專利名稱：微小rna的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其是微小RNA的新用途，即miR-17-5p和miR-20a 的新用途。
背景技術(shù)：
髓系抑制細(xì)胞(MDSCs)作為免疫抑制系統(tǒng)的重要組成部分在免疫應(yīng)答中發(fā)揮廣 泛的免疫抑制作用，尤其是T淋巴細(xì)胞。MDSCs在小鼠細(xì)胞特征性表達(dá)Ly 6C/G和CDllb表 面分子，而在人類細(xì)胞特征性的表面分子為⑶llb+CD33+HLA-DR_。小鼠⑶llb+Gr-Γ細(xì)胞通 過形態(tài)學(xué)、分子組成和功能學(xué)三方面分成了兩個(gè)亞型單核細(xì)胞型(MO-MDSCs)類似炎癥性 的單核細(xì)胞，表達(dá)Ly6C標(biāo)記；低密度的多形核白細(xì)胞型(PMN-MDSCs)類似不成熟的白細(xì)胞， 表達(dá)Ly6G標(biāo)記，它們都對(duì)T淋巴細(xì)胞有抑制作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)腫瘤患者體內(nèi)大量積聚 MDSCs,因此清除和改變MDSCs的功能成為近年來的研究熱點(diǎn)。然而調(diào)節(jié)MDSCs功能的合理 機(jī)制始終難解，一些研究證實(shí)MDSCs調(diào)節(jié)JAK2-STAT3通路。STAT3 (信號(hào)傳導(dǎo)子和激活子 3)轉(zhuǎn)錄因子使MDSCs擴(kuò)增并且增加了小鼠腫瘤的免疫耐受。因此，抑制或沉默STAT3可以 抵抗MDSCs的作用從而促進(jìn)機(jī)體對(duì)于腫瘤的免疫應(yīng)答。
小干擾RNAs (MicroRNAs，miRNAs)是一類短小的非編碼RNA。MicroRNAs這種非 編碼調(diào)控RNA，是由機(jī)體自我產(chǎn)生，具有18-25個(gè)堿基，主要通過與靶基因信使RNA (mRNA) 3’ 非翻譯區(qū)(3’ -UTR)配對(duì)結(jié)合來實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的調(diào)控。在生理和病理?xiàng)l件下，MicroRNAs在 細(xì)胞增殖、細(xì)胞死亡、細(xì)胞分化發(fā)育、新陳代謝、病毒感染和腫瘤中均發(fā)揮著重要作用。許 多克隆于小鼠骨髓細(xì)胞的MicroRNAs調(diào)節(jié)著造血系統(tǒng)，同時(shí)MicroRNAs對(duì)于免疫細(xì)胞的發(fā) 育，固有免疫和適應(yīng)性免疫起著決定性作用。MicroRNAs選擇性的或高表達(dá)于免疫細(xì)胞，例 如miR-17 92，miR-155，miR-181和miR-223在骨髓和淋巴細(xì)胞的成熟、增殖、分化過程中有 “允許”作用。
腫瘤是危害人類身體健康的首要疾病之一，據(jù)報(bào)道癌癥患者的平均生存率僅為5 年，而癌癥治愈率只有20% -30%左右。過去十年我國(guó)雖然在腫瘤的防治方面取得了很大 進(jìn)展，出現(xiàn)了許多新技術(shù)新方法，發(fā)展了多種抗腫瘤免疫治療，但到目前為止，這些方法遠(yuǎn) 沒有達(dá)到人們的預(yù)期效果，一個(gè)重要的原因就是缺少生物治療。目前腫瘤治療中發(fā)展最為 迅速的一個(gè)領(lǐng)域是靶向藥物治療，被大家廣泛重視，同時(shí)基因治療代表著未來腫瘤防治方 向。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供miR-17_5p和miR-20a的新用途。通過沉默 STAT3，miR-17-5p和miR_20a減輕了 MDSCs的免疫抑制，成為作為制備應(yīng)用miRNA免疫治 療作用的藥物來治療一些疾病特別是腫瘤的切入點(diǎn)。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是
miR-17-5p具有抑制髓系抑制細(xì)胞積聚的用途。3
優(yōu)選的，所述miR-17_5p通過阻礙髓系抑制細(xì)胞(MDSCs)的積聚從而具有抑制腫 瘤生長(zhǎng)的用途。
優(yōu)選的，所述腫瘤為結(jié)腸癌、肺癌或卵巢癌。
優(yōu)選的，所述miR-17_5p在制備通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的表達(dá)抑制髓系抑制細(xì)胞積聚 以抑制腫瘤生長(zhǎng)的靶向藥物中的用途，即制備以miR-17-5p為靶點(diǎn)的藥物來抑制腫瘤生長(zhǎng)。
優(yōu)選的，所述miR-17-5p在制備通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞抑制結(jié)腸癌、肺癌或卵巢癌生 長(zhǎng)的靶向藥物中的用途。
miR-20a具有抑制髓系抑制細(xì)胞積聚的用途。
優(yōu)選的，所述miR-20a通過阻礙髓系抑制細(xì)胞(MDSCs)的積聚從而具有抑制腫瘤 生長(zhǎng)的用途。
優(yōu)選的，所述腫瘤為結(jié)腸癌、肺癌或卵巢癌。
優(yōu)選的，所述miR-20a在制備通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的表達(dá)抑制髓系抑制細(xì)胞積聚以 抑制腫瘤生長(zhǎng)的靶向藥物中的用途，即制備以miR-20a為靶點(diǎn)的藥物來抑制腫瘤生長(zhǎng)。
優(yōu)選的，所述miR-20a在制備通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞抑制結(jié)腸癌、肺癌或卵巢癌生長(zhǎng) 的靶向藥物中的用途。
本發(fā)明的有益效果是
本發(fā)明利用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)和生物信息學(xué)分析對(duì)miR-17_5p和miR-20a的功能 進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)miR-17-5p和miR-20a具有抑制MDSCs的功能，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)miR-17_5p 和miR-20a具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的用途，可以將miR-17_5p和miR-20a設(shè)計(jì)為靶向藥物來治 療腫瘤，對(duì)腫瘤臨床免疫治療有著潛在的巨大應(yīng)用價(jià)值，并且為進(jìn)一步研究miR-17-5p和 miR-20a的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。


圖 1 是miR-17-5p 和 miR_20a 結(jié)合于 STAT3 3，UTR ；
圖 2 是miR-17-5p 和 miR_20a 調(diào)節(jié) STAT3 的表達(dá)；
圖3是在體外，miR-17-5p和miR_20a減輕MDSCs的抑制作用；
圖4是在體內(nèi)，miR-17_5p和miR_20a減輕MDSCs的抑制作用，其中Al-大小、 A2-重量、A3-體積，Bl-重量、B2-體積；
圖5是腫瘤相關(guān)因子調(diào)節(jié)miR-17_5p和miR-20a的表達(dá)，其中圖5B1顯示的是成 熟miR-17-5p的表達(dá)水平，圖5B2顯示的是成熟miR-20a的表達(dá)水平，圖5B3顯示的是STAT3 mRNA的表達(dá)水平；
圖6是本研究中所用引物。
具體實(shí)施方式
為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好的理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合附圖及具體實(shí) 施方式對(duì)本發(fā)明所述技術(shù)方案作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
實(shí)施例1
構(gòu)建腫瘤小鼠模型、BMCs的制備以及miRNA基因和3’ -UTR的表達(dá)構(gòu)建4
(1)腫瘤鼠模型的建立
使用4-6周的雌性的BALB/C鼠和C57BL/6鼠和裸鼠(北京動(dòng)物中心)，實(shí)驗(yàn)前一 周將鼠飼養(yǎng)在不存在對(duì)鼠致病的病原體的環(huán)境內(nèi)，保證鼠處于病原體免疫狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)構(gòu)建 了 s. c.腫瘤模型(靜脈注射腫瘤模型)，包括在BALB/C鼠內(nèi)構(gòu)建CD6結(jié)腸癌(ATCC)模 型，以及在C57BL/6鼠體內(nèi)構(gòu)建Lewis肺癌模型(ATCC)和1D8卵巢癌模型(Ruby，Texas大 學(xué))。鼠皮下一次性注射100微升PBS (磷酸鹽緩沖液)，內(nèi)含5 X IO5腫瘤細(xì)胞。模型構(gòu)建 時(shí)每個(gè)模型所注射的腫瘤細(xì)胞的數(shù)量是以在注射后3-4周內(nèi)能形成一直徑約為1. 5厘米的 腫瘤為依據(jù)的。
(2)細(xì)胞系和髓系抑制細(xì)胞的準(zhǔn)備。
實(shí)驗(yàn)所需要的人的胚胎腎細(xì)胞系HEK493 T細(xì)胞，鼠的單核白細(xì)胞/巨噬細(xì)胞系 RAW264. 7和人的單核白細(xì)胞系U937均是從美國(guó)型培養(yǎng)菌種集(ATCC)購買的。鼠的髓系 抑制細(xì)胞(MDSCs)從骨髓細(xì)胞(BMCs)誘導(dǎo)獲得，從模型鼠的股骨中收集BMCs，室溫下懸浮 于aiilACK緩沖液5分鐘，使紅細(xì)胞裂解。T細(xì)胞和B細(xì)胞通過磁力珠進(jìn)行選擇，選擇完成之 后，⑶4 T細(xì)胞，⑶8 T細(xì)胞和B細(xì)胞與BMCs的比例不超過1%。除非特殊說明，以下實(shí)施例 中所使用的BMCs均為經(jīng)過上述選擇獲得的細(xì)胞。MDSCs從這些獲得的BMCs誘導(dǎo)獲得。首 先在M孔板內(nèi)，37°C，5% C02的條件下，處理單核白細(xì)胞-粒細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF ； 20ng/ml)五天，在含有RPMI1640媒介和3% FCS，1 %青霉素和鏈霉素，以及經(jīng)過處理的白 細(xì)胞-粒細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF ;20ng/ml)和IL-4(10ng/ml)的M孔轉(zhuǎn)染板內(nèi)，再將 5 X IO4的CT-26，Lewis或1D8腫瘤細(xì)胞分別與2 X IO6BMCs共培養(yǎng)。收集細(xì)胞并用流式細(xì) 胞儀進(jìn)行分析。
鼠的MDSCs同樣按照制造商(Miltenyi Biotech)提供的方法步驟使用Gr-1抗體 和LS柱的免疫磁珠從CD6腫瘤模型鼠的脾臟中分離獲得，再使用抗Gr-I和CDllb抗體染 色后使用流式細(xì)胞分選進(jìn)行分類。具體實(shí)現(xiàn)上，殺死CD6結(jié)腸癌模型鼠，以無菌注射器分 別從小鼠的脾臟和血液中獲取細(xì)胞，使用水破壞紅細(xì)胞，并進(jìn)行血清封閉。用:3mlPBS懸浮 細(xì)胞，首先加入⑶8+T淋巴細(xì)胞、⑶4+T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的抗體30 μ 1，在冰上靜置15 分鐘后，用PBS洗一遍；之后加入⑶4+Τ淋巴細(xì)胞、⑶8+Τ淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的陽性選定 的磁珠(MACS) 35 μ 1，冰上靜置30分鐘，用PBS洗兩遍，得到不含⑶8+淋巴細(xì)胞、⑶4+Τ淋巴 細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的BMCs。提純的脾的MDSCs 90%以上為Grl+⑶Ilb+細(xì)胞。
從脾臟制備單細(xì)胞懸液，使用ACK緩沖液除去紅細(xì)胞。在使用這些單獨(dú)的細(xì)胞前， 轉(zhuǎn)染這些Grl+細(xì)胞并在腫瘤上清液中培養(yǎng)M小時(shí)。
(3)miRNA、siRNA 和 3' -UTR 的表達(dá)構(gòu)建
從廣東銳博生物公司購買miR-17-5p mimics 和 miR_20a mimics, miR-17-5p 的抑制物，miR-20a的抑制物以及miRNA抑制物的陰性對(duì)照。從廣東銳博生物公司購買 STAT3 siRNA和siRNA陰性對(duì)照。從hvitrogen公司購買空白iT熒光寡核苷酸。從Open biosystem 公司購買 pCMV-SP0RT6/STAT3 完全編碼序列(cDNA clone ID :3593588 Catalog No :MMM4769_99609717)的表達(dá)載體，此編碼序列中包含一個(gè)miR-17_5p and miR_20a種子 序列的3’ UTR。使用引物，將鼠的基因組中的Pri-miR-17-5p和Pri_miR-20a基因于Hind III和Xho I位點(diǎn)克隆到pcDNA3. 1表達(dá)載體上。獲得的構(gòu)造物稱為pcDNA3. l-miR-17_5p 和 pcDNA3. l-miR-20a。
通過PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))的方法從鼠脾臟細(xì)胞的基因組DNA克隆STAT的 3，UTR,并將其在Me I和^CbaI位點(diǎn)連接到pIS2熒光素酶報(bào)告載體(Addgene)上。通過 PCR的方法構(gòu)建了 STAT3的3 ‘ UTR的突變體，突變體經(jīng)過質(zhì)粒DNA測(cè)序進(jìn)行確認(rèn)，在圖六 中列出了實(shí)驗(yàn)中所用的引物。
如圖IAl所示，設(shè)計(jì)了 4種不同的引物并通過PCR的方法構(gòu)建STAT的3’-UTR的突 變體(Mut) 1、突變體2。如圖1A2所示，構(gòu)建的熒光報(bào)告質(zhì)粒包括種子序列1 (156-162，STAT3 3，UTR1)、種子序歹Ij 2(403-409, STAT3 3，UTR2)、突變種子序列 1 (STAT3 3，UTRl Mut)、突 變種子序列2(STAT3 3，UTR2 Mut)、種子序列1和種子序列2 (STAT3 3，UTR1+2)、突變種 子序列1和種子序列2(STAT3 3，UTRl Mut+2)或者種子序列1和突變種子序列2 (STAT3 3，UTRl+2Mut)。
PCR 條件
IOX擴(kuò)增緩沖液IOul
4 種 dNTP 混合物各 200umol/L
引物各 10 IOOpmol
模板 DNA 0. 1 2ug
Taq DNA 聚合酶 2. 5u
Mg2+ 1. 5mmol/L
加雙或三蒸水至IOOul
實(shí)施例2
驗(yàn)證miR-17-5p 和 miR_20a 與 STAT3 3，UTR 的綁定關(guān)系
應(yīng)用熒光素酶報(bào)告基因來分析驗(yàn)證miR-17-5p和miR-20a與STAT3 3'UTR的綁定 關(guān)系。對(duì)于轉(zhuǎn)染的腎(人胚腎)293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前一天用250毫升細(xì)胞密度為4X104的培 養(yǎng)基將細(xì)胞在48孔板進(jìn)行鋪板，按照說明書，將細(xì)胞與表達(dá)質(zhì)粒、海腎熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒 和對(duì)照質(zhì)粒(ftOmega)用脂質(zhì)體2000 (Invitrogen公司)進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，通過轉(zhuǎn)染后24小時(shí) 使用雙熒光素酶試劑盒測(cè)定海腎和螢火蟲熒光素酶的活動(dòng)，海腎熒光素酶的活性根據(jù)螢火 蟲熒光素酶活性進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)分析采用檢定的方法，95%的置信限度 被認(rèn)為是有意義的，*(單一星號(hào))P < 0. 05，**(雙星號(hào))P < 0. 01。轉(zhuǎn)染了抑制劑陰性對(duì) 照的細(xì)胞作為對(duì)照組(Ctr.)，有pLS2-REP0RT-STAT3 3，UTR和miRNA對(duì)照結(jié)構(gòu)物(miRctr) 的活性直接被設(shè)定為1。
具體實(shí)現(xiàn)為
1)轉(zhuǎn)染用 STAT3 的 3，UTRU STAT3 的 3，UTRl 突變體，STAT3 的 3，UTR2、STAT3 的 3，UTR2 突變體禾口 STAT3 的 3，UTR1+2、STAT3 的 3，UTR1+2 的突變體分別與 pcDNA3. 1-pr i-miR17-5p(miR-17-5p)、pcDNA3. l-pri_miR-20a 或者對(duì)照結(jié)構(gòu)物(miRctr)共轉(zhuǎn)腎(人胚 腎)293T細(xì)胞。另外構(gòu)建一組由miR-17-5p和miR-20a抑制劑分別在0. InMUOnM和IOOnM 濃度下轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
2)制備被動(dòng)裂解緩沖液IXPLB 將1倍體積的5XPLB (Passive LysisBuffer)加 到4倍體積的蒸餾水中，混合均勻，在4°C儲(chǔ)存1個(gè)月。
3)制備 LAR II 用 Luciferase Assay Buffer II (目錄號(hào) E1980 105ml)溶解凍 干粉 Luciferase Assay Substrate，_20°C存儲(chǔ) 1 個(gè)月。
4)制備 Stop & Glo 試劑加 0. 2ml 的 50 X Stop & Glo 酶到 IOml 的 Stop & Glo 緩沖液中，制成IXMop & Glo試劑。
5)按照說明書將細(xì)胞與表達(dá)質(zhì)粒、海腎熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒(!Iomega) 用脂質(zhì)體2000(InvitrOgen公司)進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。
6)細(xì)胞裂解
(1)除去培養(yǎng)細(xì)胞中的培養(yǎng)基；
(2)用IXPBS清洗培養(yǎng)細(xì)胞，去掉清洗液；
(3)按48孔65ul將1 XPLB加入到培養(yǎng)孔中。
7)被動(dòng)裂解
在室溫輕緩晃動(dòng)培養(yǎng)板15分鐘，把裂解液轉(zhuǎn)移到檢測(cè)試管中。
8)轉(zhuǎn)染后M小時(shí)測(cè)定海腎和螢火蟲熒光素酶的活動(dòng)
設(shè)置自動(dòng)進(jìn)樣器1和2分別分裝IOOul的LARII和Mop&Glo試劑。測(cè)量時(shí)，使用 1-2秒延遲和5-10秒讀數(shù)，在螢光發(fā)光儀上(Luminometer)
(1)加入 20ulPLB 裂解液
(2)加入 lOOulLARII
(3)檢測(cè)螢火蟲螢光素酶
(4)加入 100uBtop&Glo 試劑
(5)檢測(cè)海腎螢光素酶的活性
(6)其它孔如此循環(huán)操作。
如圖IB所示，通過熒光素酶活性的比較可以看出，miR-17_5p和miR-20a都能夠 直接的與STAT3 3，UTR的位置156-162 (Bi)和位置403-409 (B2)相互作用進(jìn)而抑制報(bào)告 基因的表達(dá)。而STAT的3，UTR種子序列的突變體解除了 miR-17-5p和miR-20a的抑制活性。
如圖IC 所示，顯示了轉(zhuǎn)染了 STAT3 3，UTR1+2 和 pcDNA3. l-pri-miR17-5p 或者 pcDNA3. l-pri-miR-20a以及濃度上升的miR-17_5p抑制劑(Cl)或者miR_20a抑制劑(C2) 的四31~細(xì)胞的熒光素酶活性，轉(zhuǎn)染了抑制劑陰性對(duì)照的細(xì)胞作為對(duì)照組(Ctr.)。我們可以 看出miR-17-5p的抑制劑和miR-20a的抑制劑也能分別明顯的阻塞miR-17_5p和miR_20a 對(duì)熒光素酶活性的負(fù)調(diào)控。
實(shí)施例3
STAT3 的表達(dá)被 miR-17_5p 和 miR_20a 調(diào)控
用空白iT熒光寡核苷酸轉(zhuǎn)染單核白細(xì)胞/巨噬細(xì)胞系RA\^64.7。轉(zhuǎn)染后M小時(shí) 用熒光顯微鏡觀察結(jié)果如圖2A所示。
使用Western印跡分析的方法和定時(shí)定量PCR的方法觀察miR-17_5p和miR_20a 對(duì)STAT表達(dá)水平的影響。
(1)在室溫下封閉液中與抗鼠STAT3和抗鼠p47phaX分別反應(yīng)一個(gè)小時(shí)，通過用 過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(試劑盒)和增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光劑(Amersham公司)對(duì)這種蛋白質(zhì)抗體 復(fù)合物進(jìn)行檢測(cè)，其中抗鼠STAT3和抗鼠p47phax從SantaCruz Biotechnology公司獲得。 具體實(shí)現(xiàn)為
1)轉(zhuǎn)染按照說明書的步驟，通過核轉(zhuǎn)染的方法，用miR-17-5pmimicS、miR-20a7mimics,STAT3 siRNA或者由miRNA mimics、miRNA抑制劑和siRNA陰性對(duì)照寡核苷酸混合 組成的陰性對(duì)照(Ctr.)分別轉(zhuǎn)染7細(xì)胞，共轉(zhuǎn)48小時(shí)后進(jìn)行Western蛋白印跡分 析以檢測(cè)STAT3，gp91和P47在各種共轉(zhuǎn)條件下mRNA和蛋白表達(dá)。
2)蛋白樣品的制備
1>倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液；
2>每瓶細(xì)胞加:3ml4°C預(yù)冷的PBS，平放輕輕搖動(dòng)1分鐘洗滌細(xì)胞，然后棄去洗液， 重復(fù)以上操作兩次，共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液，然后把培養(yǎng)瓶置于冰上；
3>按Iml裂解液加IOyL苯甲基磺酰氟(PMSF) (IOOmM)，搖勻置于冰上；
4>每瓶細(xì)胞加400 μ L含PMSF的裂解液，于冰上裂解30分鐘，為使細(xì)胞裂解充分 培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回?fù)u動(dòng)；
5>裂解完后，用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)，然后用加樣器將細(xì)胞碎片 和裂解液移至1. 5ml離心管中；
6>4°C 12000rpm 離心 5 分鐘；
7>將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移到0. 5ml的離心管中放平_20°C保存。
3)電泳
DSDS-PAGE 凝膠配制
SDS-PAGE凝膠使用SDS-PAGE凝膠配制試劑盒進(jìn)行配置；
2>樣品處理
在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，于沸水浴中加 熱4分鐘，以充分變性蛋白；
3>上樣與電泳
冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE凝膠加樣孔內(nèi)即可。為了便于觀 察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果，以及判斷蛋白分子量大小，使用預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，70V電壓 至分離膠與濃縮膠界面，后120V電壓至底。
4)轉(zhuǎn)膜
1>取一塊PAGE膠，浸泡于電轉(zhuǎn)緩沖液中，同時(shí)把兩張同樣大小的濾紙和兩張海綿 也浸泡于緩沖液中；
2>剪一塊同樣大小的PVDF膜，做如下處理首先浸于100%甲醇溶液10秒，然后 浸于去離子水中3分鐘，最后浸于轉(zhuǎn)移緩沖液中3分鐘；
3>電轉(zhuǎn)三明治順序如下正極(白色)海綿
濾紙
PVDF 膜
蛋白膠
濾紙
海綿
負(fù)極(黑色)。
5)將三明治夾子放入預(yù)裝有電轉(zhuǎn)緩沖液的電泳槽中，加蓋，接通電源恒壓200V， 120分鐘；
6)將完成后的PVDF膜用去離子水沖洗，放入5%脫脂奶粉中，室溫60分鐘；
7)分別加入一抗(抗鼠STAT3和抗鼠p47phax)，室溫一小時(shí)，用TBST洗膜3次， 每次5分鐘；
8)加入酶標(biāo)二抗(試劑盒)，室溫一小時(shí)，用TBST洗膜3次，每次5分鐘；
9)ECL顯色A液和B液按1 1混合加到膜上，暗室壓片，顯影液1分鐘，定影液 1分鐘。
(2) RNA 分離和定時(shí)定量 PCR(qRT-PCR)
對(duì)于基因和miRNA前體，qRT_PCR使用BIO-RAD熒光定量PCR設(shè)備，設(shè)計(jì)特異性的 引物。對(duì)于成熟的miR-17-5p和miR-20a，qRT-PCR使用應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的7900的一羥 色胺的序列檢測(cè)系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)熒光定量PCR試劑盒。擴(kuò)增U6的小RNA(用于成熟miRNA的， 應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)和GAPDH mRNA (用于基因和miRNA前體，應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)作為每 一個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品的內(nèi)源性對(duì)照。所有的反應(yīng)都平行進(jìn)行三組。因?yàn)檎郫B產(chǎn)生的變化按照制造 商的說明(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)采用-Δ ACt的方法進(jìn)行計(jì)算。
結(jié)果如圖2B1所示，miR-17-5p和miR_20a均能影響gp91，p47and STAT3的轉(zhuǎn)錄 和表達(dá)。miR-17-5p和miR-20a降低gp91和p47的轉(zhuǎn)錄但是對(duì)STAT3的轉(zhuǎn)錄影響不大。然 而與此同時(shí),如圖2B2所示，miR-17-5p和miR_20a降低了 STAT3 and p47的表達(dá)水平。
在RAW264. 7中，STAT3，gp91 and p47的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的相關(guān)水平通過用不用濃度的 miR-17-5p或miR-20a mimic轉(zhuǎn)染進(jìn)行檢測(cè)。圖2C1. 1和Cl. 2顯示了在轉(zhuǎn)染了 miR-17_5p mimics或miR-20a mimics的7中成熟的miR-17_5p和miR_20a各自的表達(dá)水平。圖 2 的 C2. 1 和 C2. 2，C3. 1 和 C3. 2 以及 C4. 1 和 C4. 2 則分別顯示了轉(zhuǎn)錄了 miR-17_5p mimics 或 miR-20a mimics 的 RAW264. 7 中 STAT3, gp91 和 p47 的轉(zhuǎn)錄水平。圖 2 的 C5. 1 和 C5. 2 則顯示了轉(zhuǎn)染了 miR-17-5p mimics 或miR_20a mimics 的7 中 STAT3 的蛋白水平。 由定時(shí)定量PCR的結(jié)果我們可以發(fā)現(xiàn)隨著miR-17-5p和miR-20a表達(dá)水平的升高，對(duì)于轉(zhuǎn) 錄了 miR-17-5p mimics 或 miR_20a mimics 的 7，細(xì)胞內(nèi)的 STAT3 轉(zhuǎn)錄水平并無明 顯的變化，gp91和p47的轉(zhuǎn)錄水平均逐漸下調(diào)；而由Western Blot的結(jié)果我們可以發(fā)現(xiàn)隨 著轉(zhuǎn)錄的miR-17-5p和miR-20a濃度的升高，STAT3的蛋白水平明顯下調(diào)。
實(shí)施例4
miR-17-5p和miR_20a對(duì)于MDSCs的潛在抑制作用的體外實(shí)驗(yàn)
(1)轉(zhuǎn)染
用miR-17-5p mimics,miR-20a mimics, STAT3 siRNA或混合陰性對(duì)照(混合miRNA mimics陰性對(duì)照寡核苷酸和siRNA陰性對(duì)照寡核苷酸)轉(zhuǎn)染7細(xì)胞。為了調(diào)查 腫瘤相關(guān)的Gr-Γ⑶Ilb+MDSC上在抗原特異性反應(yīng)中的抑制作用，用miR-17_5p mimics和 miR-20a mimics, miR-17_5p抑制劑和miR_20a抑制劑，STAT3 siRNA或者它們的陰性對(duì)照 (miRNA mimics對(duì)照，抑制劑對(duì)照和siRNA對(duì)照的混合物)轉(zhuǎn)染MDSCs (除非特殊說明每孔 5X IO5) ,Grl+CDlIb+MDSCs是從CD6腫瘤鼠的脾分離獲得的。VLP(25 μ g/ml)刺激下，將轉(zhuǎn) 染的MDSCs加入培養(yǎng)的脾的⑶4或⑶8 T細(xì)胞(1X106)。用miRNA、miRNA抑制劑或s iRNA 轉(zhuǎn)染MDSCs，用人類乳頭瘤病毒16的病毒樣粒子(VLPs)免疫鼠脾內(nèi)的單獨(dú)的CD4和CD8T 細(xì)胞，兩天后收取上層清液。VLPs分別的作為抑制因子、應(yīng)答因子和刺激因子，所有的陰性 對(duì)照都不能影響STAT3的表達(dá)。使用ELISA檢測(cè)上層清液中的IFN- y。VLPs特異性的⑶4 或CD8T細(xì)胞是與實(shí)施例1步驟O)的方法相同，使用CD4和CD8的陽性選擇磁珠和LS柱子(Mitenyi Biotech)篩選獲得的。
(2)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)
ELISA夾心法酶聯(lián)免疫試劑盒(Pierce Endogen)用于IFN-γ的定量檢測(cè)。使用 SpectraMax190ELISA檢測(cè)儀測(cè)定450nm時(shí)每個(gè)樣品(上述步驟(1)中獲取的上層清液)的 吸光度，細(xì)胞因子的水平通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的三次滴定進(jìn)行量化，單位為pg/ml。
(3) ROS 和 H2A 檢測(cè)
按照說明書，使用氧化敏感染料DCFDA(分子探針/Invitrogen)測(cè)定7 或 MDSC 產(chǎn)生的 ROS (活性氧)。單個(gè)的 CDllb+Gr-I+MDSCs 在 2. 5 μ MDCFDA 和 30ng/ml PMA(Sigma-Aldrich公司購買)中處理30分鐘，然后使用流式細(xì)胞分析進(jìn)行分析；在冰 上，PBS收集細(xì)胞，使用以下的抗體(均從BD生物公司購買)異硫氰酸熒光素、聚乙烯和 與抗原呈遞細(xì)胞結(jié)合的抗 CD4 (L3T4)、抗 CD8 α (Ly-2)、抗 CD 19 (1D8)、抗 CDllb (Ml/70)、 抗Gr-l(RB6-8(^)、抗Ly6G(lA^和抗Ly6C(AL21)抗體。清洗細(xì)胞兩次并在含有4% 多聚甲醛和1 % FCS(胎牛血清)的PBS溶液中再懸浮，在進(jìn)行流氏細(xì)胞分析(FAkan， BectonDickson)前將懸液在4°C條件下保存，每組分析過程都用同型的單克隆抗體對(duì)照作 為負(fù)對(duì)照。
H2O2的檢測(cè)使用過氧化氫檢測(cè)試劑盒(Invitrogen)，將IX IO4個(gè)細(xì)胞懸浮于PBS， 加入PMA(30ng/ml) 30分鐘后，使用熒光分光光度計(jì)(Bio-Rad)測(cè)量37°C、560nm的吸光度。 吸光度的結(jié)果使用連續(xù)稀釋20mM H2O2所做的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
如圖3々所示，1^1 -17-5 和1^1 -2(^均能降低在1^^^64.7細(xì)胞中1 05仏1)的表達(dá) 和H202 (A2)的產(chǎn)生；如圖;3B所示，miR-17-5p和miR-20a同樣能夠降低在腫瘤相關(guān)的MDSCs 中ROS的表達(dá)和H2O2的產(chǎn)生，其中圖3的Bi. 1和B2. LBL 2和B2. 2以及Bi. 3和B2. 3分別顯 不了轉(zhuǎn)染了 miR-17-5p mimics (miR-17_5p. mi),miR-20a mimics (miR-20a. mi)，miR-17_5p 抑制劑(miR-17-5p. inh)和 miR_20a 抑制劑(miR-20a. inh)和陰性對(duì)照(Ctr.)的 MDSCs 中成熟miR-17-5p和miR-20a的表達(dá)水平、ROS的表達(dá)水平和H2A的產(chǎn)生，Geo代表幾何平 均數(shù)；如圖3C所示，miR-17-5p和miR-20a降低了腫瘤相關(guān)MDSCs的抑制潛能。miR-17_5p 和miR-20a阻塞了腫瘤相關(guān)MDSCs對(duì)于VUs特異性的CD4(C1，C2)和CD8T淋巴細(xì)胞(C3， C4)的影響效果。然而，miR17-5p和miR-20a抑制劑促進(jìn)了腫瘤相關(guān)MDSCs對(duì)于VLPs特異 性的CD4(C1，C3)和CD8T淋巴細(xì)胞(C2，C4)的抑制效果。抑制率(Inhibition% )=在共 培養(yǎng)的T細(xì)胞中上清液所含有的IFN- γ的濃度加上MDSCs的抗原除以在共培養(yǎng)的T細(xì)胞 中上清液所含有的IFN- γ的濃度加上沒有MDSCs的抗原，即
在共培養(yǎng)的τ細(xì)胞中上清液所含有的IFN- Y的濃度+MDSCs的抗原抑制率=_在共培養(yǎng)的T細(xì)胞中上清液所含有的IFN- γ的濃度+沒有MDSCs的抗原
統(tǒng)計(jì)分析時(shí)采用了檢定的方法，95%的置信限度被認(rèn)為是有意義的，*(單個(gè)星 號(hào))P < 0. 05，**(雙星號(hào))P < 0. 01。
實(shí)施例5
miR-17-5p和miR_20a對(duì)于MDSCs的潛在抑制作用的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
在MDSC抑制的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，在接種了 CT46腫瘤細(xì)胞之后的第一天到第七天，將miR-17-5p mimics 和 miR_20a mimics、miR-17_5p 抑制劑和 miR_20a 抑制劑、STAT3 siRNA 或STAT3的陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染的MDSCs注射進(jìn)入鼠的腫瘤內(nèi)。對(duì)于miRNA mimics、miRNA抑 制劑、siRNA或者siRNA陰性對(duì)照的轉(zhuǎn)染，在IOOnM的指示寡核苷酸濃度下，按照生產(chǎn)協(xié)議 (Amaxa，Germany)，運(yùn)用核轉(zhuǎn)染(nucleofection)的方法對(duì)BALB/C鼠的BMC進(jìn)行轉(zhuǎn)染，即殺 死小鼠取骨髓細(xì)胞，用1640培養(yǎng)基將BMC吹下來，加PBS離心；用PBS稀釋至1*107/100 μ 1 個(gè)細(xì)胞，加質(zhì)粒5 μ g\100 μ 1，混勻后放入電轉(zhuǎn)儀；將電轉(zhuǎn)儀調(diào)至Stemcell程序進(jìn)行電轉(zhuǎn)， 每次加樣100 μ 1，電轉(zhuǎn)后打入老鼠體內(nèi)即可。5周齡小鼠首先皮下注射5*105CT46細(xì)胞，一 周左右后至腫瘤長(zhǎng)至米粒般大小，每只鼠分別注射2X IO6個(gè)預(yù)先處理好的BMCs，在7、11、 15、19、23、27天后殺死小鼠。測(cè)量腫瘤的大小、重量、體積，腫瘤的測(cè)量使用卡尺，每組6只 鼠去平均值，誤差線代表平均值士SD。統(tǒng)計(jì)分析時(shí)采用了檢定的方法，95%的置信限度被認(rèn) 為是有意義的，單個(gè)星號(hào)P < 0. 05，雙星號(hào)P < 0. 01。
圖4A顯示了在7、11、15、19、23、27天殺死小鼠，用對(duì)照組(天然鼠)與分別移植了 轉(zhuǎn)染了 miR-17-5p mimics,miR-20a mimics 或者 STAT3 siRNA(STAT3siRNA)的 MDSCs 的鼠 體內(nèi)腫瘤的大小(Al)、重量(A2)、體積(A3)進(jìn)行比較。與移植了用對(duì)照轉(zhuǎn)染的MDSCs(Ctr.) 接種過疫苗的CT-沈腫瘤鼠相比，在移植了轉(zhuǎn)染了 miR-17-5p mimics, miR-20a mimics或 者STAT3 siRNA的MDSCs的鼠體內(nèi)，腫瘤生長(zhǎng)速度減慢。因此miR-17_5p，miR_20a或者 STAT3siRNA能夠減輕MDSCs的抑制潛能。
圖4B顯示了腫瘤的重量(Bi)和在7、11、15、19、23、27天殺死小鼠，移植了用對(duì) 照、miR-17-5p 抑制劑(miR-17_5p. inh)、miR_20a 抑制劑(miR_20a. inh)轉(zhuǎn)染的 MDSCs 的 鼠體內(nèi)腫瘤的體積(B2)，與移植了用對(duì)照轉(zhuǎn)染的MDSCs(Ctr.)接種過疫苗的CT46腫瘤鼠 相比，在移植了轉(zhuǎn)染了 miR-17-5p抑制劑(miR-17-5p. inh)，miR_20a抑制劑(miR_20a. inh) 的MDSCs的鼠體內(nèi)，腫瘤生長(zhǎng)加快，因此miR-20a抑制劑和miR-17_5p抑制劑加強(qiáng)MDSCs的 抑制潛能。
實(shí)施例6
腫瘤相關(guān)因素調(diào)節(jié)miR-17_5p和mir-20a的表達(dá)
(1)流式細(xì)胞分析對(duì)MDSCs分群
使用研磨法分別從患有CD6結(jié)腸癌、Lewis肺癌和1D8卵巢癌的小鼠的脾臟中取 細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液
1)小鼠用C02處死，立即無菌取脾；
2)將脾浸入裝有冷PBS的培養(yǎng)皿中，用鈍頭剪刀剪去白色的結(jié)締組織，換入另一 個(gè)裝有冷PBS的培養(yǎng)皿中以清洗脾臟；
3)再次換入一個(gè)裝有冷PBS的培養(yǎng)皿中；
4)用小的彎頭手術(shù)剪剪切脾臟成3mm左右的小塊；
5)用IOml塑料一次性注射器的尾部背面輕輕按壓研磨脾臟小塊，此時(shí)會(huì)看到很 多脾單細(xì)胞進(jìn)入PBS中；
6)使用Falcon(BD生物公司)過濾獲得單細(xì)胞懸液，用冷PBS洗滌2次，每次 1000r/min，離心 10 分鐘；
7)將細(xì)胞懸浮于RPMI 1640(含10%熱滅活胎牛血清)中，用臺(tái)酚蘭染色計(jì)數(shù)活 細(xì)胞數(shù)(在95%上)；11
8)調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2 X IO6細(xì)胞/ml。
從BD生物公司購買異硫氰酸熒光素、聚乙烯和與抗原呈遞細(xì)胞結(jié)合的抗 CD4(L3T4)、抗 CD8a(Ly-2)、抗 CD19(1D8)、抗 CDllb (Ml/70)、抗 Gr-1 (RB6-8C5)、抗 Ly6G(lA8)和抗Ly6C(AL21)抗體。細(xì)胞染色后在含有4%多聚甲醛和FCS (胎牛血清) 的PBS溶液中再懸浮，得到MDSCs。在進(jìn)行流氏細(xì)胞分析(FAkan，Becton Dickson)前將 懸液在4°C條件下保存，每組分析過程都用同型的單克隆抗體對(duì)照作為負(fù)對(duì)照。
如5A1所示，通過流式細(xì)胞分析，可以對(duì)MDSCs進(jìn)行分群，包括Pl (⑶llb+Gr-Γ細(xì) 胞)及它的兩個(gè)亞群P2 (Ly6C+ly6G+細(xì)胞)和P3 (ly6G 口 ly6C+細(xì)胞)。
(2) qRT-PCR
使用qRT-PCR 的方法檢測(cè)腫瘤相關(guān)的 MDSCs 中 pri-miR-17_5p，pri_miR-20a， STAT3 和 GAPDH 的表達(dá)水平。腫瘤相關(guān)的 MDSCs 中 pri-miR-17_5p，pri_miR-20a，STAT3 和GAPDH的表達(dá)水平如圖5A2所示；從CT26腫瘤鼠(CT26)、Lewis腫瘤鼠(Lewis)和 1D8腫瘤鼠(1D8)的脾獲得的MDSCs中，成熟miR-17_5p，成熟miR_20a和STAT3在 Grl+CDlIb+MDSCs (A3) ,LyeG+LyeC+MDSCs (A4)和 LyeGl^eC+MDSCs (A5)的表達(dá)水平如圖 5A3、 A4、A5所示，從CT26結(jié)腸癌鼠、Lewis肺癌鼠和1D8卵巢癌鼠體內(nèi)的MDSCs內(nèi)，miR-17_5p 和miR-20a的表達(dá)水平降低。
將BMCs細(xì)胞和CD6腫瘤細(xì)胞在一個(gè)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。使用qRT-PCR的方法檢測(cè)成 熟miR-17-5p(圖Bi)和成熟miR_20a(圖B2)和STAT3 mRNA(圖B3)的表達(dá)水平，圖5B1 顯示的是成熟miR-17-5p的表達(dá)水平，圖5B2顯示的是成熟miR_20a的表達(dá)水平，圖5B3 顯示的是STAT3 mRNA的表達(dá)水平。由結(jié)果我們可以得出結(jié)論腫瘤相關(guān)因子調(diào)節(jié)骨髓細(xì)胞 (BMCs)中 miR-17-5p、miR-20a 和 STAT3 的轉(zhuǎn)錄。
(3) Western蛋白印記分析
將BMCs細(xì)胞和CD6腫瘤細(xì)胞在一個(gè)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)，使用western blot檢測(cè) STAT3的蛋白水平，方法如前所述。如圖5C所示，腫瘤相關(guān)因子調(diào)節(jié)STAT3和p47在BMCs 中的水平。
可見，miR-17-5p和miR-20a為具有減緩髓系抑制細(xì)胞(MDSCs)抑制作用等功能 的新分子，在免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。通過本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)miR-17-5p和miR-20a功能 之一就是調(diào)節(jié)STAT3表達(dá)量，而STAT3與腫瘤等疾病有著很密切的聯(lián)系。
在腫瘤患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)MDSCs的大量積聚，參與腫瘤細(xì)胞的免疫編輯，包括免疫清 除，免疫對(duì)抗，免疫逃逸三個(gè)過程，因此抑制MDSCs的表達(dá)則很可能成為有效治療腫瘤的手 段，本發(fā)明中miR-17-5p和miR-20a則通過調(diào)節(jié)STAT3表達(dá)來降低MDSCs的積聚，因此本發(fā) 明具有積極的效果和意義。
STAT3 表達(dá)量可以被 miR-17-5p 和 miR_20a 調(diào)節(jié)，通過 miR-17_5p 和 miR_20a 結(jié)合 STAT3 3，UTR結(jié)合位點(diǎn)。轉(zhuǎn)染miR-17-5p和miR_20a后，由STAT3調(diào)節(jié)的ROS和H2O2的表 達(dá)量顯著下降。miR-17-5p和miR-20a轉(zhuǎn)染MDSCs后，降低了抗原特異性⑶4和⑶8陽性T 淋巴細(xì)胞的免疫抑制。重要的是，miR-17-5p和miR-20a降低了 MDSCs的抑制性，在小鼠腫 瘤MDSCs中轉(zhuǎn)染了 miR-17-5p和miR_20a之后腫瘤的生長(zhǎng)速度要比未轉(zhuǎn)染的慢，然而作為 對(duì)照組，在小鼠腫瘤MDSCs中轉(zhuǎn)染miR-17-5p和miR-20a的抑制物之后腫瘤的生長(zhǎng)速度明 顯加快。在腫瘤鼠中miR-17-5p和miR-20a的表達(dá)水平比未患病小鼠低，腫瘤相關(guān)因子下調(diào)miR-17-5p和miR_20a的表達(dá)量?？梢灶A(yù)見，在腫瘤患者體內(nèi)，miR-17_5p和miR_20a發(fā) 揮著打破腫瘤免疫耐受的重要作用，從而揭示了 miR-17-5p和miR-20a可以作為免疫治療 腫瘤的靶向分子。
上述參照具體實(shí)施方式
對(duì)該微小RNA的新用途進(jìn)行的詳細(xì)描述，是說明性的而不 是限定性的，可按照所限定范圍列舉出若干個(gè)實(shí)施例，因此在不脫離本發(fā)明總體構(gòu)思下的 變化和修改，應(yīng)屬本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.miR-17"5p在制備通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的表達(dá)抑制髓系來源抑制細(xì)胞積聚以抑制腫瘤 生長(zhǎng)的靶向藥物中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的miR-17-5p的新用途，其特征在于所述miR-17_5p在制備 通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞抑制結(jié)腸癌、肺癌或卵巢癌生長(zhǎng)的靶向藥物中的用途。
3.miR-20a在制備通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的表達(dá)抑制髓系來源抑制細(xì)胞積聚以抑制腫瘤生 長(zhǎng)的靶向藥物中的用途。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的miR-20a的新用途，其特征在于優(yōu)選的，所述miR_20a在制 備通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞抑制結(jié)腸癌、肺癌或卵巢癌生長(zhǎng)的靶向藥物中的用途。
全文摘要
miR-17-5p在制備通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的表達(dá)抑制髓系來源抑制細(xì)胞積聚以抑制腫瘤生長(zhǎng)的靶向藥物中的用途，即制備以miR-17-5p為靶點(diǎn)的藥物來抑制腫瘤生長(zhǎng)；miR-20a在制備通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的表達(dá)抑制髓系來源抑制細(xì)胞積聚以抑制腫瘤生長(zhǎng)的靶向藥物中的用途，即制備以miR-20a為靶點(diǎn)的藥物來抑制腫瘤生長(zhǎng)，對(duì)腫瘤臨床免疫治療有著潛在的巨大應(yīng)用價(jià)值，并且為進(jìn)一步研究miR-17-5p和miR-20a的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102038703SQ20101055165
公開日2011年5月4日 申請(qǐng)日期2010年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月27日
發(fā)明者劉喬飛, 張園, 張苗苗, 楊榮存, 王萌萌, 陳穎瑩 申請(qǐng)人:南開大學(xué)