抑制腫瘤生長和抗病毒繁殖等方面，已經(jīng)有一個(gè)藥物進(jìn)入美國和歐洲市場(1998年)，還有30多個(gè)反義核酸藥物在完成臨床前期的研究和開發(fā)后分別進(jìn)入了臨床I、II、III期實(shí)驗(yàn)(Stein C.A.and et al.，1994，Curr.Opin.Onco.，6，587-594；Crook S.T.，1995，Hematologic Pathology，9(2)，59-72，NewsRelease，ISIS pharmaceutical Co.2000.)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一些反義核酸序列，該序列為一段人工合成的核苷酸序列，它與導(dǎo)致SARS的冠狀病毒基因的特定位點(diǎn)的序列是互補(bǔ)的。因此，給有效劑量藥后，該藥物與冠狀病毒基因的特定位點(diǎn)相結(jié)合，從而抑制該病毒在人體內(nèi)的復(fù)制，以達(dá)到有效治療SARS的目的。
本發(fā)明的目的之二是提供一些治療SARS的反義核酸藥物，該藥物是由上面提到的反義核酸序列及可藥用載體或賦形劑組成的。
本發(fā)明的目的之三是提供上述的反義核酸序列用于制備抗嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥(SARS)藥物的用途。
本發(fā)明的目的之四是提供該反義核酸序列在制備治療其它由于要SARS冠狀病毒引起的疾病的藥物方面的用途。
以嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥(SARS)病毒基因的全部序列為攻擊位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了一系列反義核酸序列，其特征在于可特異性地與導(dǎo)致SARS的冠狀病毒基因的不同區(qū)域相結(jié)合，所述的核酸序列選自SA15’AGGTTCATAGTTGTACTTCA 3’SA25’TTTGCCTGACGGGAATGCCA 3’SA35’TGCGAATGAGCAGATCTTCA 3’SA45’ATAGTTGTACTTCATTGCCA 3’SA55’GGTTCATAGTTGTACTTCAT 3’SA65’TTCCTGTTTGAGCAGAAAGA 3’SA75’CGGATGATGTTCCACCTGGT 3’SA85’AAGTGTTATGTTTGCGAGCA 3’SA95’ACCGGATGATGTTCCACCTG 3’SA105’GCATAAGCAGTTGTAGCATC 3’SA115’GAAGTGCATTTACATTGGCT 3’SA125’GCCTGTGTTGTAGATTGCGG 3’SA135’AGTTTACATCCTGATTATGTACGACTCCTA 3’SA145’GTCCTTTAGTAAGGTCAGTCTCAGTCCAAC 3’SA155’CTAATATTCTTGATGGATCTGGGTAAGGCA 3’SA165’CTGCGCCTAATATTCTTGATGGATCTGGGT 3’SA175’CCTGCGCCTAATATTCTTGATGGATCTGGG 3’SA185’AGCATCAATAGCCAGTGACACGAACCTTTC 3’SA195’TCCTGATTATGTACGACTCC 3’
SA205’ATCCCAACCCATAAGGTGTG 3’SA215’GGTAAGCATCAATAGCCAGT 3’采用亞磷酰胺固相合成法合成了相應(yīng)的核酸分子，其長度均為20個(gè)或30個(gè)核苷酸殘基。將合成后經(jīng)純化的寡核苷酸用碘處理，將磷酸硫酯鍵轉(zhuǎn)化為磷酸二酯鍵，然后用常規(guī)的DNA測序方法對所有反義核酸序列進(jìn)行序列測定，與設(shè)計(jì)序列一致，以毛細(xì)管電泳法測定所有反義核酸序列的分子量，發(fā)現(xiàn)與理論分子量近似相等。
將上述SA系列反義核酸序列樣品用PBS(500ml溶液中含有9.566克十二水Na2HPO4，0.977克二水NaH2PO4和2.2克NaCl)溶解，Beckman DU640分光光度計(jì)定量，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需樣品量分別取樣。
對上述藥物組合物送P3實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行驗(yàn)證。采用經(jīng)SARS冠狀病毒BJ-01感染的非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero-E6)細(xì)胞株作為靶受體。另外采用正常Vero-E6細(xì)胞設(shè)定脂質(zhì)體-組、脂質(zhì)體+組作為陰性對照實(shí)驗(yàn)組，脂質(zhì)體-組只加轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基、不加脂質(zhì)體及SA系列反義核酸序列；脂質(zhì)體+組加入一定量的脂質(zhì)體、不加SA系列反義核酸序列。對合成的反義核酸進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示，其中21個(gè)反義核苷酸序列或其組合均具有不同程度的抑制SARS冠狀病毒損傷(大于25％)的特性，將它們分別定名為SA(1+3+5)組合、SA(2+4+6)組合、SA2、SA(7+8+12)組合、SA8、SA12、SA(9+10+11)組合、SA(13+14+16)組合、SA(15+17+18)組合、SA15、SA(19+20+21)組合，其中SA15、SA(2+4+6)組合、SA(15+17+18)組合和SA(7+8+12)組合具有較高的抑制SARS冠狀病毒生長(大于50％)的活性。
SARS系列反義寡聚核苷酸均是長為20個(gè)或30個(gè)核苷酸殘基并經(jīng)過硫代修飾的寡聚核苷酸，攻擊目標(biāo)為整個(gè)SARS冠狀病毒基因，它們可以在細(xì)胞質(zhì)中與SARS冠狀病毒基因發(fā)生特異性的結(jié)合，阻斷SARS冠狀病毒基因的復(fù)制和蛋白的產(chǎn)生，從而抑制了SARS冠狀病毒的增殖。從核酸雜交的特性看，RNA與mRNA雜交的親和力比DNA與mRNA雜交的親和力要高，從而在藥用方面具有更大的價(jià)值，但是由于目前合成RNA的成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于合成DNA的成本，考慮到臨床應(yīng)用的成本要求，目前作為臨床應(yīng)用試驗(yàn)的反義核酸藥物均為硫代寡聚脫氧核糖(DNA)，但是將來合成RNA成本有可能降低，可能會(huì)在臨床上采用反義寡聚核糖(RNA)取代反義寡聚脫氧核糖(DNA)作為藥用。
反義核酸的生物學(xué)活性是序列特異性的，互補(bǔ)于某一基因特定位點(diǎn)的反義核酸，互補(bǔ)的長度不同，生物學(xué)活性高低也不同。一般說來，反義核酸與目標(biāo)基因互補(bǔ)長一些，生物學(xué)活性會(huì)高，但是較長的反義核酸其合成的成本會(huì)高很多，所以作為藥用目的的反義核酸，研究者均會(huì)同時(shí)考慮成本核藥用活性選取一個(gè)合適的長度。本發(fā)明中反義核酸長度均為20個(gè)或30個(gè)堿基。當(dāng)然，延長或縮短一至數(shù)個(gè)堿基而互補(bǔ)于同一基因位點(diǎn)的反義核酸也會(huì)具有程度不同的相同生物學(xué)活性。同時(shí)，互補(bǔ)于相同基因位點(diǎn)附近的反義核酸若結(jié)合部位有不同程度的重疊，被認(rèn)為具有程度不同的序列同源性，也會(huì)具有不同程度的相同生物學(xué)活性。
在人體內(nèi)存在大量的核酸外切酶，反義寡核苷酸若不經(jīng)過化學(xué)修飾，會(huì)很快被降解，從而失去活性。反義寡核苷酸的化學(xué)修飾有很多種方法，常見的有硫代修飾反義核酸和2‘-甲氧基修飾反義核酸等。但是目前硫代反義核酸的藥理學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)和毒理學(xué)等臨床前研究是各種化學(xué)修飾中研究得最為全面的，硫代反義核酸在體內(nèi)可以有效地抵御核酸酶的降解，并且可以激發(fā)核糖核酸酶eH的活性，降解與之雜交的mRNA鏈，所以目前臨床實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的反義核酸均為硫代反義核酸。同時(shí)人們也在進(jìn)行其他化學(xué)修飾的反義核酸臨床前藥物研究，以便進(jìn)行臨床應(yīng)用。其他的修飾方式主要為磷酸骨架修飾和糖環(huán)修飾，磷酸骨架修飾包括巰基代磷酸、二巰基代磷酸、甲基化磷酸等；糖環(huán)修飾包括2’位甲基化、甲氧基化等DNA與RNA修飾，此外還包括肽核酸等核酸類似物。所以某一特定序列的反義核酸可以通過不同的化學(xué)修飾作為化學(xué)組份不同的化合物，在臨床上都具有藥物活性。
毋庸諱言，本發(fā)明提供的SA系列反義核酸序列可與藥用載體或賦形劑的組成藥物組合物。通過對感染SARS冠狀病毒的動(dòng)物或人體進(jìn)行各種方式的給藥，以達(dá)到治療SARS或其他由SARS冠狀病毒導(dǎo)致的疾病。
綜上所述，本發(fā)明所述的互補(bǔ)于SARS冠狀病毒基因不同部位的反義核酸具有抑制SARS冠狀病毒增殖的特性，在SARS的治療方面顯示出誘人的前景?？梢酝ㄟ^不同的化學(xué)修飾，采用不同的長度和不同程度同源性的序列發(fā)展為具有臨床應(yīng)用價(jià)值的抗SARS冠狀病毒的藥物。


圖1 加入SA系列反義核酸序列后，感染了SARS冠狀病毒的非洲綠猴腎細(xì)胞的存活率具體實(shí)施方式
在下面的具體實(shí)施方式
將進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不限制本發(fā)明范圍。
實(shí)施例1SA系列反義核酸序列攻擊靶位目標(biāo)的確定及反義核酸序列的合成。
在整個(gè)SARS冠狀病毒基因圖譜(約30Kb)的各個(gè)基因區(qū)段上選定反義核酸攻擊的位點(diǎn)。
使用美國PE公司應(yīng)用生物系統(tǒng)部(APPLIEDBIOSYSTEMS)制造的392型DNA-RNA合成儀及其配套試劑，以亞磷酰胺固相合成法合成所設(shè)計(jì)的反義核酸，并對其進(jìn)行硫代修飾。合成原料均由合成儀生產(chǎn)廠商提供，主要原料有四種二異丙基β-氰乙基亞磷酰胺單體腺苷(A)、鳥苷(G)、胸腺嘧啶苷(T)、胞嘧啶苷(C)；四種控制孔徑玻璃粉(Control Pore Glass)固相合成載體(A，G，C，T)；活化試劑四唑/乙腈蓋帽物試劑乙酸酐/二甲基嘧啶/四氫呋喃，1-甲基嘧啶/四氫呋喃；硫代反應(yīng)試劑H-1，2-苯二硫醇-3-酮1，1二氧化物(Beaucage)/乙腈；脫三苯甲基試劑三氯乙酸/二氯甲烷；液體試劑乙腈/三氯甲烷；合成規(guī)模為0.2μM，固相載體量為50μM，堿基載體溶于無水乙晴中，濃度為100μM，其他試劑濃度及用量均按照儀器手冊進(jìn)行。合成過程完全由電腦自動(dòng)控制。
合成產(chǎn)物由濃氨水(28％)切割收集在密封耐壓的玻璃瓶中，于55℃、18小時(shí)進(jìn)行脫保護(hù)處理。脫保護(hù)結(jié)束后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40℃、0.1Mpa負(fù)壓下脫去粗產(chǎn)品中的氨，用Pharmacia的MonoQHP5/5進(jìn)行純化脫鹽，去除短片段。純化產(chǎn)物凍干后得到白色粉末狀物質(zhì)，儲(chǔ)存于-20℃，進(jìn)行產(chǎn)品分析。
1.用質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)測定分子量；2.用毛細(xì)管凝膠電泳測定其純度；3.DNA測序法測定序列；4.P31 NMR(核磁共振)確定硫代程度。
MALDI-TOF-MS測定的分子量與寡核苷酸的理論分子量相符。
毛細(xì)管凝膠電泳純度分析結(jié)果顯示本發(fā)明中的SARS系列反義核酸純品的純度大于95％。
序列測定證明本發(fā)明中的SARS系列反義核酸序列與設(shè)計(jì)序列相同。
P31 NMR分析顯示SARS系列反義核酸的硫代率大于98.5％。
實(shí)施例2SA系列反義核酸序列的化學(xué)組成結(jié)構(gòu)將合成后經(jīng)純化的寡核苷酸用碘處理，將磷酸硫酯鍵轉(zhuǎn)化為磷酸二酯鍵，然后用常規(guī)的DNA測序方法對所有反義核酸序列進(jìn)行序列測定，結(jié)果顯示得到的反義核酸序列與設(shè)計(jì)序列一致；以毛細(xì)管電泳法測定所有反義核酸序列的分子量，發(fā)現(xiàn)與理論分子量近似相等。
實(shí)施例3SA系列反義核酸序列對于感染了SARS的非洲綠猴腎細(xì)胞的抑制1.將實(shí)施例3中所述在培養(yǎng)的非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero-E6)上用SARS病毒-BJ-01株進(jìn)行驗(yàn)證。在P3實(shí)驗(yàn)室操作。
2.SARS冠狀病毒劑量為10-3(病毒半數(shù)感染劑量TCID50＝10-7，本實(shí)驗(yàn)所使用的病毒劑量高于病毒半數(shù)感染劑量四個(gè)數(shù)量級)，通常是2-3天病變。
3.藥物的劑量為1μM4.評判指標(biāo)(用CPE法測定藥效)細(xì)胞無病變 -細(xì)胞病變在25％以下 +細(xì)胞病變在26-50％ ++細(xì)胞病變在51-75％ +++細(xì)胞病變在76-100％ ++++細(xì)胞存活率的計(jì)算按上述的觀察等級估算。細(xì)胞病變在+至+++之間則按細(xì)胞病變等級范圍的中位數(shù)計(jì)算。例如當(dāng)計(jì)數(shù)在-時(shí)，細(xì)胞病變等級為0。當(dāng)計(jì)數(shù)為25％以下時(shí)，病變按12.5％計(jì)算。當(dāng)計(jì)數(shù)在25-50％時(shí)，病變按38％計(jì)算。當(dāng)計(jì)數(shù)在50-75％時(shí)，病變按63％計(jì)算。細(xì)胞病變在76-100％時(shí)，病變按100％計(jì)算。
5.實(shí)驗(yàn)程序第一天鋪板消化和收集VERO-E6細(xì)胞，用完全培養(yǎng)液配成2.5×105/ml的細(xì)胞懸液，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μl。37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)18-24小時(shí)。
第二天鏡檢觀察細(xì)胞布滿孔底面積80-90％成片，狀態(tài)良好即可開始正式實(shí)驗(yàn)，將原來的細(xì)胞培養(yǎng)液全部吸棄，每孔加入100μl待篩選的藥物于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(含一定量的脂質(zhì)體)，每個(gè)待檢樣品做3個(gè)復(fù)孔。1hr后，加入100μl/孔SARS BJ-01病毒(10-3)，2-3小時(shí)后吸棄100μl/孔，加入完全培養(yǎng)基100μl/孔，放入37℃，5％CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。另外設(shè)定脂質(zhì)體-、脂質(zhì)體+組，脂質(zhì)體組只加轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，不加脂質(zhì)體及寡核苷酸；脂質(zhì)體+組加入一定量的脂質(zhì)體，不加脂質(zhì)體。
第三天-第四天當(dāng)病毒對照孔全部病變時(shí)，觀察藥物對細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)。
6.實(shí)驗(yàn)初步結(jié)果實(shí)驗(yàn)設(shè)正常細(xì)胞對照和病毒對照。
正常細(xì)胞對照為不加病毒亦不加藥物；在實(shí)驗(yàn)全過程應(yīng)當(dāng)無病變。
病毒對照為加病毒但不加藥物；在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)應(yīng)當(dāng)全部病變。
藥物對照為加藥物不加病毒，在實(shí)驗(yàn)全過程應(yīng)當(dāng)無病變。實(shí)驗(yàn)初步結(jié)果

未加藥物和未加SARS冠狀病毒的正常細(xì)胞對照在實(shí)驗(yàn)全過程中未見病變。

加入SARS冠狀病毒的病毒對照在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)全部病變，顯示重度損傷或100％死亡。

藥物本身對VERO-E6細(xì)胞未顯示毒性。篩選結(jié)果如表2所示表2

與未加藥物但加入SARS冠狀病毒的嚴(yán)重?fù)p傷或100％死亡的細(xì)胞相比，藥物序列SA15、SA(2+4+6)組合、SA(15+17+18)組合和SA(7+8+12)組合對感染SARS冠狀病毒的VERO-E6細(xì)胞均顯示具有明顯的保護(hù)作用(＞50％)；藥物序列SA(1+3+5)組合、SA2、SA8、SA12、SA(9+10+11)組合、SA(13+14+16)組合、SA(19+20+21)組合顯示有一定程度的保護(hù)作用(25～50％)。
勿需贅言，本發(fā)明的SARS反義序列具有很大的可能通過不同的化學(xué)修飾、采用不同的長度和不同程度同源性的序列發(fā)展為具有臨床應(yīng)用價(jià)值的抗SARS冠狀病毒的藥物。單獨(dú)使用或與其他藥物聯(lián)合使用進(jìn)行SARS的治療，這對在本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員看來是顯而易見的。
序列表<110>北京金賽獅反義核酸技術(shù)開發(fā)有限責(zé)任公司<120>針對SARS冠狀病毒基因的反義核酸序列及其藥物用途<160>21<170>PatentIn Version 2.1<210>SA1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(20)<223>n＝a或g或c或t<400>SA1AGGTTCATAG TTGTACTTCA 20<210>SA2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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<222>(1)...(20)<223>n＝a或g或c或t<400>SA2TTTGCCTGAC GGGAATGCCA20<210>SA3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(20)<223>n＝a或g或c或t<400>SA3TGCGAATGAG CAGATCTTCA20<210>SA4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>n＝a或g或c或t<400>SA4ATAGTTGTAC TTCATTGCCA 20<210>SA5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(20)<223>n＝a或g或c或t<400>SA5GGTTCATAGT TGTACTTCAT 20<210>SA6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(20)<223>n＝a或g或c或t
<400>SA6TTCCTGTTTG AGCAGAAAGA 20<210>SA7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(20)<223>n＝a或g或c或t<400>SA7CGGATGATGT TCCACCTGGT 20<210>SA8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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AAGTGTTATG TTTGCGAGCA 20<210>SA9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(20)<223>n＝a或g或c或t<400>SA9ACCGGATGAT GTTCCACCTG 20<210>SA10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(20)<223>n＝a或g或c或t<400>SA10GCATAAGCAG TTGTAGCATC 20
<210>SA11<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(20)<223>n＝a或g或c或t<400>SA11GAAGTGCATT TACATTGGCT 20<210>SA12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(20)<223>n＝a或g或c或t<400>SA12GCCTGTGTTG TAGATTGCGG 20
<210>SA13<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(30)<223>n＝a或g或c或t<400>SA13AGTTTACATC CTGATTATGT ACGACTCCTA 30<210>SA14<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(30)<223>n＝a或g或c或t<400>SA14GTCCTTTAGT AAGGTCAGTC TCAGTCCAAC 30<210>SA15
<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(30)<223>n＝a或g或c或t<400>SA15CTAATATTCT TGATGGATCT GGGTAAGGCA 30<210>SA16<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(30)<223>n＝a或g或c或t<400>SA16CTGCGCCTAA TATTCTTGAT GGATCTGGGT 30<210>SA17<211>30
<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(30)<223>n＝a或g或c或t<400>SA17CCTGCGCCTA ATATTCTTGA TGGATCTGGG30<210>SA18<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(30)<223>n＝a或g或c或t<400>SA18AGCATCAATA GCCAGTGACA CGAACCTTTC30<210>SA19<211>20<212>DNA
<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(20)<223>n＝a或g或c或t<400>SA19TCCTGATTAT GTACGACTCC 20<210>SA20<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(20)<223>n＝a或g或c或t<400>SA20ATCCCAACCC ATAAGGTGTG 20<210>SA21<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(20)<223>n＝a或g或c或t<400>SA21GGTAAGCATC AATAGCCAGT20
權(quán)利要求
1.一種反義核酸序列，其特征在于可特異性地與導(dǎo)致嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥(SARS)的冠狀病毒的特定基因的不同區(qū)域相合，所述的核酸序列選自下列序列之一或其組合SA15’AGGTTCATAGTTGTACTTCA 3’SA25’TTTGCCTGACGGGAATGCCA 3’SA35’TGCGAATGAGCAGATCTTCA 3’SA45’ATAGTTGTACTTCATTGCCA 3’SA55’GGTTCATAGTTGTACTTCAT 3’SA65’TTCCTGTTTGAGCAGAAAGA 3’SA75’CGGATGATGTTCCACCTGGT 3’SA85’AAGTGTTATGTTTGCGAGCA 3’SA95’ACCGGATGATGTTCCACCTG 3’SA105’GCATAAGCAGTTGTAGCATC 3’SA115’GAAGTGCATTTACATTGGCT 3’SA125’GCCTGTGTTGTAGATTGCGG 3’SA135’AGTTTACATCCTGATTATGTACGACTCCTA 3’SA145’GTCCTTTAGTAAGGTCAGTCTCAGTCCAAC 3’SA155’CTAATATTCTTGATGGATCTGGGTAAGGCA 3’SA165’CTGCGCCTAATATTCTTGATGGATCTGGGT 3’SA175’CCTGCGCCTAATATTCTTGATGGATCTGGG 3’SA185’AGCATCAATAGCCAGTGACACGAACCTTTC 3’SA195’TCCTGATTATGTACGACTCC 3’SA205’ATCCCAACCCATAAGGTGTG 3’SA215’GGTAAGCATCAATAGCCAGT 3’
2.如權(quán)利要求1所述的反義核酸序列，其中優(yōu)選的為SA15。
3.如權(quán)利要求1所述的反義核酸序列，其中優(yōu)選的為SA(2+4+6)組合。
4.如權(quán)利要求1所述的反義核酸序列，其中優(yōu)選的為SA(15+17+18)組合。
5.如權(quán)利要求1所述的反義核酸序列，其中優(yōu)選的為SA(7+8+12)組合。
6.含有權(quán)利要求1-5之一所述的反義核酸序列及可藥用載體或賦形劑的藥物組合物。
7.如權(quán)利要求1-5之一所述的反義核酸序列用于制備抗SARS藥物的用途。
8.如權(quán)利要求1-5之一所述的反義核酸序列用于制備其它由于SARS冠狀病毒引起的疾病的藥物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種針對嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥(SARS)冠狀病毒基因的人工合成的反義核酸序列，該序列與SARS冠狀病毒基因的特定位點(diǎn)上的核苷酸序列互補(bǔ)，根據(jù)堿基互補(bǔ)原理，該反義核酸序列在人體或動(dòng)物體內(nèi)與SARS－冠狀病毒的特定位點(diǎn)相結(jié)合，從而阻斷該基因在人體或動(dòng)物體內(nèi)的復(fù)制或表達(dá)，以達(dá)到治療該疾病的目的。本發(fā)明還涉及含有該反義核酸序列的藥物組合物，及其藥物用途。
文檔編號A61K31/7088GK1569873SQ03146798
公開日2005年1月26日 申請日期2003年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月11日
發(fā)明者王君, 劉健平 申請人:北京金賽獅反義核酸技術(shù)開發(fā)有限公司