專利名稱：一種促進gp96蛋白的免疫活性的方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種促進gp96蛋白的免疫活性的方法及其應用。
背景技術：
熱休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)具有獨特的免疫學功能，其免疫學機制包括二方面一是HSI^s參與T細胞抗原呈遞；二是HSI^s有效激發(fā)天然免疫。熱休克蛋白存在于細胞漿和內質網(wǎng)膜內，由多個成員組成，如HSP60，HSP70，HSP90 和gp96等。熱休克蛋白一方面作為分子伴侶在蛋白折疊與運輸過程中發(fā)揮重要作用 ’另一方面能結合細胞中5-25mer的抗原多肽，通過抗原呈遞細胞(APC)表面CD91分子進入細胞并將結合的抗原表位呈遞給MHC I類和II類分子，從而啟動特異性T細胞免疫應答。熱休克蛋白本身是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一的來源于哺乳動物細胞的天然佐劑，它可作用于APC及T細胞等其它免疫細胞，促進DC成熟，刺激細胞產(chǎn)生免疫因子IL-6、IL-12、 TNF等，從而增強機體非特異性免疫反應。有研究表明gp96對于APC中Tol 1樣受體 (Toll-likereceptors,TLRs)發(fā)揮免疫學功能起至關重要的作用，gp96基因缺失的DC細胞中TLRs喪失引發(fā)天然免疫的功能，導致轉基因小鼠抵抗感染的能力明顯降低。熱休克蛋白-多肽復合物治療性疫苗已用于臨床試驗。由于腫瘤細胞是一種變異的細胞，因此外源性地給予非特異性或特異性免疫因子或細胞，增強或擴大機體的免疫力， 可達到清除體內腫瘤細胞的目的?；谶@個原理，多種非特異性免疫學治療方法如給予外源性白介素2、干擾素、LAK細胞的輸注等方法均已在臨床使用，但療效并不令人滿意，主要原因之一是存在腫瘤免疫逃逸。腫瘤細胞常常丟失腫瘤抗原的表達或改變其抗原表達譜， 使得針對已知腫瘤抗原而設計的腫瘤疫苗不能有效激發(fā)針對腫瘤細胞的免疫反應。研究表明腫瘤具有個體特異性，腫瘤的特異性不僅表現(xiàn)在腫瘤類型之間，還表現(xiàn)在不同個體之間， 即同種類型腫瘤患者中，不同個體的腫瘤生物學和免疫學特性也存在顯著差別。HSP天然結合腫瘤細胞中各種抗原，因此將熱休克蛋白開發(fā)成個體化腫瘤疫苗，可以充分考慮到患者個體間的差異，以達到最佳治療效果。開展個體化治療亦是當今醫(yī)學及藥物學發(fā)展的必然方向之一。近6年來，HSP gp96-多肽復合物用于臨床試驗相繼在美國、英國、德國、意大利及俄羅斯等國的醫(yī)院或癌癥中心進行，主要用于胃癌、前列腺癌、腎癌，黑色素瘤等腫瘤和 HIV、生殖器泡疹等傳染性疾病的治療。目前腎癌和惡性黑色素瘤的治療已完成臨床III 期，直腸癌和淋巴瘤已完成臨床II期。該治療方法在俄羅斯已經(jīng)批準上市。從已有的臨床資料看，gp96-抗原復合物作為自體疫苗治療腫瘤療效無容置疑，腎細胞癌和黑色素瘤已經(jīng)完成III期臨床，接受治療的患者數(shù)量大，并具有統(tǒng)計學意義，Mla和Mlb期患者接受10次以上的免疫，平均存活期比醫(yī)生選擇的治療延長18. 4個月(31.2vs 12. 8月，P = 0.03，危險比HR = 0. 45)。對未轉移腎癌患者治療的III期臨床資料發(fā)現(xiàn)中等風險患者(n = 362) (包括Ι/ΙΙ期，III期的Τ1/2/3)接受gp96自體疫苗治療，復發(fā)時間延長45% (P <0.01， 危險比HR = 0. 55)，與對照相比復發(fā)時間延長約1.8年，同時接受治療的患者存活期延長。
調節(jié)性T細胞(Treg)抑制了很多類型細胞的活化、增值、分化和效應功能，包括 ⑶4+、⑶8+T細胞、B細胞、NK細胞、NKT細胞及DC細胞。Treg是一類⑶4+CD25+的T細胞。 Treg分為兩個主要類群胸腺衍生的天然Treg(IiTreg)和外周誘導的Treg(iTreg)。它們通過不同的途徑來行使抑制調節(jié)功能，nTreg主要通過細胞-細胞的直接接觸起作用，而 iTreg通過高濃度的TGFi3 1或者IL_10/TGFi3 1發(fā)揮抑制功能。去除Treg細胞導致小鼠自發(fā)的產(chǎn)生自身免疫疾病。但也有證據(jù)表明，去除或者減少Treg細胞能增強機體針對病毒、 腫瘤等疾病的免疫反應。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種促進gp96蛋白的免疫活性的方法及其應用。本發(fā)明提供了免疫調節(jié)劑在提高gp96蛋白相關物質的免疫活性中的應用；所述 gp96蛋白相關物質為序列表的序列1所示的gp96蛋白、序列表的序列1自氨基末端第1至 355位氨基酸殘基所示的N355片段或含有gp96蛋白的提取物。本發(fā)明還保護一種疫苗佐劑，為如下(a)或(b)或(c) :(a)由免疫調節(jié)劑和所述 N355片段組成的疫苗佐劑；(b)由免疫調節(jié)劑和所述gp96蛋白組成的疫苗佐劑；(c)由免疫調節(jié)劑和所述含有gp96蛋白的提取物組成的疫苗佐劑。本發(fā)明還保護一種乙肝疫苗和/或抑制乙肝病毒的疫苗，由所述gp96蛋白相關物質、乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝核心蛋白(HBcAg)和免疫調節(jié)劑組成。本發(fā)明還保護一種乙肝疫苗和/或抑制乙肝病毒的疫苗，由gp96蛋白相關物質、 乙肝表面抗原表位362-371、乙肝核心蛋白表位87-95、乙肝聚合酶表位140-148和免疫調節(jié)劑組成；所述乙肝表面抗原表位362-371如序列表的序列6所示；所述乙肝核心蛋白表位87-95如序列表的序列7所示；所述乙肝聚合酶表位140-148如序列表的序列8所示。本發(fā)明還保護一種黑色素瘤疫苗，由所述gp96蛋白相關物質和免疫調節(jié)劑組成。以上任一所述免疫調節(jié)劑為環(huán)磷酰胺、抗⑶25的抗體和R)xp3的干擾RNA中的至少一種。所述Foxp3的干擾RNA如序列表的序列5所示。以上任一所述含有gp96蛋白的提取物是將離體動物組織或離體腫瘤組織或離體腫瘤細胞的勻漿液依次進行ConA-S印harose層析和HiTrap-Q Sepharose離子交換層析得到的；所述離體動物組織為離體小鼠肝臟、離體豬肝臟或離體人胎盤；所述腫瘤組織為乳腺癌、腦膠質瘤、腎癌、腸癌、肝癌或胃癌；所述腫瘤細胞為人肝癌細胞IfepG2或黑色素瘤細胞B16 ；所述ConA-S^harose層析包括如下步驟(1)將所述勻漿液上樣于層析柱，流速為 0. 25ml/min ； (2)用10倍層析柱柱體積的洗脫液甲洗滌步驟(1)的層析柱，流速為0. 5ml/ min ；所述洗脫液甲的制備方法為在NaCl濃度為200mM pH7. 5的PBS中加苯甲基磺酰氟 (PMSF)至終濃度為ImM ； (3)用3倍層析柱柱體積的洗脫液乙洗滌步驟(2)的層析柱，流速為0. 25ml/min，收集洗脫液，即為洗脫液丙；所述洗脫液乙的制備方法為在NaCl濃度為 200mMpH7. 5的PBS中加α -D-吡喃葡萄糖至終濃度為10g/mL，加苯甲基磺酰氟至終濃度為 ImM ；所述HiTrap-Q kpharose離子交換層析包括如下步驟(a)將所述洗脫液丙上樣于層析柱，流速為lml/min ； (b)用5ml NaCl濃度為200mM pH7. 5的PBS洗滌步驟(a)的層析柱，流速為lml/min ； (c)用IOml NaCl濃度為300mM pH7. 5的PBS洗滌步驟(b)的層析柱， 流速為lml/min ； (d)用:3ml NaCl濃度為600mM pH7. 5的PBS洗滌步驟(c)的層析柱，流速為lml/min，得到的洗脫液即為含有gp96蛋白的提取物。以上任一所述疫苗的各個組分均單獨包裝。gp96蛋白既可天然提取，也可利用大腸桿菌或酵母表達。gp96蛋白、N355片段和含有gp96蛋白的提取物與乙肝抗原表位免疫小鼠可明顯提高iTreg的數(shù)量，同時Treg的功能也明顯增強，包括對⑶4+和⑶8+T細胞生長的抑制和分泌IFN- γ的抑制功能明顯增強，Treg與⑶8+T、乙肝抗原特異性T細胞、分泌IFN- γ細胞呈負相關，說明Treg對T細胞有抑制作用。gp96蛋白一方面通過抗原呈遞激活CTL，同時又能激活Treg，Treg反過來又抑制CTL活性，因此gp96對乙肝T細胞免疫有雙向調節(jié)功能。在上述免疫中加入免疫調節(jié)劑，可清除gp96誘導產(chǎn)生的Treg，T細胞數(shù)量有明顯提高，包括⑶8+T、乙肝抗原特異性T細胞、分泌IFN-γ細胞數(shù)量有明顯增加(P <0.01)，說明免疫調節(jié)劑可顯著增強gp96引發(fā)的乙肝特異性T細胞免疫應答。小鼠試驗表明，本發(fā)明提供的乙肝疫苗能有效激活HBV特異性T細胞，小鼠免疫8周后血清中的HBV S抗原降低 50%以上，肝臟細胞中病毒清除90%以上。以上研究表明疫苗有良好的抗HBV活性。給小鼠注射低劑量的環(huán)磷酰胺、抗CD25的抗體或下調R)xp3等抑制Treg，則疫苗對乙肝病毒復制的抑制能顯著提高(P < 0. 01)。將gp96與小鼠黑色素瘤抗原體外組裝，制備gp96腫瘤疫苗。通過不同劑量的小鼠免疫試驗，發(fā)現(xiàn)高劑量的gp96疫苗引發(fā)的對黑色素瘤的免疫排斥反應反而低于低劑量組。研究闡明了 gp96免疫調控機制，一方面通過抗原呈遞激活CTL 殺傷腫瘤細胞，同時又能激活iTreg抑制CTL活性，降低腫瘤免疫排斥反應。在gp96腫瘤疫苗免疫實驗中同時注射低劑量的環(huán)磷酰胺，清除gp96誘導產(chǎn)生的Treg，則顯著提高gp96腫瘤疫苗的活性。上述實驗中，使用抗⑶25的抗體和R)xp3的干擾RNA(siRNA)同樣能降低 Treg的數(shù)量，達到增強gp96疫苗免疫活性的目的。


圖1為N355片段的鑒定圖譜。圖2為rgp96蛋白的鑒定圖譜；1 分子量標準；2 步驟(二)的發(fā)酵液；3 親和層析后的洗脫液；4 離子交換層析后的洗脫液；5 :rgp96蛋白的western blot。圖3為gp96提取物的鑒定圖譜。圖4為實施例2中rgp96蛋白和gp96提取物的免疫活性比較(流式細胞檢測結果)；A 為 HBc87-95，B 為 HBc87_95+gp96，C 為 HBc87_95+rgp96，D 為 HBc87_95+IFA。圖5為實施例4中T細胞活性檢測和Tetramer檢測的結果；A為流式細胞儀檢測結果(免疫引發(fā)的乙肝病毒特異性CTL反應)，B為CD8+T細胞占脾細胞的比例(免疫引發(fā)的T細胞反應)，C為Tetramer陽性細胞占⑶8+T細胞的比例(免疫引發(fā)的乙肝特異性T 細胞反應)；1為第一組，2為第二組，3為第三組，4為第四組，5為第五組，6為第六組。圖6為復合物免疫的ELISP0T檢測結果。圖7為實施例4中Treg檢測結果；A為流式細胞儀檢測結果(免疫引發(fā)的乙肝病毒特異性CTL反應)，B為Treg陽性細胞占⑶4+T細胞的比例；1為第一組，2為第二組，3 為第三組，4為第四組，5為第五組，6為第六組。圖8為免疫對小鼠Treg活性的促進；A =FACS檢測Treg對⑶4和⑶8T細胞增殖的抑制；B 第一組、第二組和第五組免疫對⑶4和⑶8T細胞增殖的抑制作用；C 第三組、第四組和第六組免疫對⑶4和⑶8T細胞增殖的抑制作用；D 第一組、第二組和第五組免疫對分泌IFN-Y的細胞的抑制作用；E 第三組、第四組和第六組免疫對分泌IFN-Y的細胞的抑制作用；1為第一組，2為第二組，3為第三組，4為第四組，5為第五組，6為第六組。圖9為免疫小鼠中Treg與T細胞的相關性分析；A =Treg與總CD8+細胞；B =Treg 與乙肝特異性T細胞；C =Treg與分泌IFN- γ的T細胞。圖10為實施例5的步驟一的1的結果。圖11為實施例5的步驟一的2的結果。圖12為實施例5的步驟二的結果。圖13為實施例5的步驟三的結果。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。BALB/c小鼠購自北京維通利華公司；HBV轉基因鼠購自廣州解放軍第458醫(yī)院。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。以下實施例中均采用皮下注射進行免疫(實際應用中，也可隨機選用其它免疫方式， 如皮內注射或肌肉注射)。乙肝表面抗原(HBsAg)購自北京天壇生物股份公司。乙肝核心蛋白(HBcAg)購自abeam公司，產(chǎn)品編號ab49013?？笴D4的抗體購自BioLegend， 產(chǎn)品目錄號100407?？笴D8的抗體購自BioLegend，產(chǎn)品目錄號100705?？笴D25的抗體購自BioLegend，產(chǎn)品編號101906?？筊)xP3的抗體購自eBioscience，產(chǎn)品目錄號 77-5775。HBc87-95 是乙肝核心蛋白表位87-95，序列為SYVNTNMGL，由上海吉爾生化公司合成。HBsAg362-371 是乙肝表面抗原表位362-371，序列為WYWGPSLYSI，由上海吉爾生化公司合成。乙肝聚合酶表位140-148，序列為HYFQTRHYL，由上海吉爾生化公司合成。轉錄因子R)xP3是特異的Treg細胞的分子標志，對⑶4+CD25+Treg細胞的發(fā)育和行使功能有著重要的作用；FoxP3的干擾RNA :5’-GGACACUCAAUGAAAUCUA-3’，由廣州銳博公司合成。gp96 蛋白(人熱休克蛋白；GENBANK ACCESSION NO. AY040226)的氨基酸序列如序列表的序列1 所示，其編碼序列如序列表的序列2所示。gp96蛋白片段(N355片段)為序列表的序列1 自氨基末端第1至355位氨基酸殘基組成的多肽，其編碼序列如序列表的序列2自5’末端第1至1065位核苷酸所示。實施例1、N355片段、gp96蛋白和gp96蛋白的提取物的制備一、N355片段的制備利用大腸桿菌表達N355片段，具體方法如下1、設計如下N355引物對，由上海英俊公司合成引物上游引物5，-CGCGGATCCGACGATGAAGTTGATGTGGAT-3，；下游引物5，-CCGCTCGAGTTAAGTAAAGTGAATATAAGCCATG-3，。2、提取人肝癌細胞H印G2(購自ATCC，產(chǎn)品號HB-8065)的mRNA，反轉錄合成cDNA。3、以步驟2的cDNA為模板，用N355引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物(含 N355片段的編碼序列)。4、用限制性內切酶BarnHI和Bio I雙酶切PCR擴增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。
5、用限制性內切酶BarnHI和Xho I雙酶切pGEX_6P_l質粒(購自GE公司，產(chǎn)品編號27-4597-01)，回收載體骨架。6、將步驟4的酶切產(chǎn)物和步驟5的載體骨架連接，得到連接產(chǎn)物。7、將連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5 α (購自天根生化科技公司，產(chǎn)品號CB101-03)感受態(tài)，挑取單菌落進行酶切鑒定，酶切鑒定陽性的菌落提取質粒進行測序鑒定。測序結果表明，得到了重組質粒PGEX-N355 (骨架載體為pGEX_6P_l，在BarnHI和Bio I酶切位點之間插入了 N355片段的編碼序列)。8、將重組質粒pGEX-N355轉化大腸桿菌BL21 (DE3)(購自天根生化科技公司，產(chǎn)品號CB105-(^)感受態(tài)細胞，從平板上挑取單菌落接入含lOOmg/mL氨芐青霉素的2 X YT培養(yǎng)基(胰蛋白胨16g，酵母提取物10g，氯化鈉5g，加水定容至IOOOmL)活化；取活化液(菌液) 接入2 X YT培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)至OD6tltl值為0. 6-1. 0，然后加入IPTG (使其終濃度為lmmol/ L)，37°C誘導4h，收集菌體。9、菌體用 PBS 緩沖液(140mmol/L NaCl, 2. 7mmol/L KCl, 10mmol/L Na2HPO4 1. 8mmo VLKH2PO4 ；pH 7. 3)重懸，冰浴條件下超聲破碎Q00W，破碎如停6s，99次3個循環(huán))，然后40C 12000轉/min離心20min,收集上清。10、將上清4 °C進行親和層析，載體為Glutathione-kpharose 4B (購自GE 公司，產(chǎn)品編號17-5132-01)，采用還原型谷胱甘肽洗脫緩沖液(lOmmol/L reduced glutathione, 50mmol/L Tris-HCl, pH8. 0)洗脫，收集洗脫液。11、將洗脫液用超濾濃縮法更換成酶切緩沖體系(50mmol/L Tri s-HCl, pH8. 0 ； 150mmol/LNaCl ；lmmol/L DTT ；lmmol/L EDTA，pH 8· 0)，加入過量PreScission Protease酶 (PSP蛋白；購自GE公司，產(chǎn)品編號27-0843-01)，4°C酶切16h。12、將酶切后的酶切體系用超濾濃縮法更換成PBS緩沖液，然后進行親和層析，載體為Glutathione-kpharose 4B，采用PBS緩沖液進行洗脫，GST和PSP結合到層析柱上， 收集洗脫液，即為N355片段。13、將含有N355片段的溶液進行10% SDS-PAGE，然后進行考染，見圖1的泳道1。 N355片段的純度達95%以上。將N355片段進行western blot，一抗為大鼠抗gp96抗體 (購自santacruz，產(chǎn)品號sc-56399)，見圖1的泳道2。二、重組gp96蛋白(rgp96蛋白)的制備( 一 )重組質粒 pHFMDZ-RlL2GAmy-gp96 的構建1、提取人肝癌細胞H印G2的mRNA，反轉錄合成cDNA。2、以步驟1的cDNA為模板進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物。上游引物5，-CCGgaattcATGGACGATGAAGTTGATG-3，；下游引物5，-CCGctcgagCTATTAGAATTCATCTTTTTCAGCTGTAG-3，。3、用限制性內切酶EcoRI和BioI雙酶切PCR擴增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。4、用限制性內切酶EcoRI和XhoI雙酶切質粒pHFMDZ-RIA (購自hvitrogen公司， 產(chǎn)品號V20520)，回收載體骨架。5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質粒pHFMDZ-Rl_gp96。測序結果表明，重組質粒pHFMDZ-Rl-gp96的骨架載體為pHFMDZ-RIA，在EcoRI和 XhoI酶切位點之間插入了 gp96蛋白的編碼序列)。
6、在重組質粒pHFMDZ-Rl-gp96的BglII酶切位點插入LEU2片段(序列表的序列 3所示的DNA)，BamHI酶切位點插入α -淀粉酶報告系統(tǒng)(序列表的序列4所示的DNA)，得到重組質粒 pHFMDZ-RlL2GAmy-gp96。(二)rgp96蛋白的表達1、采用電轉化法將重組質粒pHFMDZ-RlL2GAmy-gp96導入漢遜酵母(購自ATCC，產(chǎn)品號MYA-335)細胞，得到重組菌。2、將重組菌接種于5mL SD液體培養(yǎng)基(購自上海杰美基因醫(yī)藥公司，產(chǎn)品號 GMS12117. 7)，37°C培養(yǎng)48h，然后轉接到IOOmL SYN6培養(yǎng)基(購自上海杰美基因醫(yī)藥公司， 產(chǎn)品號GMS12116. 1)，30°C培養(yǎng)48h，得到種子培養(yǎng)液。3、將兩瓶種子培養(yǎng)液接種于含有2L SYN6培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，30°C培養(yǎng)；使用氨水控制pH維持在5. 5 ；每4h檢測1次發(fā)酵液中甘油含量，根據(jù)發(fā)酵液中甘油的濃度補加甘油，控制甘油終濃度在0. 5%左右，同時控制溶氧在20%以上；根據(jù)菌體的生成情況檢測菌體濕重，等菌體濕重達到180-200g/L的時候停止補加甘油，開始誘導重組rgp96蛋白產(chǎn)生(補加甲醇，使甲醇濃度維持在0. 5-0. 8%左右)，誘導開始72小時后停止發(fā)酵。(三)rgp96蛋白的分離純化將步驟(二)的發(fā)酵液離心收集菌體，用PBS緩沖液洗滌細胞2次，在球磨機 (DYNO-MILLmodel KDL)中，按照廠家提供的操作手冊使用玻璃珠球磨的方法破碎細胞；破碎后的細胞12000轉/min離心20min，收集上清液；上清液用0. 45 μ m濾膜進行過濾，得到濾液，將濾液進行濃縮，得到濃縮液。將濾液進行親和層析，具體步驟如下采用英俊公司anvitrogen Corporation) 的Ni-NTAPurification System進行親和層析，主要步驟為先用PBS平衡柱子池；然后用 PBS (含20mM咪唑)平衡柱子池；將濃縮液用PBS (含20mM咪唑)稀釋后上樣；用PBS (含 20mM咪唑)沖洗柱子至OD值< 0. 01 ；用PBS (含200mM咪唑)洗脫1. 5h，收集洗脫液(即為rgp96蛋白)；所有操作在4C下進行，流速為0. 5mL/min。每升步驟(二)的發(fā)酵液純化后可以獲得50毫克純度90%以上的rgp96蛋白。 如果蛋白洗脫液中含有異源雜蛋白，可將親和層析的洗脫液進行離子交換層析⑴柱)，主要步驟200mMNaCl的PBS液平衡；上樣；300mM NaCl的PBS液洗雜質；800mM NaCl的PBS 液洗目的蛋白。將步驟(二)的發(fā)酵液、親和層析后的洗脫液(rgp96蛋白)和離子交換層析后的洗脫液進行10% SDS-PAGE，然后進行考染，見圖2。rgp96蛋白的純度達90%以上。將rgp96 蛋白進行western blot，一抗為大鼠抗gp96抗體(購自santa cruz，產(chǎn)品號sc-56399)，見圖2。三、gp96提取物的制備用小鼠肝臟制備gp96提取物，方法如下1、組織勻漿勻漿緩沖液配方在pH7. 0的碳酸氫鈉緩沖液中加PMSF(苯甲基磺酰氟，分子式為 C7H7FO2S)至終濃度ImM(置于冰上的燒杯中配置；PMSF在水溶液中數(shù)小時內分解，該溶液不可過夜)。取燒杯置于冰上，將BALB/c小鼠肝組織在燒杯中迅速用剪刀剪成直徑約1_2毫米的碎塊，然后加入組織8倍重量的勻漿緩沖液；將組織碎塊攪勻倒入玻璃勻漿器，勻漿至底部組織塊消失后再上下勻漿15次以上；勻漿液倒入離心管，50，OOOg離心60min，取上清加入 1/10 體積的 10XPBS(pH7. 5，200mM NaCl)，用于步驟 2 的 ConA-kpharose 層析。2>ConA-Sepharose MiiT載體為ConA-S印harose (購自GE公司，產(chǎn)品號17-0440-01)，按“ Iml載體/4g組織”計算使用量。層析柱的內徑和柱長是1. 6X2. 5cm。將上清用蠕動泵上樣，0. 25ml/min。在PBS (ρΗ7· 5，200mM NaCl)中加PMSF至終濃度ImM，作為洗脫液甲；用蠕動泵將10倍柱體積的洗脫液甲過層析柱(0. 5ml/min)，以去除未結合蛋白。在PBS (pH7. 5，200mM NaCl)中加α-D-卩比喃葡萄糖至終濃度10% (10g/mL)，加 PMSF至終濃度ImM，作為洗脫液乙；用蠕動泵將3倍柱體積的洗脫液乙過層析柱(0. 25ml/ min)，收集洗脫液。3、HiTrap-Q kpharose 離子交換層析載體為HiTrap-Q Sepharose (層析柱為HiTrap Q HP ；購自GE公司，產(chǎn)品號 17-1153-01)。層析柱的內徑和柱長是0. 7X2. 5cm。將載體裝柱后，先用5ml PBS (pH7. 5，200mM NaCl)清洗(lml/min)。將步驟2的洗脫液上樣(lml/min)；然后將5ml PBS (pH7. 5, 200mM NaCl)過層析柱(lml/min)，以去除未結合蛋白；然后將10ml PBS (pH7. 5，300mM NaCl)過層析柱(lml/min)，以去除未結合蛋白； 然后將:3ml PBS (pH7. 5，600mM NaCl)過層析柱(lml/min)，收集洗脫液，即為gp96提取物。將gp96提取物進行10% SDS-PAGE，然后考染，見圖3的泳道1。將gp96提取物進行westernblot，一抗為大鼠抗gp96抗體(購自santa cruz，產(chǎn)品號sc-56399)，見圖3的泳道2。除了小鼠肝臟，也可用如下組織中制備gp96提取物小鼠黑色素瘤(B16)、豬肝臟、人肝癌細胞系HepG2培養(yǎng)細胞、臨床手術切除的人腫瘤組織(乳腺癌、腦膠質瘤、腎癌、 腸癌、肝癌、胃癌)和人胎盤；提取方法參照小鼠肝臟的提取。實施例2、rgp96蛋白和gp96提取物免疫活性比較將BALB/c小鼠隨機分成四組，每組10只，分別進行如下免疫(免疫體積相等)第一組(HBc87_95)用HBc87_95 免疫小鼠，50 微克 / 次；第二組(HBc87-95+gp96)用實施例1的步驟三制備的gp96提取物和HBc87_95 — 起免疫小鼠，gp96提取物20微克/次，HBc87-9550微克/次；第三組(HBc87-95+rgp96)用實施例1的步驟二制備的rgp96蛋白和HBc87_95 — 起免疫小鼠，rgp96蛋白20微克/次，HBc87-9550微克/次；第四組(HBc87_95+IFA)用弗氏不完全佐劑和HBc87_95—起免疫小鼠，弗氏不完全佐劑20微克/次，HBc87-9550微克/次。在1、2、3周各免疫一次，在第4周，用流式細胞儀檢測T細胞活性(采用FITC標記的抗⑶8的抗體和PE標記的Pentamer)。流式細胞儀檢測結果見圖4(上)。⑶8和 Pentamer-PE雙陽性細胞即為HBc87_95肽特異性CD8+T細胞，計算其占CD8+T細胞的百分比，見圖4(下)。rgp96蛋白和gp96提取物免疫均可顯著提高T細胞反應，rgp96蛋白和 gp96提取物免疫引發(fā)的CLT沒有明顯區(qū)別(P >0.01)；第二組和第三組的乙肝特異性CTL 數(shù)量顯著高于第一組(P < 0. 01)，也高于第四組。
實施例3、攜帶有gp96基因的表達載體與gp96提取物的免疫活性比較將gp96蛋白的編碼序列插入表達載體pCDNA3. 1 (購自hvitrogen公司，產(chǎn)品編號V790-20) m EcoR I和Xho I酶切位點之間，得到重組質粒。將BALB/c小鼠隨機分成五組，每組10只，分別進行如下免疫(免疫體積相等)第一組用HBc87-95免疫小鼠，50微克/次；第二組用重組質粒和HBc87_95 —起免疫小鼠，重組質粒20微克/次， HBc87-9550 微克 / 次；第三組用重組質粒和HBc87_95 —起免疫小鼠，重組質粒50微克/次， HBc87-9550 微克 / 次；第四組用重組質粒和HBc87_95 —起免疫小鼠，重組質粒500微克/次， HBc87-9550 微克 / 次；第五組(HBc87-95+gp96)用實施例1的步驟三制備的gp96提取物和HBc87_95 — 起免疫小鼠，gp96提取物20微克/次，HBc87-9550微克/次。在1、2、3周各免疫一次，在第4周，用流式細胞儀檢測T細胞活性。重組質粒免疫可顯著提高T細胞反應，相對于第一組，乙肝特異性CTL數(shù)量有顯著升高(P <0.01)。重組質粒與gp96提取物免疫引發(fā)的CLT沒有明顯區(qū)別(P > 0. 01)。實施例4、rgp96蛋白或N355片段對免疫的雙向調節(jié)6-8周齡BALB/c小鼠分成五組，每組10只，分別免疫(免疫體積相等)如下第一組用實施例1的步驟二制備的rgp96蛋白和HBc87_95 —起免疫BALB/c小鼠，rgp96蛋白10微克/次，HBc87-9550微克/次；第二組用實施例1的步驟二制備的rgp96蛋白和HBc87_95 —起免疫BALB/c小鼠，rgp96蛋白100微克/次，HBc87-9550微克/次；第三組用實施例1的步驟一制備的N355片段和HBc87_95 —起免疫BALB/c小鼠，N355片段10微克/次，HBc87-9550微克/次；第四組用實施例1的步驟一制備的N355片段和HBc87_95 —起免疫BALB/c小鼠，N355片段100微克/次，HBc87-9550微克/次；第五組用HBc87_95免疫小鼠，50微克/次；第六組用HBc87-95免疫小鼠，50微克/次。在1、2、3周各免疫一次，在第4周，用流式細胞儀檢測T細胞活性(采用FITC標記的抗⑶8的抗體和Tetrame)，并進行ELISP0T檢測和Treg檢測。流式細胞儀檢測見圖5A， ⑶8陽性細胞占脾細胞的比例見圖5B，Tetrame陽性細胞占⑶8陽性細胞的比例見圖5C。 ELISP0T檢測結果見圖6。Treg檢測結果見圖7。rgp96蛋白或N355片段免疫可顯著提高T細胞反應；相對于第五組和第六組，總T細胞和乙肝特異性CTL數(shù)量有顯著升高(P < 0. 01)； rgp96蛋白或N355片段免疫可顯著提高乙肝病毒特異性CTL細胞活性(P < 0. 01)；高劑量免疫對病毒特異性T細胞和總T細胞的激活明顯低于低劑量組。rgp96明顯提高Treg 的數(shù)量，與對照相比，rgp96低劑量免疫或高劑量免疫Treg分別增加了 13. 86%或26. 70% (P < 0. 05或0. 01)，N355低劑量免疫和高劑量免疫Treg分別增加了 8. 77%或12. 54%, (P < 0. 05)。免疫對小鼠Treg活性的促進見圖8，包括對⑶4+和⑶8+T細胞生長的抑制 (P < 0. 05或0. 01)和分泌IFN- γ的抑制(P < 0. 05或0. 01)功能明顯增強。相關性分析發(fā)現(xiàn)rgp96蛋白或N355片段免疫的小鼠中Treg與T細胞呈負相關(見圖9)，Treg與總 CD8+T 細胞(r = 0. 84，P < 0. 01)、乙肝特異性 CTL (r = 0. 94，P < 0. 01)和分泌 IFN- γ 的 ⑶8+Τ細胞(r = 0. 79，P < 0. 01)均呈顯著負相關。綜上所述，rgp96蛋白或N355片段的免疫調控機制如下(1)通過抗原呈遞激活CTL ； (2)激活Treg，Treg反過來又抑制CTL活性。因此gp96蛋白(或其片段)對乙肝T細胞免疫有雙向調節(jié)功能，如何控制平衡點對于提高gp96免疫活性有重要意義。實施例5、免疫調節(jié)劑對rgp96蛋白或N355片段免疫活性的促進作用一、環(huán)磷酰胺對rgp96蛋白或N355片段的免疫活性的促進作用1、高劑量免疫6-8周齡BALB/c小鼠分成六組，每組10只，分別免疫(體積相等)如下第一組用實施例1的步驟二制備的rgp96蛋白和HBc87_95 —起免疫BALB/c小鼠，rgp96蛋白100微克/次，HBc87-9550微克/次；第二組用實施例1的步驟二制備的rgp96蛋白、HBc87_95和環(huán)磷酰胺一起免疫 BALB/c小鼠，rgp96蛋白100微克/次，HBc87-9550微克/次，環(huán)磷酰胺0. 4毫克/次；第三組用實施例1的步驟一制備的N355片段和HBc87_95 —起免疫BALB/c小鼠，N355片段100微克/次，HBc87-9550微克/次；第四組用實施例1的步驟一制備的N355片段、HBc87_95和環(huán)磷酰胺一起免疫 BALB/c小鼠，N355片段100微克/次，HBc87_9550微克/次，環(huán)磷酰胺0. 4毫克/次；第五組用HBc87-95 免疫 BALB/c 小鼠，HBc87_9550 微克 / 次；第六組用HBc87-95和環(huán)磷酰胺一起免疫BALB/c小鼠，HBc87_9550微克/次，環(huán)
磷酰胺0. 4毫克/次。在1、2、3周各免疫一次，第4周用流式細胞儀檢測(采用PE標記的抗⑶25的抗體和APC標記的抗R)xP3的抗體)。結果見圖10 ；A為流式細胞儀檢測結果；B為環(huán)磷酰胺對Treg的數(shù)量的抑制作用(⑶25和R)xP3雙陽性細胞占⑶4陽性細胞的百分比)；C為環(huán)磷酰胺對CD8+細胞數(shù)量的促進作用(CD8陽性細胞占脾細胞的百分比)；D為環(huán)磷酰胺對乙肝特異性T細胞數(shù)量的促進作用(Tetrame陽性細胞占CD8陽性細胞的百分比)；E為環(huán)磷酰胺對分泌IFN-γ的T細胞數(shù)量的促進作用(IFN-Y陽性細胞占CD8陽性細胞的百分比)；1為第一組，2為第二組，3為第三組，4為第四組，5為第五組，6為第六組。環(huán)磷酰胺可以有效去除HBc87-95和高劑量rgp96蛋白(或N355片段)誘導產(chǎn)生的Treg，T細胞數(shù)量、 乙肝特異性T細胞和分泌IFN- γ的T細胞數(shù)量有明顯提高，聯(lián)合使用環(huán)磷酰胺可使總T細胞、乙肝特異性T細胞和分泌IFN-Y的T細胞數(shù)量分別增長21. 72%,52. 99%和63. 88% (P < 0. 05 或 0. 01)。2、低劑量免疫 6-8周齡BALB/c小鼠分成六組，每組10只，分別免疫(體積相等)如下第一組用實施例1的步驟二制備的rgp96蛋白和HBc87_95 —起免疫BALB/c小鼠，rgp96蛋白10微克/次，HBc87-9550微克/次；第二組用實施例1的步驟二制備的rgp96蛋白、HBc87_95和環(huán)磷酰胺一起免疫 BALB/c小鼠，rgp96蛋白10微克/次，HBc87-9550微克/次，環(huán)磷酰胺0. 4毫克/次；第三組用實施例1的步驟一制備的N355片段和HBc87_95 —起免疫BALB/c小
13鼠，N355片段10微克/次，HBc87-9550微克/次；第四組用實施例1的步驟一制備的N355片段、HBc87_95和環(huán)磷酰胺一起免疫 BALB/c小鼠，N355片段10微克/次，HBc87-9550微克/次，環(huán)磷酰胺0. 4毫克/次；第五組用HBc87_95 免疫 BALB/c 小鼠，HBc87_9550 微克 / 次；第六組用HBc87_95和環(huán)磷酰胺一起免疫BALB/c小鼠，HBc87_9550微克/次，環(huán)
磷酰胺0. 4毫克/次。在1、2、3周各免疫一次。第4周用流式細胞儀檢測。結果見圖11 ；A為環(huán)磷酰胺對CD8+細胞數(shù)量的促進作用(CD8陽性細胞占脾細胞的百分比)；B為環(huán)磷酰胺對乙肝特異性T細胞數(shù)量的促進作用(Tetrame陽性細胞占CD8陽性細胞的百分比)；C為環(huán)磷酰胺的分泌IFN-γ的T細胞數(shù)量的促進作用(IFN-Y陽性細胞占⑶8陽性細胞的百分比)；1為第一組，2為第二組，3為第三組，4為第四組，5為第五組，6為第六組。環(huán)磷酰胺可以有效去除HBc87-95和低劑量rgp96蛋白(或N355片段)誘導產(chǎn)生的Treg，T細胞數(shù)量、乙肝特異性T細胞和分泌IFN- γ的T細胞數(shù)量有明顯提高(P < 0. 05)。rgp96蛋白(或N355片段)和環(huán)磷酰胺混合使用，能有效提高rgp96蛋白(或N355片段)對T細胞的活化能力(P < 0. 05 或 0. 01)。二、抗⑶25的抗體對rgp96蛋白或N355片段的免疫活性的促進作用6-8周齡BALB/c小鼠分成九組，每組10只，分別免疫(體積相等)如下第一組用實施例1的步驟二制備的rgp96蛋白和HBc87_95 —起免疫BALB/c小鼠，rgp96蛋白10微克/次，HBc87-9550微克/次；第二組用實施例1的步驟二制備的rgp96蛋白、HBc87_95和抗⑶25的抗體一起免疫BALB/c小鼠，rgp96蛋白10微克/次，HBc87-9550微克/次，抗CD25的抗體30微克 /次；第三組用實施例1的步驟一制備的N355片段和HBc87_95 —起免疫BALB/c小鼠，N355片段10微克/次，HBc87-9550微克/次；第四組用實施例1的步驟一制備的N355片段、HBc87_95和抗⑶25的抗體一起免疫BALB/c小鼠，N355片段10微克/次，HBc87_9550微克/次，抗CD25的抗體30微克/ 次；第五組用實施例1的步驟二制備的rgp96蛋白和HBc87_95 —起免疫BALB/c小鼠，rgp96蛋白100微克/次，HBc87-9550微克/次；第六組用實施例1的步驟二制備的rgp96蛋白、HBc87_95和抗⑶25的抗體一起免疫BALB/c小鼠，rgp96蛋白100微克/次，HBc87_9550微克/次，抗CD25的抗體30微克 /次；第七組用實施例1的步驟一制備的N355片段和HBc87_95 —起免疫BALB/c小鼠，N355片段100微克/次，HBc87-9550微克/次；第八組用實施例1的步驟一制備的N355片段、HBc87_95和抗⑶25的抗體一起免疫BALB/c小鼠，N355片段100微克/次，HBc87-9550微克/次，抗CD25的抗體30微克 /次；第九組用HBc87_95 免疫 BALB/c 小鼠，HBc87_9550 微克 / 次。在1、2、3周各免疫一次；第4周用流式細胞儀檢測(采用PE標記的抗⑶25的抗體和FITC標記的抗CD4的抗體)?？耿?5的抗體可以有效去除HBc87_95和高劑量rgp96 蛋白(或N355片段)誘導產(chǎn)生的Treg，T細胞數(shù)量、乙肝特異性T細胞和分泌IFN-γ的 T細胞數(shù)量有明顯提高；聯(lián)合使用抗CD25的抗體可使總T細胞、乙肝特異性T細胞和分泌 IFN-Y的T細胞數(shù)量分別增長31. 52%，63. 79%和75. 75% (P < 0. 05或0. 01)。使用抗 CD25的抗體有效去除HBc87-95和低劑量rgp96蛋白(或N355片段)誘導產(chǎn)生的Treg，T 細胞數(shù)量、乙肝特異性T細胞和分泌IFN- γ的T細胞數(shù)量有明顯提高(P < 0. 05) ；rgp96 蛋白(或N355片段)和抗⑶25的抗體混合使用，能有效提高rgp96蛋白(或N355片段) 對T細胞的活化能力(P < 0. 05或0. 01)。第一組和第二組的結果見圖12 ；A為流式細胞儀檢測結果，B為抗CD25的抗體對Treg的數(shù)量的抑制作用(CD25陽性細胞占CD4陽性細胞的百分比)。⑶25抗體處理可明顯清除Treg，使Treg數(shù)量降低了 9. 2倍，差異極顯著(P < 0. 01)。三、FoxP3的干擾RNA對gp96蛋白免疫活性的促進作用6-8周齡BALB/c小鼠分成九組，每組10只，分別免疫(體積相等)如下第一組用實施例1的步驟二制備的rgp96蛋白和HBc87_95 —起免疫BALB/c小鼠，rgp96蛋白10微克/次，HBc87-9550微克/次；第二組用實施例1的步驟二制備的rgp96蛋白、HBc87_95和R)xP3的干擾RNA 一起免疫BALB/c小鼠，rgp96蛋白10微克/次，HBc87_95 50微克/次，F(xiàn)oxP3的干擾RNA 500微克/次；第三組用實施例1的步驟一制備的N355片段和HBc87_95 —起免疫BALB/c小鼠，N355片段10微克/次，HBc87-9550微克/次；第四組用實施例1的步驟一制備的N355片段、HBc87_95和R)XP3的干擾RNA — 起免疫BALB/c小鼠，N355片段10微克/次，HBc87_9550微克/次，F(xiàn)oxP3的干擾RNA 500 微克/次；第五組用實施例1的步驟二制備的rgp96蛋白和HBc87_95 —起免疫BALB/c小鼠，rgp96蛋白100微克/次，HBc87-9550微克/次；第六組用實施例1的步驟二制備的rgp96蛋白、HBc87_95和R)xP3的干擾RNA 一起免疫BALB/c小鼠，rgp96蛋白100微克/次，HBc87_9550微克/次，F(xiàn)oxP3的干擾RNA 500微克/次；第七組用實施例1的步驟一制備的N355片段和HBc87_95 —起免疫BALB/c小鼠，N355片段100微克/次，HBc87-9550微克/次；第八組用實施例1的步驟一制備的N355片段、HBc87_95和R)xP3的干擾RNA — 起免疫BALB/c小鼠，N355片段100微克/次，HBc87_9550微克/次，F(xiàn)oxP3的干擾RNA 500 微克/次；第九組用HBc87-95 免疫 BALB/c 小鼠，HBc87_9550 微克 / 次。在1、2、3周各免疫一次；第4周用流式細胞儀檢測(采用PE標記的抗⑶25的抗體和APC標記的抗R)xP3的抗體)。FoxP3的干擾RNA可以有效去除HBc87_95和高劑量 rgp96蛋白(或N355片段)誘導產(chǎn)生的Treg，T細胞數(shù)量、乙肝特異性T細胞和分泌IFN-γ 的T細胞數(shù)量有明顯提高；聯(lián)合使用R)xP3的干擾RNA可使總T細胞、乙肝特異性T細胞和分泌IFN-Y的T細胞數(shù)量分別增長11. 63%,42. 67%和55. 57% (P < 0. 05或0. 01)。使用R)xP3的干擾RNA有效去除HBc87-95和低劑量rgp96蛋白(或N355片段)誘導產(chǎn)生的 Treg，T細胞數(shù)量、乙肝特異性T細胞和分泌IFN-γ的T細胞數(shù)量有明顯提高(P < 0. 05)； rgp96蛋白(或N355片段)和R)xP3的干擾RNA混合使用，能有效提高rgp96蛋白(或N355 片段)對T細胞的活化能力(P < 0. 05或0. 01)。第一組和第二組的結果見圖13 ；A為流式細胞儀檢測結果，B為R)xP3的干擾RNA對Treg的數(shù)量的抑制作用。FoxP3的干擾RNA處理可明顯清除Treg，抑制Treg的數(shù)量，使Treg數(shù)量降低了 7. 5倍，差異極顯著(P < 0. 01)。實施例6、乙肝蛋白疫苗的制備和效果評價一、乙肝蛋白疫苗甲的組成和效果評價1、乙肝蛋白疫苗甲的組成乙肝蛋白疫苗甲由實施例1的步驟二制備的rgp96蛋白、乙肝表面抗原(HBsAg)、 乙肝核心蛋白(HBcAg)和環(huán)磷酰胺組成，各組分單獨包裝。2、乙肝蛋白疫苗甲的效果評價(1)疫苗前體的制備將實施例1的步驟二制備的rgp96蛋白、乙肝表面抗原(HBsAg)和乙肝核心蛋白(HBcAg)進行體外組裝，得到疫苗前體。組裝體系的溶劑為水，溶質及其濃度如下20mM HEPES (pH7. 2), 20mM NaCl,2mM MgCl2, IOOmM KCl, ImM PMSF, 2ug/ul rgp96 蛋白，lug/ul HBsAg，lug/ulHBcAg ；組裝條件45°C 10 分鐘(也可采用 45°C 10-30 分鐘，或 4°C 30-120 分鐘)。穩(wěn)定性-80°C保存，6個月后SDS凝膠電泳未見明顯降解或形成多聚物。(2)分組給藥8周齡HBV轉基因鼠分成兩組，每組10只，分別免疫(體積相等)如下第一組10微升疫苗前體和0. 4毫克環(huán)磷酰胺混合，作為單次免疫劑量；第二組每次免疫10微升疫苗前體。在1、2、3周各免疫一次；8周后檢測小鼠血清中HBsiVg含量和肝臟細胞中HBcAg的表達。血清中HBsAg含量采用ELISA檢測(乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒，購自上?？迫A生物工程股份有限公司)。肝臟細胞中HBcAg的表達比例采用免疫組化檢測(抗體為 HBcAg兔多抗，購自北京康為世紀公司，產(chǎn)品號CWP196)。第一組小鼠血清中HBsAg含量(0D 值0.66士0.13)明顯小于第二組小鼠(1.21 士0.23)，二者差異達到顯著水平(P < 0. 05)。 第一組小鼠肝細胞中HBcAg的表達比例(9% 士2)明顯小于第二組小鼠(20% 士3)，二者差異達到顯著水平(P < 0. 05)。說明本發(fā)明的疫苗中，由于添加了環(huán)磷酰胺，對乙肝病毒復制的抑制作用顯著提高。二、乙肝蛋白疫苗乙的組成和效果評價1、乙肝蛋白疫苗乙的組成乙肝蛋白疫苗乙由實施例1的步驟二制備的rgp96蛋白、乙肝表面抗原(HBsAg)、 乙肝核心蛋白(HBcAg)和抗⑶25的抗體組成，各組分單獨包裝。2、乙肝蛋白疫苗乙的效果評價(1)疫苗前體的制備同步驟一的2的(1)。(2)分組給藥
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8周齡HBV轉基因鼠分成兩組，每組10只，分別免疫(體積相等)如下第一組10微升疫苗前體和30微克抗⑶25的抗體混合，作為單次免疫劑量；第二組每次免疫10微升疫苗前體。在1、2、3周各免疫一次；8周后檢測小鼠血清中HBsiVg含量和肝臟細胞中HBcAg的表達。血清中HBsiVg含量和肝臟細胞中HBcAg的表達比例的檢測方法同步驟一的2的⑵。 第一組小鼠血清中HBsAg含量(0D值0.60士0. 11)明顯小于第二組小鼠(1.30士0.25)，二者差異達到極顯著水平(P < 0. 01)。第一組小鼠肝細胞中HBcAg的表達比例(8% 士3)明顯小于第二組小鼠(18% 士幻，二者差異達到顯著水平(P<0. 05)。說明本發(fā)明的疫苗中， 由于添加了 CD25抗體，對乙肝病毒復制的抑制作用顯著提高。三、乙肝蛋白疫苗丙的組成和效果評價1、乙肝蛋白疫苗丙的組成乙肝蛋白疫苗丙由實施例1的步驟二制備的rgp96蛋白、乙肝表面抗原(HBsAg)、 乙肝核心蛋白(HBcAg)和R)xP3的干擾RNA組成，各組分單獨包裝。2、乙肝蛋白疫苗丙的效果評價(1)疫苗前體的制備同步驟一的2的(1)。(2)分組給藥8周齡HBV轉基因鼠分成兩組，每組10只，分別免疫(體積相等)如下第一組10微升疫苗前體和500微克R)xP3的干擾RNA混合，作為單次免疫劑量；第二組每次免疫10微升疫苗前體。在1、2、3周各免疫一次；8周后檢測小鼠血清中HBsiVg含量和肝臟細胞中HBcAg的表達。血清中HBsiVg含量和肝臟細胞中HBcAg的表達比例的檢測方法同步驟一的2的⑵。 第一組小鼠血清中HBsAg含量(0D值0.80士0. 11)明顯小于第二組小鼠(1.30士0.25)，二者差異達到極顯著水平(P < 0. 01)。第一組小鼠肝細胞中HBcAg的表達比例(10% 士3) 明顯小于第二組小鼠(18% 士幻，二者差異達到顯著水平(P <0.05)。說明本發(fā)明的疫苗中，由于添加了 FoxP3的干擾RNA，對乙肝病毒復制的抑制作用顯著提高。四、乙肝蛋白疫苗丁的組成和效果評價1、乙肝蛋白疫苗丁的組成乙肝蛋白疫苗丁由實施例1的步驟二制備的rgp96蛋白、乙肝表面抗原(HBsAg)、 乙肝核心蛋白(HBcAg)、環(huán)磷酰胺和抗⑶25的抗體組成，各組分單獨包裝。2、乙肝蛋白疫苗丁的效果評價(1)疫苗前體的制備同步驟一的2的(1)。(2)分組給藥8周齡HBV轉基因鼠分成兩組，每組10只，分別免疫(體積相等)如下第一組10微升疫苗前體、0. 4毫克環(huán)磷酰胺和30微克抗⑶25的抗體混合，作為單次免疫劑量；第二組每次免疫10微升疫苗前體。在1、2、3周各免疫一次；8周后檢測小鼠血清中HBsiVg含量和肝臟細胞中HBcAg的表達。血清中HBsiVg含量和肝臟細胞中HBcAg的表達比例的檢測方法同步驟一的2的(2)。第一組小鼠血清中HBsAg含量(0D值0. 46 士 0. 14)明顯小于第二組小鼠 (1. 25士0. 20)，二者差異達到顯著水平(P < 0. 05)。第一組小鼠肝細胞中HBcAg的表達比例(5% 士2)明顯小于第二組小鼠(20% 士2)，二者差異達到顯著水平(P <0.05)。說明本發(fā)明的疫苗中，由于添加了環(huán)磷酰胺和抗CD25的抗體，對乙肝病毒復制的抑制作用顯著提高。與未附加免疫調節(jié)劑進行給藥的HBV轉基因鼠相比，上述四種疫苗均引起HBV轉基因鼠血清中的HBsAg抗原降低50%以上，肝臟細胞中病毒清除70-80%以上(HBcAg轉陰)， 差異均達到極顯著(P <0.01)。以上研究表明本發(fā)明的疫苗有良好的抗HBV活性。實施例7、乙肝表位疫苗的組成和效果評價
一、乙肝表位疫苗甲的組成和效果評價1、乙肝表位疫苗甲的組成乙肝表位疫苗甲由實施例1的步驟二制備的rgp96蛋白、乙肝表面抗原表位 362-371、乙肝核心蛋白表位87-95、乙肝聚合酶表位140-148和環(huán)磷酰胺組成，各組分單獨包裝。2、乙肝表位疫苗甲的效果評價(1)疫苗前體的制備將實施例1的步驟二制備的rgp96蛋白、乙肝表面抗原表位362-371、乙肝核心蛋白表位87-95和乙肝聚合酶表位140-148進行體外組裝，得到乙肝蛋白疫苗前體。組裝體系的溶劑為水，溶質及其濃度如下20mM HEPES (pH7. 2), 20mM NaCl,2mM MgCl2, IOOmM KCl, ImMPMSF, 2ug/ul rgp96蛋白，上述三種表位各:3ug/ul ；組裝條件45°C 10分鐘(也可采用 45 0C 10-30 分鐘，或 4°C 30-120 分鐘)。穩(wěn)定性-80°C保存，6個月后SDS凝膠電泳未見明顯降解或形成多聚物。(2)分組給藥8周齡HBV轉基因鼠分成兩組，每組10只，分別免疫(體積相等)如下第一組10微升疫苗前體和0. 4毫克環(huán)磷酰胺混合，作為單次免疫劑量；第二組每次免疫10微升疫苗前體。在1、2、3周各免疫一次；8周后檢測小鼠血清中HBsAg含量和肝臟細胞中HBcAg 的表達。血清中HBsAg含量和肝臟細胞中HBcAg的表達比例的檢測方法同實施例6的步驟一的2的O)。第一組小鼠血清中HBsAg含量(0D值0.62 士 0. 11)明顯小于第二組小鼠 (1. 11 士0.20)，二者差異達到顯著水平(P <0.05)。第一組小鼠肝細胞中HBcAg的表達比例(8% 士2)明顯小于第二組小鼠(19% 士2)，二者差異達到顯著水平(P <0.05)。說明本發(fā)明的疫苗中，由于添加了環(huán)磷酰胺，對乙肝病毒復制的抑制作用顯著提高。二、乙肝表位疫苗乙的組成和效果評價1、乙肝表位疫苗乙的組成乙肝表位疫苗乙由實施例1的步驟二制備的rgp96蛋白、乙肝表面抗原表位 362-371、乙肝核心蛋白表位87-95、乙肝聚合酶表位140-148和抗CD25的抗體組成，各組分單獨包裝。2、乙肝表位疫苗乙的效果評價(1)疫苗前體的制備
同步驟一的2的(1)。(2)分組給藥8周齡HBV轉基因鼠分成兩組，每組10只，分別免疫(體積相等)如下第一組10微升疫苗前體和30微克抗⑶25的抗體混合，作為單次免疫劑量；第二組每次免疫10微升疫苗前體。在1、2、3周各免疫一次；8周后檢測小鼠血清中HBsAg含量和肝臟細胞中HBcAg 的表達。血清中HBsAg含量和肝臟細胞中HBcAg的表達比例的檢測方法同實施例6的步驟一的2的(2)。第一組小鼠血清中HBsAg含量(0D值0.09)明顯小于第二組小鼠 (1. 19士0. 18)，二者差異達到極顯著水平(P < 0. 01)。第一組小鼠肝細胞中HBcAg的表達比例(7% 士3)明顯小于第二組小鼠(17% 士2)，二者差異達到顯著水平(P <0.05)。說明本發(fā)明的疫苗中，由于添加了 CD25抗體，對乙肝病毒復制的抑制作用顯著提高。三、乙肝表位疫苗丙的組成和效果評價1、乙肝表位疫苗丙的組成乙肝表位疫苗丙由實施例1的步驟二制備的rgp96蛋白、乙肝表面抗原表位 362-371、乙肝核心蛋白表位87-95、乙肝聚合酶表位140-148和R)xP3的干擾RNA組成，各組分單獨包裝。2、乙肝表位疫苗丙的效果評價(1)疫苗前體的制備同步驟一的2的(1)。(2)分組給藥8周齡HBV轉基因鼠分成兩組，每組10只，分別免疫(體積相等)如下第一組10微升疫苗前體和500微克R)xP3的干擾RNA混合，作為單次免疫劑量；第二組每次免疫10微升疫苗前體。在1、2、3周各免疫一次；8周后檢測小鼠血清中HBsAg含量和肝臟細胞中HBcAg 的表達。血清中HBsAg含量和肝臟細胞中HBcAg的表達比例的檢測方法同實施例6的步驟一的2的O)。第一組小鼠血清中HBsAg含量(0D值0.90 士 0.08)明顯小于第二組小鼠 (1. 30士0. 25)，二者差異達到極顯著水平(P < 0. 01)。第一組小鼠肝細胞中HBcAg的表達比例(12% 士3)明顯小于第二組小鼠(18% 士3)，二者差異達到顯著水平(P <0.05)。說明本發(fā)明的疫苗中，由于添加了 FoxP3的干擾RNA，對乙肝病毒復制的抑制作用顯著提高。四、乙肝表位疫苗丁的組成和效果評價
1、乙肝表位疫苗丁的組成乙肝表位疫苗丁由實施例1的步驟二制備的rgp96蛋白、乙肝表面抗原表位 362-371、乙肝核心蛋白表位87-95、乙肝聚合酶表位140-148、環(huán)磷酰胺和抗⑶25的抗體組成，各組分單獨包裝。2、乙肝蛋白疫苗丁的效果評價(1)疫苗前體的制備同步驟一的2的(1)。(2)分組給藥8周齡HBV轉基因鼠分成兩組，每組10只，分別免疫(體積相等)如下
第一組10微升疫苗前體、0. 4毫克環(huán)磷酰胺和30微克抗⑶25的抗體混合，作為單次免疫劑量；第二組每次免疫10微升疫苗前體。在1、2、3周各免疫一次；8周后檢測小鼠血清中HBsAg含量和肝臟細胞中HBcAg 的表達。血清中HBsAg含量和肝臟細胞中HBcAg的表達比例的檢測方法同實施例6的步驟一的2的O)。第一組小鼠血清中HBsAg含量(0D值0.41 士 0. 13)明顯小于第二組小鼠 (1. 02士0. 19)，二者差異達到顯著水平(P < 0. 05)。第一組小鼠肝細胞中HBcAg的表達比例(5% 士2)明顯小于第二組小鼠(19% 士3)，二者差異達到顯著水平(P <0.05)。說明本發(fā)明的疫苗中，由于添加了環(huán)磷酰胺和抗CD25的抗體，對乙肝病毒復制的抑制作用顯著提尚。與未附加免疫調節(jié)劑進行給藥的HBV轉基因鼠相比，上述四種疫苗均引起HBV轉基因鼠血清中的HBsAg抗原降低60%以上，肝臟細胞中病毒清除80-90%以上(HBcAg轉陰)，差異均達到極顯著(P<0.01)。以上研究表明本發(fā)明的疫苗有良好的抗HBV活性。實施例8、黑色素瘤疫苗的組成和效果評價一、gp96提取物的制備用黑色素瘤細胞B16(購自ATCC，產(chǎn)品號CRL-6470制備gp96提取物，方法如下1、組織勻漿培養(yǎng)黑色素瘤細胞B16，收集細胞，加入組織8倍重量的勻漿緩沖液；將組織碎塊攪勻倒入玻璃勻漿器，勻漿至底部組織塊消失后再上下勻漿15次以上；勻漿液倒入離心管，50，OOOg離心60min，取上清加入1/10體積的10XPBS(pH7. 5,200mM NaCl)，用于步驟2 的 ConA-Sepharose 層析。2>ConA-Sepharose MiiT同實施例1的步驟三的2。3、HiTrap-Q kpharose 離子交換層析同實施例1的步驟三的3。二、黑色素瘤疫苗的組成黑色素瘤疫苗甲由步驟一制備的gp96提取物和環(huán)磷酰胺組成，各組分單獨包裝。黑色素瘤疫苗乙由步驟一制備的gp96提取物和抗⑶25的抗體組成，各組分單獨包裝。黑色素瘤疫苗丙由步驟一制備的gp96提取物和R)xP3的干擾RNA組成，各組分單獨包裝。三、分組免疫C57BL/6J小鼠(6_8周齡，購自北京維通利華公司，品系C57BL/6J))分成四組，每組10只，分別免疫(體積相等)如下第一組每只皮下注射5X IO4個黑色素瘤細胞B16 ；10天后開始免疫，每次同時免疫黑色素瘤疫苗甲的兩個組分，gp96提取物20微克/次，環(huán)磷酰胺0. 4毫克/次，每隔3天免疫一次，共免疫5次；最后一次免疫2天后稱量腫瘤重量。第二組每只皮下注射5X IO4個黑色素瘤細胞B16 ；10天后開始免疫，每次同時免疫黑色素瘤疫苗乙的兩個組分，gp96提取物20微克/次，抗⑶25的抗體30微克/次，每隔3天免疫一次，共免疫5次；最后一次免疫2天后稱量腫瘤重量。第三組每只皮下注射5X IO4個黑色素瘤細胞B16 ；10天后開始免疫，每次同時免疫黑色素瘤疫苗丙的兩個組分，gp96提取物20微克/次，F(xiàn)oxP3的干擾RNA 500微克/次， 每隔3天免疫一次，共免疫5次；最后一次免疫2天后稱量腫瘤重量。第四組每只皮下注射5 X IO4個黑色素瘤細胞B16 ； 10天后開始免疫，每次免疫步驟一制備的gp96提取物20微克/次，每隔3天免疫一次，共免疫5次；最后一次免疫2天后稱量腫瘤重量。第一組小鼠腫瘤重量為0.92g士 0. 17，第二組小鼠腫瘤重量為0. 62g士 0. 15，第三組小鼠腫瘤重量為1. 25g士0. 27，均明顯小于第四組小鼠腫瘤重量(3. 12g士0. 35)，三個疫苗處理組與第四組差異均達到極顯著水平(P < 0. 01)。注射黑色素瘤細胞B16開始計時，45天后統(tǒng)計各組小鼠的存活率。第一組小鼠的存活率為45%，第二組小鼠的存活率為45%，第三組小鼠的存活率為45%，第四組小鼠的存活率只有15%，三個疫苗處理組與第四組比較均具有顯著差異(P < 0. 05)。說明注射環(huán)磷酰胺、抗CD25的抗體或R)xP3的干擾RNA均能顯著提高gp96提取物對腫瘤抑制效果。
權利要求
1.免疫調節(jié)劑在提高gp96蛋白相關物質的免疫活性中的應用；所述免疫調節(jié)劑為環(huán)磷酰胺、抗⑶25的抗體和R)xp3的干擾RNA中的至少一種；所述gp96蛋白相關物質為序列表的序列1所示的gp96蛋白、序列表的序列1自氨基末端第1至355位氨基酸殘基所示的 N355片段或含有gp96蛋白的提取物；所述R)xp3的干擾RNA如序列表的序列5所示。
2.如權利要求1所述應用，其特征在于所述含有gp96蛋白的提取物是將離體動物組織或離體腫瘤組織或離體腫瘤細胞的勻漿液依次進行ConA-S^harose層析和HiTrap-Q Sepharose離子交換層析得到的；所述離體動物組織為離體小鼠肝臟、離體豬肝臟或離體人胎盤；所述腫瘤組織為乳腺癌、腦膠質瘤、腎癌、腸癌、肝癌或胃癌；所述腫瘤細胞為人肝癌細胞!fepG2或黑色素瘤細胞B16 ；所述ConA-S^harose層析包括如下步驟(1)將所述勻漿液上樣于層析柱，流速為0.25ml/min ；(2)用10倍層析柱柱體積的洗脫液甲洗滌步驟(1)的層析柱，流速為0.5ml/min ；所述洗脫液甲的制備方法為在NaCl濃度為200mM pH7. 5的PBS中加苯甲基磺酰氟至終濃度為 ImM ；(3)用3倍層析柱柱體積的洗脫液乙洗滌步驟(2)的層析柱，流速為0.25ml/min，收集洗脫液，即為洗脫液丙；所述洗脫液乙的制備方法為在NaCl濃度為200mM pH7.5的PBS中力口 α -D-吡喃葡萄糖至終濃度為10g/mL，加苯甲基磺酰氟至終濃度為ImM ；所述HiTrap-Q Sepharose離子交換層析包括如下步驟(a)將所述洗脫液丙上樣于層析柱，流速為lml/min；(b)用5mlNaCl濃度為200mM pH7. 5的PBS洗滌步驟(a)的層析柱，流速為lml/min ；(c)用IOmlNaCl濃度為300mM pH7. 5的PBS洗滌步驟(b)的層析柱，流速為lml/min ；(d)用:3mlNaCl濃度為600mM pH7. 5的PBS洗滌步驟(c)的層析柱，流速為lml/min， 得到的洗脫液即為含有gp96蛋白的提取物。
3.一種疫苗佐劑，為如下(a)或(b)或(c)(a)由免疫調節(jié)劑和N355片段組成的疫苗佐劑；所述免疫調節(jié)劑為環(huán)磷酰胺、抗CD25 的抗體和Γ^οχρβ的干擾RNA中的至少一種；所述R)xp3的干擾RNA如序列表的序列5所示； 所述N355片段序列表的序列1自氨基末端第1至355位氨基酸殘基所示；(b)由免疫調節(jié)劑和gp96蛋白組成的疫苗佐劑；所述免疫調節(jié)劑為環(huán)磷酰胺、抗CD25 的抗體和你即3的干擾RNA中的至少一種；所述gp96蛋白如序列表的序列1所示；所述 Foxp3的干擾RNA如序列表的序列5所示；(c)由免疫調節(jié)劑和含有gp96蛋白的提取物組成的疫苗佐劑；所述免疫調節(jié)劑為環(huán)磷酰胺、抗⑶25的抗體和R)xp3的干擾RNA中的至少一種；所述R)xp3的干擾RNA如序列表的序列5所示。
4.一種乙肝疫苗，由gp96蛋白相關物質、乙肝表面抗原、乙肝核心蛋白和免疫調節(jié)劑組成；所述免疫調節(jié)劑為環(huán)磷酰胺、抗⑶25的抗體和R)xp3的干擾RNA中的至少一種；所述gp96蛋白相關物質為序列表的序列1所示的gp96蛋白、序列表的序列1自氨基末端第 1至355位氨基酸殘基所示的N355片段或含有gp96蛋白的提取物；所述R)Xp3的干擾RNA 如序列表的序列5所示。
5.一種抑制乙肝病毒的疫苗，由gp96蛋白相關物質、乙肝表面抗原、乙肝核心蛋白和免疫調節(jié)劑組成；所述免疫調節(jié)劑為環(huán)磷酰胺、抗CD25的抗體和R)Xp3的干擾RNA中的至少一種；所述gp96蛋白相關物質為序列表的序列1所示的gp96蛋白、序列表的序列1自氨基末端第1至355位氨基酸殘基所示的N355片段或含有gp96蛋白的提取物；所述R)xp3 的干擾RNA如序列表的序列5所示。
6.一種乙肝疫苗，由gp96蛋白相關物質、乙肝表面抗原表位362-371、乙肝核心蛋白表位87-95、乙肝聚合酶表位140-148和免疫調節(jié)劑組成；所述免疫調節(jié)劑為環(huán)磷酰胺、抗 ⑶25的抗體和R)xp3的干擾RNA中的至少一種；所述gp96蛋白相關物質為序列表的序列1 所示的gp96蛋白、序列表的序列1自氨基末端第1至355位氨基酸殘基所示的N355片段或含有gp96蛋白的提取物；所述R)xp3的干擾RNA如序列表的序列5所示；所述乙肝表面抗原表位362-371如序列表的序列6所示；所述乙肝核心蛋白表位87-95如序列表的序列 7所示；所述乙肝聚合酶表位140-148如序列表的序列8所示。
7.一種抑制乙肝病毒的疫苗，由gp96蛋白相關物質、乙肝表面抗原表位362-371、乙肝核心蛋白表位87-95、乙肝聚合酶表位140-148和免疫調節(jié)劑組成；所述免疫調節(jié)劑為環(huán)磷酰胺、抗⑶25的抗體和R)xp3的干擾RNA中的至少一種；所述gp96蛋白相關物質為序列表的序列1所示的gp96蛋白、序列表的序列1自氨基末端第1至355位氨基酸殘基所示的 N355片段或含有gp96蛋白的提取物；所述R)xp3的干擾RNA如序列表的序列5所示；所述乙肝表面抗原表位362-371如序列表的序列6所示；所述乙肝核心蛋白表位87-95如序列表的序列7所示；所述乙肝聚合酶表位140-148如序列表的序列8所示。
8.—種黑色素瘤疫苗，由gp96蛋白相關物質和免疫調節(jié)劑組成；所述免疫調節(jié)劑為環(huán)磷酰胺、抗⑶25的抗體和R)xp3的干擾RNA中的至少一種；所述gp96蛋白相關物質為序列表的序列1所示的gp96蛋白、序列表的序列1自氨基末端第1至355位氨基酸殘基所示的 N355片段或含有gp96蛋白的提取物；所述R)xp3的干擾RNA如序列表的序列5所示。
9.如權利要求3所述的疫苗佐劑或權利要求4至8中任一所述的疫苗，其特征在于所述含有gp96蛋白的提取物是將離體動物組織或離體腫瘤組織或離體腫瘤細胞的勻漿液依次進行ConA-S印harose層析和HiTrap-Q Sepharose離子交換層析得到的；所述離體動物組織為離體小鼠肝臟、離體豬肝臟或離體人胎盤；所述腫瘤組織為乳腺癌、腦膠質瘤、腎癌、 腸癌、肝癌或胃癌；所述腫瘤細胞為人肝癌細胞H印G2或黑色素瘤細胞B16 ；所述ConA-S^harose層析包括如下步驟(1)將所述勻漿液上樣于層析柱，流速為0.25ml/min ；(2)用10倍層析柱柱體積的洗脫液甲洗滌步驟(1)的層析柱，流速為0.5ml/min ；所述洗脫液甲的制備方法為在NaCl濃度為200mM pH7. 5的PBS中加苯甲基磺酰氟(PMSF)至終濃度為ImM ；(3)用3倍層析柱柱體積的洗脫液乙洗滌步驟(2)的層析柱，流速為0.25ml/min，收集洗脫液，即為洗脫液丙；所述洗脫液乙的制備方法為在NaCl濃度為200mM pH7.5的PBS中力口 α -D-吡喃葡萄糖至終濃度為10g/mL，加苯甲基磺酰氟至終濃度為ImM ；所述HiTrap-Q Sepharose離子交換層析包括如下步驟(a)將所述洗脫液丙上樣于層析柱，流速為lml/min；(b)用5mlNaCl濃度為200mM pH7. 5的PBS洗滌步驟(a)的層析柱，流速為lml/min ；(c)用IOmlNaCl濃度為300mM pH7. 5的PBS洗滌步驟(b)的層析柱，流速為lml/min ；(d)用:3ml NaCl濃度為600mM pH7. 5的PBS洗滌步驟(c)的層析柱，流速為lml/min， 得到的洗脫液即為含有gp96蛋白的提取物。
10.如權利要求9所述的疫苗或疫苗佐劑，其特征在于所述疫苗的各個組分均單獨包裝。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種促進gp96蛋白的免疫活性的方法及其應用。本發(fā)明提供了免疫調節(jié)劑在提高gp96蛋白相關物質的免疫活性中的應用；所述免疫調節(jié)劑為環(huán)磷酰胺、抗CD25的抗體和Foxp3的干擾RNA中的至少一種；所述gp96蛋白相關物質為序列表的序列1所示的gp96蛋白、N355片段或含有gp96蛋白的提取物；所述Foxp3的干擾RNA如序列表的序列5所示。本發(fā)明還提供了包括所述免疫調節(jié)劑和所示gp96蛋白相關物質的各種疫苗。本發(fā)明對于各種癌癥，如乙肝、黑色素瘤等的治療具有重大價值。
文檔編號A61P31/20GK102462841SQ20101053995
公開日2012年5月23日 申請日期2010年11月9日 優(yōu)先權日2010年11月9日
發(fā)明者劉振, 孟頌東, 李揚, 李星輝, 王賽鋒, 胡坤, 邱立鵬, 閆曉麗, 陳立釗 申請人:中國科學院微生物研究所