專利名稱：長(zhǎng)效生長(zhǎng)激素釋放因子衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生長(zhǎng)激素釋放因子(GRF)衍生物。特別的，本發(fā)明涉及具有體內(nèi)半衰期延長(zhǎng)的GRF肽衍生物，用于促進(jìn)人和動(dòng)物體內(nèi)源性產(chǎn)生或釋放生長(zhǎng)激素。
背景技術(shù)：
生長(zhǎng)激素(GH)也叫做促生長(zhǎng)素，是一種由腺垂體的促生長(zhǎng)激素細(xì)胞合成和分泌的大約190個(gè)氨基酸的蛋白激素。它是控制生長(zhǎng)和代謝的一種主要參與者。它也是用于人和動(dòng)物的重要藥用產(chǎn)物。GH的產(chǎn)生受多種因素的調(diào)節(jié)，其中包括應(yīng)激、營養(yǎng)、睡眠以及GH自身。但是其主要控制者是兩種下丘腦激素-生長(zhǎng)激素釋放因子(GRF或GHRH)，其是刺激GH合成和釋放的44個(gè)氨基酸的序列，和；-抑生長(zhǎng)素(SS)，響應(yīng)于GRF其抑制GH釋放。
GRF(1-44)的生物活性已表明存在于肽的N末端區(qū)。采用GRF(1-29)在體內(nèi)和體外也證實(shí)有全部?jī)?nèi)在的活性和效力。此外，持續(xù)給藥GRF誘導(dǎo)從腦下垂體與正常生理?xiàng)l件下相同的陣發(fā)式分泌模式。近來，由Merck和其它的制藥公司開發(fā)的合成肽，例如生長(zhǎng)激素釋放肽(GHRP)和模擬肽(peptidomimetics)已經(jīng)闡述了其能夠刺激內(nèi)源性GH的釋放。由Hoffmann-La Roche在80年代中期開發(fā)的另一種三取代的GRF1-29類似物，[脫-氨基-Tyr1，D-Ala2，Ala15]-GRF1-29，是一種具有長(zhǎng)效活性的GRF超級(jí)激動(dòng)劑。
已知GH促分泌素(GHS)通過一種孤兒G-蛋白偶聯(lián)受體(GHS-R)刺激GH從垂體釋放。近來，用于GHS-R的另一個(gè)內(nèi)源性配體被鑒定為饑餓激素(ghrelin)，它是一種辛?；?在Ser3位有n-辛?；?8-殘基肽)。
重組GH(rGH)最早在1985年生產(chǎn)，現(xiàn)在市場(chǎng)上醫(yī)用和獸醫(yī)用的rGH有售。但是還沒有長(zhǎng)效安全的rGH。此外，已經(jīng)報(bào)道在人體使用rGH導(dǎo)致的一些副作用，即左心室質(zhì)量指數(shù)、血清脂蛋白的升高以及免疫參數(shù)的細(xì)微改變。最后，已知頻繁濃注rGH導(dǎo)致受體的漸進(jìn)性下調(diào)，因此隨著時(shí)間的流逝使其療效下降。
除了這些應(yīng)用上的缺點(diǎn)，外源性GH是物種特異性的，因此限制了其在不同物種即人和動(dòng)物中促進(jìn)生長(zhǎng)和其它有利影響的優(yōu)點(diǎn)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)少量的GRF導(dǎo)致主要垂體釋放GH到處理的動(dòng)物的血液中。因此，在這些顯示生長(zhǎng)激素的情形中GRF具有很好的治療價(jià)值。例如，它可用于治療垂體侏儒癥，由于GH產(chǎn)生異常導(dǎo)致的糖尿病，以及老化過程的延遲。受益于GRF內(nèi)源性產(chǎn)生和釋放的很多其他疾病或癥狀在下面列舉。此外，GRF也可用于農(nóng)業(yè)方面。農(nóng)業(yè)應(yīng)用的實(shí)例包括促進(jìn)豬、?；蝾愃频募倚蟮漠a(chǎn)肉以盡早進(jìn)入市場(chǎng)。已知GRF也可刺激奶牛的產(chǎn)奶量。
到目前為止，與肽-相關(guān)的GH促分泌素的使用相關(guān)的一個(gè)主要缺點(diǎn)是缺少一種合適的技術(shù)，其能夠在延長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)，例如幾天到幾星期，提供基本上線性和持續(xù)地遞送GH。
GRF(1-29)，就像很多其它具有治療特性的肽一樣，在體內(nèi)高度不穩(wěn)定，這就大大限制了其作為藥用產(chǎn)物在促進(jìn)人和動(dòng)物釋放GH中的應(yīng)用。因?yàn)镚RF 1-29的半衰期一般情況下不超過10-13分鐘，因此一天中必須若干次大劑量注射或輸注才能維持可檢測(cè)的GH的釋放。
在過去的這些年中已開展了大量的研究以試圖開發(fā)出長(zhǎng)效的GRF類似物。雖然合成了若干具有延長(zhǎng)作用時(shí)效的新的類似物，但是沒有一種滿足GH釋放藥品所需要的標(biāo)準(zhǔn)。另外，沒有一種制型已知在人或動(dòng)物體內(nèi)在一段確定的時(shí)間內(nèi)釋放這些不穩(wěn)定的肽。
US 5,846,936公開的GRF類似物據(jù)說具有增強(qiáng)的效力，提高的酶穩(wěn)定性和改進(jìn)的半衰期穩(wěn)定性。這個(gè)專利提及這些類似物可以用多種類似血清白蛋白的佐劑進(jìn)行給藥。專利中呈現(xiàn)的唯一半衰期穩(wěn)定結(jié)果是體外的。實(shí)際上沒有體內(nèi)肽穩(wěn)定性的數(shù)據(jù)。
US 4,963,529描述了一種GRF組合物，以液體或固體的形式，其包含GRF以及人血清白蛋白或甘氨酸。組合物中也可以包含緩沖液，據(jù)說可以穩(wěn)定GRF。
WO 9724445公開了將生長(zhǎng)激素(hGH)和重組白蛋白分子融合。這樣的融合蛋白據(jù)說較未融合的生長(zhǎng)激素提高了循環(huán)半衰期。任選可切割的連接物可以被插入到白蛋白和生長(zhǎng)激素的分子之間以促進(jìn)hGH和受體的連接。
WO 0069900公開了一種生產(chǎn)肽酶穩(wěn)定性肽的方法。一系列GRF肽被列舉作為可能的候選物，可通過本申請(qǐng)公開的方法加以穩(wěn)定，但是沒有一種在說明書中具體舉例。
因此迫切需要開發(fā)一種能夠促進(jìn)GH在受試體、人或動(dòng)物體內(nèi)釋放的長(zhǎng)效化合物。這樣的促進(jìn)應(yīng)該優(yōu)選持續(xù)一段延長(zhǎng)的時(shí)間而沒有rGH不受歡迎的副作用。
發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明，提供了一種生長(zhǎng)激素釋放因子(GRF)衍生物，其與相應(yīng)的未修飾的(或天然的)GRF肽序列比較有延長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期。更具體而言，該衍生物包括一種GRF肽或其類似物，它含有與其偶聯(lián)的反應(yīng)實(shí)體并能夠與一種血液組分上的有效官能團(tuán)，在體內(nèi)或體外形成穩(wěn)定共價(jià)鍵。反應(yīng)實(shí)體可被偶聯(lián)到肽的N-末端、C-末端或沿著肽鏈的任何其他有效的位置。
優(yōu)選的血液組分含有類似免疫球蛋白的蛋白，包括IgG和IgM、血清白蛋白、鐵蛋白、類固醇結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、甲狀腺素結(jié)合蛋白、α-2-巨球蛋白等，更優(yōu)選血清白蛋白和IgG，以及血清白蛋白是最優(yōu)選的。
優(yōu)選的反應(yīng)實(shí)體能夠在體內(nèi)或體外(或離體)與血液組分上存在的氨基、羥基或巰基反應(yīng)形成共價(jià)鍵。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，蛋白的官能團(tuán)為巰基，反應(yīng)實(shí)體為Michael受體，如丙稀醛衍生物、α，β-不飽和酮、α，β-不飽和酰胺、α，β-不飽和酯、α，β-不飽和硫酯等，馬來酰亞胺或含馬來酰亞胺的基團(tuán)如γ-馬來酰亞胺-丁酰酰胺(GMBA)或馬來酰亞胺丙酸(MPA)是最優(yōu)選的。
本發(fā)明的另一方面提供了一種藥物組合物，其包含該GRF衍生物和可藥用載體。該組合物用于促進(jìn)內(nèi)源性GH在受試者體內(nèi)的產(chǎn)生和釋放。該組合物也可用于生產(chǎn)藥用或獸藥用組合物以治療或預(yù)防由于GH產(chǎn)生異常導(dǎo)致的疾病或癥狀。下面列舉了這樣的疾病或癥狀。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種促進(jìn)GH在受試體、動(dòng)物或人中內(nèi)源性產(chǎn)生或釋放的方法。該方法包括對(duì)受試體單獨(dú)或與藥用載體結(jié)合給藥有效劑量的該GRF衍生物。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種治療或預(yù)防由于GH產(chǎn)生異常導(dǎo)致的疾病或癥狀，該方法包括對(duì)受試體單獨(dú)或與藥用載體結(jié)合給藥有效劑量的該GRF衍生物。
本發(fā)明的另一方面提供了一種包含共價(jià)連接到血液組分的該GRF衍生物的偶聯(lián)物。
本發(fā)明的另一方面提供了一種體內(nèi)延長(zhǎng)GRF肽在受試體內(nèi)半衰期的方法，該方法包括將該GRF衍生物共價(jià)連接到一種血液組分。共價(jià)連接可以發(fā)生在體內(nèi)也可發(fā)生在體外。
優(yōu)選的GRF是如GRF(1-44)和其類似物的肽，例如GHRP-6、海沙瑞林(Hexarelin)、饑餓激素、GHRP-1、IGF-1、IGF-2、B-HT920、GRF(1-29)和如下列舉的它們的類似物和片段，條件是任何這樣的類似物或片段具有與GRF基本相似的活性。根據(jù)本發(fā)明，所有在此引用作為參考的US 4,411,890；US 4,517,181；US 4,518,586；US4,528,190；US 4,529,595；US 4,563,352；US 4,585,756；US 4,595,676；US 4,605,643；US 4,610,976；US 4,626,523；US 4,628,043；US4,689,318；US 4,734,399；US 4,784,987；US 4,843,064；US 5,756,458；EP 0 188 214；WO 89/07110；WO 89/07111和WO 93/04081提供了適宜作為衍生物的其它的GRF類似物。
如果連接基團(tuán)存在于反應(yīng)實(shí)體和GRF肽之間，則將其無限制地優(yōu)選定義為直鏈或支鏈C1-10烷基；部分氟化或過氟化的直鏈或支鏈的C1-10烷基；C1-10烷基或氟烷基，其中一個(gè)或多個(gè)碳原子被O或S取代以形成醚或硫醚，例如-Z-CH2CH2-、-Z-CF2CH2-、-Z-CH2CF2-或-Z-CF2-CF2-其中Z為O或S；o-、m-或p-二取代苯基，其中取代基相同或不同，并且為CH2、O、S、NH、NR，其中R為H、C1-10烷基或C1-10?；换蚨〈s環(huán)，如呋喃、噻吩、吡喃、唑或噻唑。


圖1顯示用市售GRF(1-29)和實(shí)施例1和2的不同濃度的化合物培養(yǎng)4小時(shí)后，大鼠前原代細(xì)胞的GH分泌。
圖2顯示用市售D-Ala-GRF(1-29)和實(shí)施例3和4的不同濃度的化合物培養(yǎng)4小時(shí)后，大鼠前原代細(xì)胞的GH分泌。
圖3顯示用實(shí)施例5和6的不同濃度的化合物培養(yǎng)4小時(shí)后，大鼠前原代細(xì)胞的GH分泌。
圖4顯示用實(shí)施例7和8的不同濃度的化合物培養(yǎng)4小時(shí)后，大鼠前原代細(xì)胞的GH分泌。
圖5顯示單次皮下濃注(bolus injection)實(shí)施例1和2的化合物后，正常Sprague-Dawley大鼠的GH分泌。
圖6顯示單次皮下濃注實(shí)施例3和4的化合物后，正常Sprague-Dawley大鼠的GH分泌。
圖7顯示單次皮下濃注實(shí)施例5和6的化合物后，正常Sprague-Dawley大鼠的GH分泌。
圖8顯示單次皮下濃注后正常Sprague-Dawley大鼠的GH分泌(曲線下的總面積，AUC)。
圖9顯示雄性Sprague-Dawley大鼠中實(shí)施例5和6的化合物的藥代動(dòng)力學(xué)圖形。
本發(fā)明的詳細(xì)描述體內(nèi)生物偶聯(lián)是在體內(nèi)以一定方式將分子，如本發(fā)明GRF衍生物，共價(jià)結(jié)合到靶血液組分，優(yōu)選蛋白的過程，所述容許基本方式上保留原始未修飾的GRF的生物活性，同時(shí)通過給予GRF衍生物靶血液組分的生理參數(shù)而提供生物活性持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng)。
為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“類似物”是指氨基酸序列所含有的肽與天然GRF序列不同但是有相似或同等的活性。這樣的類似物優(yōu)選與相同數(shù)目氨基酸殘基的GRF或GRF片段的氨基酸序列有至少60％的相似性，更優(yōu)選至少有80％的相似性，以及最優(yōu)選至少有95％的相似性。
在一個(gè)較優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明GRF衍生物含有一個(gè)GRF肽，該GRF肽直接或通過一個(gè)連接基團(tuán)偶聯(lián)一個(gè)反應(yīng)實(shí)體而被修飾，反應(yīng)實(shí)體能與一種血液組分，優(yōu)選血液蛋白形成共價(jià)鍵。反應(yīng)實(shí)體必須在水環(huán)境中穩(wěn)定存在，其優(yōu)選的實(shí)施方案包括羧基、磷?；啺匪峄?imidate)或?；纬甚セ蚧旌萧?。共價(jià)鍵通常在反應(yīng)實(shí)體與血液組分上的氨基、羥基或巰基之間形成。氨基優(yōu)選與如羧基、磷?；蝓；姆磻?yīng)實(shí)體形成共價(jià)鍵；羥基優(yōu)選與活化酯的反應(yīng)實(shí)體形成共價(jià)鍵；以及巰基優(yōu)選與如酯或混合酐的反應(yīng)實(shí)體形成共價(jià)鍵。優(yōu)選的血液組分包括移動(dòng)的血液組分，例如血清白蛋白、免疫球蛋白或二者的混合物，優(yōu)選的反應(yīng)實(shí)體含有類似馬來酰亞胺基團(tuán)的酐，在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，血液組分為血清白蛋白。
血液組分優(yōu)選是移動(dòng)的，這就意味著血液組分不必在任何長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)有固定位置，一般不超過5分鐘，更經(jīng)常不超過1分鐘。這些血液組分不與膜相關(guān)并且在血液中以最低至少0.1μg/ml的濃度下存在較長(zhǎng)時(shí)間。優(yōu)選的移動(dòng)血液組分包括血清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、鐵蛋白和類似IgG和IgM的免疫球蛋白。移動(dòng)血液組分的半衰期至少約12小時(shí)。
因?yàn)楸景l(fā)明GRF衍生物包括一種肽，在衍生物的合成過程中可能需要保護(hù)基團(tuán)。這些保護(hù)基團(tuán)在肽合成領(lǐng)域是常規(guī)的，并且一般被描述為能夠防止肽衍生物與其自身反應(yīng)的化學(xué)部分。多種保護(hù)基團(tuán)都是市售的，其實(shí)例可在US 5,493,007找到，此處引作參考。適合作為保護(hù)基的典型例子包括乙酰基、9-芴甲氧羰基(FMOC)、叔-丁基氧羰基(BOC)、芐氧羰基(CBZ)等。表1提供了氨基酸的三字母和單字母縮寫。
表1天然氨基酸及其縮寫

本發(fā)明GRF衍生物與血液組分連接后形成了一種肽酶穩(wěn)定的長(zhǎng)效化合物。預(yù)期在添加反應(yīng)實(shí)體之前可以添加一個(gè)或多個(gè)其它的氨基酸，以促進(jìn)肽的偶聯(lián)。這樣的添加可以在C-末端、N-末端或二者之間進(jìn)行。這樣獲得的肽可被施用給受試者、動(dòng)物或人，從而在體內(nèi)發(fā)生與血液組分的偶聯(lián)，或者，首先在體外與受試者、動(dòng)物或人的血液組分相連，然后將得到的偶聯(lián)物或如下描述的長(zhǎng)效肽酶穩(wěn)定的肽衍生物施用給受試者。
GRF序列上取代或添加的任何氨基酸可以是D-氨基酸或L-氨基酸或其組合。一般優(yōu)選L-氨基酸。下列原始GRF肽序列(1-29)或(1-44)中的取代或突變代表本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，以獨(dú)立或組合方式第2位的D-丙氨酸；第8位的谷氨酰胺；第11位的D-精氨酸；第12位的(N-Me)Lys；第15位的丙氨酸和第27位的亮氨酸。
本發(fā)明也包括GRF片段，雖然其基本上同源于自然存在的GRF肽，但是可能在氨基端和/或羧基端缺少GRF天然肽自然存在的一個(gè)或多個(gè)其它的氨基酸。因此本發(fā)明涉及的GRF的多肽片段可能缺少GRF天然序列中正常存在的一個(gè)或多個(gè)其它的氨基酸，條件是，這樣的多肽具有優(yōu)選至少大體上與GRF等同的生長(zhǎng)激素釋放活性。
本發(fā)明也包括與上述類似物或片段具有明顯或細(xì)小區(qū)別的變體，其具有不重要的氨基酸取代(因此具有區(qū)別于天然序列的氨基酸序列)，條件是，這樣的變體具有與GRF基本相似的生長(zhǎng)激素釋放活性。明顯或細(xì)小取代的例子包括一個(gè)堿性殘基被另一個(gè)堿性殘基取代(即Arg取代Lys)，疏水殘基被另一個(gè)疏水殘基取代(即Leu取代Ile)，或者芳族殘基被另一個(gè)芳族殘基取代(即Phe取代Tyr)等。此外，其它微小的變體包括類似物，其中獲得了導(dǎo)致原始序列主要結(jié)構(gòu)類似的保守取代。這樣保守取代的例子包括但不限于谷氨酸取代天冬氨酸，反之亦然；谷氨酰胺取代天冬酰胺，反之亦然；絲氨酸取代蘇氨酸，反之亦然；賴氨酸取代精氨酸，反之亦然；或者任何異亮氨酸、纈氨酸和亮氨酸之間的彼此取代。
肽酶穩(wěn)定的GRF衍生物在體內(nèi)有肽酶存在的情況下，較相應(yīng)的非穩(wěn)定的GRF類似物更穩(wěn)定。通過將在血清中或血液中天然GRF類似物的半衰期與在血清中或血液中含有活性基團(tuán)的相應(yīng)衍生物的半衰期進(jìn)行比較來確定肽酶穩(wěn)定性。半衰期的測(cè)定方法是在給藥衍生物和非修飾的肽后取血清或全血樣品，以及確定每種化合物的活性。
更具體而言，本發(fā)明涉及GRF和相關(guān)肽的修飾以提高其生物利用率，在基本上不改變其顯著治療特性的情況下通過選擇性偶聯(lián)到一種血液組分而延長(zhǎng)其體內(nèi)半衰期和分布。
在一個(gè)較優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明適于衍生的GRF肽序列為下列序列A1-A2-Asp-A4-Ile-Phe-A7-A8-A9-Tyr-A11-A12-A13-Leu-A15-Gln-Leu-A18-Ala-A20-A21-A22-Leu-A24-A25-A26-A27-A28-A29-A30其中，A1為Tyr、N-Ac-Tyr、His、3-MeHis、脫氨基His、脫氨基Tyr、Lys-Tyr、Lys-His或Lys-3-MeHis；A2為Val、Leu、Ile、Ala、D-Ala、N-甲基-D-Ala、(N-甲基)-Ala、Gly、Nle或Nval；A4為Ala或Gly；A5為Met或Ile；A7為Asn、Ser或Thr；A8為Asn、Gln、Lys或Ser；A9為Ala或Ser；A11為Arg、D-Arg、Lys或D-Lys；A12為L(zhǎng)ys、(N-Me)Lys或D-Lys；A13為Val或Leu；A15為Ala、Leu或Gly；A18為Ser或Thr；A20為Arg、D-Arg、Lys或D-Lys；A21為L(zhǎng)ys、(N-Me)Lys或Asn；A22為Tyr或LeuA24為Gln或His；A25為Ser或Asp；
A26為L(zhǎng)eu或Ile；A27為Met、Ile、Leu或Nle；A28為Set、Asn、Ala或Asp；A29為L(zhǎng)ys或Arg；和A30為缺失、X或X-Lys，其中X缺失或者為序列Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu或其中的一個(gè)片段，其中該片段在C-末端被縮減了1到15個(gè)氨基酸；并且來自片段的一個(gè)氨基酸殘基可任選被一個(gè)lys殘基取代；以及其中的C-末端可以是游離羧酸或相應(yīng)的酰胺，限制條件是，如果A2為Ala，該片段就不是被縮減了5-8個(gè)氨基酸的片段。
本發(fā)明涉及具有體內(nèi)半衰期延長(zhǎng)的GRF衍生物的治療及相關(guān)應(yīng)用，特別適用于-提高生長(zhǎng)激素的水平；-通過給受試者施用本發(fā)明GRF衍生物類似物并檢測(cè)生長(zhǎng)激素反應(yīng)來診斷生長(zhǎng)激素缺陷；-治療垂體侏儒癥；-治療或預(yù)防生長(zhǎng)延遲；-加速骨折修復(fù)或傷口愈合；-加速燒傷患者或進(jìn)行大手術(shù)患者的恢復(fù)；-提高肌肉力量，活動(dòng)性，保持皮膚厚度，代謝平衡或腎平衡；-治療或預(yù)防充血性心力衰竭；-治療或預(yù)防與老化相關(guān)的虛弱；-治療或預(yù)防骨質(zhì)疏松癥；-治療或預(yù)防肥胖；-減少大手術(shù)后蛋白代射反應(yīng)；-減少慢性病導(dǎo)致的惡病質(zhì)和蛋白喪失；-提高蛋白合成代謝(包括節(jié)約蛋白作用)；-誘導(dǎo)脂解效應(yīng)；和/或-提升促生長(zhǎng)激素細(xì)胞功能。
上述所有方法均可用于人或動(dòng)物。
除了促進(jìn)生長(zhǎng)激素的內(nèi)源性產(chǎn)生或釋放，本發(fā)明GRF衍生物可能在GRF肽“主鏈”內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)摻入氨基酸取代，或者為GRF種的變體，其中C-末端和/或N-末端通過添加一個(gè)或多個(gè)堿性殘基而被改變，或者被修飾以摻入肽化學(xué)領(lǐng)域傳統(tǒng)使用的封閉基團(tuán)類型從而保護(hù)肽末端免于體內(nèi)不需要的生化攻擊和降解。因此，本發(fā)明GRF衍生物在任何GRF物種的情況下?lián)饺胍粋€(gè)氨基酸取代，包括但不限于人GRF、牛GRF、大鼠GRF、豬GRF等，很多作者都報(bào)告了它們的序列。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，一個(gè)賴氨酸殘基被添加到GRF肽序列的C-末端或N-末端。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，蛋白上的官能團(tuán)為巰基，反應(yīng)實(shí)體為馬來酰亞胺或含馬來酰亞胺的基團(tuán)例如γ-馬來酰亞胺-丁酰胺(GMBA)、馬來酰亞胺丙酸(MPA)、(2-氨基)乙氧基乙酸(AEA)-MPA、乙二胺(EDA)-MPA或[2-(2-氨基)乙氧基)]乙氧基乙酸(AEEA)-MPA和它們的組合物。組合的例子包括但不限于(AEEA-EDA)-MPA、(AEEA-AEEA)-MPA、(AEA-AEEA)-MPA等。
當(dāng)反應(yīng)混合物的pH保持在6.5和7.4之間，馬來酰亞胺基團(tuán)最適合在肽上選擇巰基。在pH 7.0，馬來酰亞胺基團(tuán)和巰基的反應(yīng)比率較與胺反應(yīng)快1000倍。馬來酰亞胺基團(tuán)和巰基之間形成的一個(gè)穩(wěn)定的巰醚鍵在生理?xiàng)l件下不能被切開。
本發(fā)明的GRF衍生物提供了血液組分的特異性標(biāo)記。這樣的特異性標(biāo)記，特別是用馬來酰亞胺基標(biāo)記的，有很多優(yōu)點(diǎn)。巰基在體內(nèi)較氨基少，其結(jié)果是馬來酰亞胺衍生物與較少量的蛋白共價(jià)結(jié)合。例如，在血清白蛋白中，每分子只有一個(gè)游離巰基。因此，GRF-馬來酰亞胺-白蛋白結(jié)合物往往包括約1∶1摩爾比的肽和白蛋白。除了白蛋白，IgG分子(II型)也有游離巰基。因?yàn)镮gG分子和血清白蛋白組成了血液中可溶蛋白的大部分，它們也組成了適于共價(jià)連接到馬來酰亞胺取代的GRF的游離巰基的大部分。
此外，即使在含游離巰基的血液蛋白中，馬來酰亞胺的特異標(biāo)記由于白蛋白本身的唯一特性導(dǎo)致肽-馬來酰亞胺-白蛋白結(jié)合物優(yōu)選形成。在物種內(nèi)高度保守的白蛋白單個(gè)游離巰基位于Cys34氨基酸殘基處。最近發(fā)現(xiàn)白蛋白的Cys34相對(duì)于其它含游離巰基的蛋白的游離巰基有增強(qiáng)的活性。這部分歸功于白蛋白Cys34的非常低的pK值5.5。這個(gè)值大大低于一般Cys殘基的典型pK值，大約為8。由于這個(gè)低pK值，在正常生理?xiàng)l件下，白蛋白的Cys34主要為離子化的形式，大大提高了其活性。除了Cys34的低pK值，另外一種加強(qiáng)Cys34活性的因素為其位點(diǎn)，其在接近于白蛋白V區(qū)的一個(gè)環(huán)的表面的裂縫內(nèi)。這個(gè)位點(diǎn)使得Cys34非常接近所有類型的配體，并且是Cys34作為自由基誘捕劑和游離巰基清除劑的一種重要因素。結(jié)果反應(yīng)速率的促進(jìn)可以比肽-馬來酰亞胺和其他含游離巰基的蛋白反應(yīng)速率高1000倍。
肽-馬來酰亞胺-白蛋白結(jié)合物的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是在Cys34處肽與白蛋白以1∶1特異性負(fù)載相關(guān)的可重復(fù)性。傳統(tǒng)的激活技術(shù)，例如用戊二醛、DCC、EDC和其它例如游離氨基的化學(xué)激活劑，就缺少這種選擇性。例如，白蛋白含有52個(gè)Lys殘基，其中25-30個(gè)位于白蛋白的表面，易于接近結(jié)合。這些Lys殘基的激活，或者通過這些Lys殘基偶聯(lián)修飾肽，就會(huì)產(chǎn)生大量的異質(zhì)結(jié)合物。即使采用等摩爾比的肽∶白蛋白(即1∶1)，最終的結(jié)果也是產(chǎn)生隨機(jī)的結(jié)合物，有時(shí)還出現(xiàn)白蛋白的每個(gè)分子連接的無數(shù)個(gè)肽的情況，并且每個(gè)結(jié)合物上，肽隨機(jī)地在25-30個(gè)合適的Lys位點(diǎn)中任一處偶聯(lián)。結(jié)果，表征準(zhǔn)確組成幾乎是不可能的，更不用提缺乏可重復(fù)性。此外，雖然看上去通過白蛋白的Lys殘基的結(jié)合物至少具有每個(gè)白蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)更多個(gè)治療劑的優(yōu)點(diǎn)，但是研究顯示治療劑和白蛋白的比率為1∶1是優(yōu)選的。在Stehle等，Anti-Cancer Drugs，1997，8，677-685的文獻(xiàn)中，其在此處全文引用，報(bào)道比率1∶1的抗癌氨甲蝶呤和白蛋白通過戊二醛結(jié)合獲得最好的結(jié)果。這些結(jié)合物被腫瘤細(xì)胞吸收，雖然結(jié)合物攜帶5∶1到20∶1的氨甲蝶呤分子改變了HPLC圖譜，并且在體內(nèi)被肝迅速吸收。因此似乎在更高比率處，白蛋白構(gòu)造的改變減少了其作為治療劑載體的有效性。
通過控制性給藥本發(fā)明GRF衍生物，特別是給藥含馬來酰亞胺反應(yīng)實(shí)體的GRF，特異性體內(nèi)標(biāo)記或結(jié)合白蛋白和IgG可被控制。在典型的給藥中，發(fā)現(xiàn)所給藥的肽衍生物的80-90％結(jié)合到白蛋白上，少于5％結(jié)合到IgG上。也出現(xiàn)游離巰基的痕量結(jié)合，例如谷胱甘肽。這樣的特異性結(jié)合在體內(nèi)應(yīng)用是優(yōu)選的，因?yàn)槟軌驕?zhǔn)確計(jì)算出所給藥的治療劑的確切半衰期。
除了提供控制的體內(nèi)特異性結(jié)合，馬來酰亞胺取代的GRF肽可以提供離體血清白蛋白和IgG的特異性標(biāo)記。這樣的離體結(jié)合包括添加馬來酰亞胺-肽到含有純化的血液組分例如血清白蛋白和/或IgG的血液，血清或鹽溶液中。在優(yōu)選的形式下，衍生物任選通過一個(gè)連接基團(tuán)被馬來酰亞胺取代，并且在鹽溶液中與血清白蛋白反應(yīng)。一旦離體用本發(fā)明GRF衍生物進(jìn)行了修飾，血液、血清或鹽溶液可以被重新給藥到血液用于體內(nèi)治療。
在水溶液和游離氨基的存在下，馬來酰亞胺取代的GRF肽一般非常穩(wěn)定。因?yàn)轳R來酰亞胺取代的GRF肽和游離巰基反應(yīng)，不需要保護(hù)基團(tuán)來阻止它們和自身反應(yīng)。此外，肽衍生物穩(wěn)定性的提高允許使用類似HPLC的進(jìn)一步的純化過程以制備適于體內(nèi)應(yīng)用的高度純化的產(chǎn)物。最后，化學(xué)穩(wěn)定性的提高提供了具有更長(zhǎng)保存期的產(chǎn)物。
GRF衍生物與血液組分的目的結(jié)合物可以通過將衍生物體內(nèi)直接施用給受試者進(jìn)行制備，受試者可以是動(dòng)物或人。給藥可以以大丸劑的方式進(jìn)行，或者采用計(jì)量流量輸注的方式隨時(shí)間慢慢導(dǎo)入等。
或者，結(jié)合物的制備也可體外通過將血液或商業(yè)上可用的純化血液組分與本發(fā)明GRF衍生物結(jié)合進(jìn)行，使得GRF衍生物與血液組分的官能團(tuán)的共價(jià)結(jié)合，并且將共價(jià)結(jié)合的血液或共價(jià)結(jié)合的純化的血液組分返回或施用給宿主。此外，上述過程的完成可以首先純化單個(gè)血液組分或限制數(shù)量的血液組分，例如紅細(xì)胞、免疫球蛋白、血清白蛋白等，然后離體將一種或多種組分與本發(fā)明化合物衍生物結(jié)合。標(biāo)記的血液或血液組分可被返回給受試者以體內(nèi)提供治療有效的結(jié)合物。血液也可被處理以預(yù)防在離體操作過程中的凝固。肽合成GRF肽的合成可以通過本領(lǐng)域任何普通技術(shù)人員公知的固相肽化學(xué)的常規(guī)方法進(jìn)行。比如，肽的合成可以通過固相化學(xué)技術(shù)遵循Steward等在Solid Phase Peptide Synthesis，第二版，Pierce Chemical Company，Rockford，Ill.，(1984)描述的過程，使用Applied Biosystem合成儀進(jìn)行。類似地，肽片段合成被結(jié)合或連在一起形成較大的肽。這些合成的肽片段也可以在特定位點(diǎn)進(jìn)行氨基酸取代來制備。
對(duì)于固相肽合成，可以在Stewart等″Solid Phase PeptideSynthesis″，W.H.Freeman Co.(San Francisco)，1963和Meienhofer，Hormonal Proteins and Peptides，1973，2 46中找到很多技術(shù)的綜述。對(duì)于經(jīng)典的溶液合成，參見例如Schroder等″The Peptides″，第1卷，Acacemic Press(New York)。一般情況下，這樣的方法包括后續(xù)添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸或合適保護(hù)的氨基酸到一個(gè)正在生成的肽鏈。正常情況下，第一個(gè)氨基酸的氨基或羧基通過合適的保護(hù)基團(tuán)加以保護(hù)。被保護(hù)或衍生的氨基酸在適于形成酰胺鍵的條件下通過在具有恰當(dāng)保護(hù)的互補(bǔ)基團(tuán)(氨基或羧基)的序列上添加下一個(gè)氨基酸或被吸著到惰性固相支持物或在溶液中被利用。然后保護(hù)基團(tuán)被從這個(gè)新加入的氨基酸殘基上移走，加入另一個(gè)氨基酸(經(jīng)適當(dāng)保護(hù)的)，反復(fù)進(jìn)行。
所有目的氨基酸被連接到正確的序列后，任何剩下的保護(hù)基團(tuán)(和任何固相支持物)隨后或者同時(shí)被移走以提供最終的多肽。通過這個(gè)一般過程的簡(jiǎn)單修飾，可以每次加入一個(gè)以上的氨基酸到生成的鏈上，比如，在去保護(hù)后通過用一個(gè)被正確保護(hù)的二肽偶聯(lián)(在不使手性中心外消旋的條件下)一個(gè)被正確保護(hù)的三肽而形成五肽。
制備本發(fā)明GRF衍生物的一個(gè)特別優(yōu)選的方法包括固相肽合成，其中氨基酸α-N-末端被一個(gè)酸性或堿性敏感的基團(tuán)保護(hù)。這樣的保護(hù)基團(tuán)應(yīng)該具有的特征是，雖然在沒有破壞生成的肽鏈或使得任何其中包含的手性中心消旋的情況下很容易移走，但是對(duì)于肽鍵形成的條件是穩(wěn)定的。N-保護(hù)基團(tuán)和C-保護(hù)基團(tuán)的例子公開于Greene，″Protective Groups In Organic Synthesis，″(John Wiley&Sons，New York第152-186頁(1981))，將其在此引作參考。N-保護(hù)基團(tuán)的例子包括但不限于，低級(jí)烷?；?，甲酰基、乙酰基(“Ac”)、丙酰基、特戊?；?、叔-丁基乙?；龋黄渌；?-氯乙?；?-溴乙?；⑷阴；⑷纫阴；⑧彵蕉柞；?、鄰硝基苯氧乙?；?、氯丁?；?、苯甲?；?-氯苯甲?；?、4-溴苯甲?；?-硝基苯甲?；?；磺?；绫交酋；?、對(duì)甲苯磺?；?、鄰硝基苯磺酰基、2，2，5，7，8-五甲基苯并二氫吡喃-6-磺酰基(pmc)等；氨基甲酸酯形成基團(tuán)，例如叔-戊氧羰基、苯甲基氧羰基、對(duì)氯苯甲基氧羰基、對(duì)甲氧基苯甲基氧羰基、對(duì)硝基苯甲基氧羰基、2-硝基苯甲基氧羰基、對(duì)溴苯甲基氧羰基、3，4-二甲氧基苯甲基氧羰基、3，5-二甲氧基苯甲基氧羰基、2，4-二甲氧基苯甲基氧羰基、4-乙氧基苯甲基氧羰基、2-硝基-4，5-二甲氧基苯甲氧羰基、3，4，5-三甲氧基苯甲氧羰基、1-(對(duì)聯(lián)苯基)-1-甲基乙氧羰基、α，α-二甲基-3，5-二甲氧基苯甲氧羰基、二苯甲基氧羰基、叔丁氧羰基(boc)、二異丙基甲氧基羰基、異丙基氧羰基、乙氧羰基、甲氧羰基、烯丙氧羰基、2，2，2-三氯乙氧羰基、苯氧羰基、4-硝基苯氧羰基、芴基-9-甲氧基羰基、異冰片基氧羰基、環(huán)戊氧羰基、金剛烷氧羰基、環(huán)己基氧羰基、苯基硫羰基等；芳烷基例如苯甲基、二苯基異丙基氧羰基、三苯基甲基、苯甲基氧甲基、9-芴甲基氧羰基(Fmoc)等和甲硅烷基例如三甲基甲硅烷基等。優(yōu)選的α-N-保護(hù)基是鄰硝基苯氧硫基；9-芴甲基氧羰基叔丁基氧羰基(boc)；異冰片基氧羰基；3，5-二甲氧苯甲氧羰基；叔戊基氧羰基；2-氰基-叔丁基氧羰基等，其中9-芴基甲基氧羰基(Fmoc)是更優(yōu)選的，而優(yōu)選的側(cè)鏈N-保護(hù)基包含2，2，5，7，8-五甲基苯并二氫吡喃-6-磺酰基(pmc)、硝基、對(duì)甲苯磺?；?、4-甲氧苯-磺酰基、Cbz、Boc和金剛烷氧羰基用作側(cè)鏈氨基如同賴氨酸和精氨酸；芐基、鄰溴芐基氧羰基、2，6-二氯芐基、異丙基、叔丁基(t-Bu)、環(huán)己基、環(huán)戊基和乙?；?Ac)用于酪氨酸；叔丁基、芐基和四氫吡喃基用于絲氨酸；三苯甲基、芐基、Cbz、對(duì)甲苯磺酰和2，4-二硝基苯基用于組氨酸；甲?；糜谏彼幔黄S基和叔丁基用于天冬氨酸和谷氨酸；以及三苯甲基(trityl)用于半胱氨酸。
傳統(tǒng)的羧基保護(hù)基是指羧酸保護(hù)酯或酰胺基。這樣的保護(hù)基團(tuán)對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是公知的，已經(jīng)廣泛用于青霉素和頭孢菌素領(lǐng)域羧基的保護(hù)，如US 3,840,556和3,719,667中所述，其公開物在此引作參考。代表性的羧基保護(hù)基包括但不限于C1-C8低級(jí)烷基；芳烷基例如苯乙基或芐基及其取代的衍生物，例如烷氧苯甲基或硝基芐基；芳烯基例如苯乙烯基；芳基及其取代的衍生物例如5-茚基；二烷基氨基烷基例如二甲基氨基乙基；烷?；跬榛缫阴Ｑ跫谆⒍□Ｑ跫谆?、戊酰氧甲基、異丁酰氧甲基、異戊酰氧甲基、1-(丙酰氧)-1-乙基、1-(新戊酰氧基)-1-乙基、1-甲基-1-(丙酰氧基)-1-乙基，新戊酰氧甲基、丙酰氧甲基；環(huán)烷?；跬榛绛h(huán)丙基羰基氧甲基、環(huán)丁基羰基氧甲基、環(huán)戊基羰基氧甲基、環(huán)己基羰基氧甲基；芳?；跬榛绫郊柞；跫谆?、苯甲?；跻一?；芳烷基羰基氧烷基例如芐基羰基氧甲基、2-芐基羰基氧乙基；烷氧基羰基烷基或環(huán)烷氧基羰基烷基例如甲氧基羰基甲基、環(huán)己氧基羰基甲基、1-甲氧基羰基-1-乙基；烷氧基羰基氧烷基或環(huán)烷基氧羰基氧烷基例如甲氧基羰基氧甲基、叔丁氧基羰基氧甲基、1-乙氧基羰基氧-1-乙基、1-環(huán)己基氧羰基氧-1-乙基；芳氧基羰基氧烷基例如2-(二氮雜菲氧羰基氧)-乙基、2-(5-茚基氧羰基氧)-乙基；烷氧基烷基羰基氧烷基例如2-(1-甲氧基-2-甲基丙烷-2-?；?-乙基；芳烷基氧羰基氧烷基例如2-(芐氧基羰基氧)乙基；芳烯基氧羰基氧烷基例如2-(3-苯基丙烯-2-基氧羰基氧)乙基；烷氧基羰基氨基烷基例如叔丁氧基羰基氨甲基；烷基氨基羰基氨基烷基例如甲基氨基羰基氨甲基；烷?；被榛缫阴；奔谆?；雜環(huán)羰基氧烷基例如4-甲基哌嗪基羰基氧甲基；二烷基氨基羰基烷基例如二甲基氨基羰基甲基、二乙基氨基羰基甲基；(5-(低級(jí)烷基)-2-氧-1，3-dioxolen-4-yl)烷基例如(5-叔丁基-2-氧-1，3-dioxolen-4-yl)甲基；和(5-苯基-2-氧-1，3-dioxolen-4-yl)烷基例如(5-苯基-2-氧-1，3-dioxolen-4-yl)甲基。代表性的酰胺羧基保護(hù)基包含但不限于甲酰胺基和低級(jí)烷基氨基羰基。在以上所述的羧基保護(hù)基中，低級(jí)烷基，環(huán)烷基或芳烷基酯，例如甲酯、乙酯、丙酯、異丙酯、丁酯、仲丁酯、異丁酯、戊酯、異戊酯、辛酯、環(huán)己酯、苯乙酯等或烷?；跬榛h(huán)烷?；跬榛⒎减；跬榛蚍纪榛驶跬榛ナ莾?yōu)選的。優(yōu)選的酰胺羧基保護(hù)基是低級(jí)烷基氨基羰基。
在固相肽合成方法中，α-C-末端氨基酸被附著到一個(gè)合適的固相支持物或樹脂上。用于上述合成的合適的固相支持物對(duì)于化學(xué)試劑和逐步縮合-去保護(hù)反應(yīng)是惰性的，也不能溶于使用的介質(zhì)。合成α-C-末端羧基肽的優(yōu)選固相支持物為羥甲基苯氧基甲基-共聚(苯乙烯-1％二乙烯基苯)。用于α-C-末端酰胺肽優(yōu)選的固相支持物是4-(2′，4′-二甲氧基苯基-Fmoc-氨甲基)苯氧基乙酰氨基乙基樹脂，可以從AppliedBiosystems(Foster City，Calif.)獲得。該α-C-末端氨基酸，通過N，N′二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、N，N′-二異丙基碳二亞胺(DIC)或O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基脲-六氟磷酸鹽(HBTU)，有或者沒有4-二甲基氨基吡啶(DMAP)、1-羥基苯并三唑(HOBT)、苯并三氮唑-1-基氧-三(二甲基氨基)磷鎓-六氟磷酸鹽(BOP)或二(2-氧-3-唑烷基)膦氯化物(BOPCl)被偶聯(lián)到樹脂上，偶聯(lián)反應(yīng)在例如二氯甲烷或DMF的溶劑中10℃-50℃溫度下進(jìn)行約1-約24小時(shí)。
當(dāng)固相支持物是4-(2′，4′-二甲氧苯基-Fmoc-氨甲基)-苯氧基-乙酰氨基乙基樹脂時(shí)，在如上所述與α-C末端氨基酸偶聯(lián)之前，將Fmoc基團(tuán)用仲胺，優(yōu)選呱啶切割。用于結(jié)合到去保護(hù)的4-(2′，4′-二甲氧苯基-Fmoc-氨甲基)苯氧基-乙酰氨基乙基樹脂的優(yōu)選方法為在DMF中的O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU，1當(dāng)量)、二異丙基乙胺(DIEA，1當(dāng)量)，和任選1-羥基苯并三唑(HOBT，1當(dāng)量)。保護(hù)氨基酸的連續(xù)偶聯(lián)可以本領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)方式在全自動(dòng)多肽合成儀上進(jìn)行。
從正在生成的α-N-末端移走Fmoc保護(hù)基團(tuán)傳統(tǒng)上是通過，例如仲胺，優(yōu)選呱啶處理來完成的。導(dǎo)入約三倍摩爾過量的每種被保護(hù)的氨基酸，偶聯(lián)優(yōu)選在DMF中進(jìn)行。偶聯(lián)劑通常是O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU，1當(dāng)量)、二異丙基乙胺(DIEA，1當(dāng)量)和任選1-羥基苯并三唑(HOBT，1當(dāng)量)。
在固相合成結(jié)束后，將肽從樹脂上移走然后去保護(hù)，連續(xù)性操作或單獨(dú)操作皆可。多肽的移去和去保護(hù)可用傳統(tǒng)的單獨(dú)操作完成，即用含苯硫基甲烷、三異丙基硅烷、苯酚和三氟乙酸的切割試劑處理樹脂結(jié)合的多肽。在多肽的α-C-末端為烷基酰胺時(shí)，樹脂用烷基胺進(jìn)行氨解切割?；蛘?，肽可以例如用甲醇，通過酯交換作用被移走，接著通過氨解或者直接轉(zhuǎn)酰氨基作用進(jìn)行。被保護(hù)的肽可以在這點(diǎn)上被純化或者直接進(jìn)入下一個(gè)步驟。側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)的移去通過上述的切割混合物來完成。完全去保護(hù)的肽的純化通過色譜步驟順序采用任何或者所有下列類型進(jìn)行在弱堿性樹脂上的離子交換(醋酸鹽的形式)；在未衍生化的聚苯乙烯-二乙烯基苯(例如Amberlite KADTM)上的疏水吸附色譜；硅膠吸附色譜；在羧甲基纖維素上的離子交換色譜；例如在Sephadex G-25TM，LH-20TM上的分配色譜，或反流分布法；高效液相色譜法(HPLC)，特別是在辛基-或十八烷基甲硅烷基-二氧化硅鍵合相柱填充物上的反相HPLC。任何本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將能容易地確定什么是獲得可接受的提純GRF肽所要求的優(yōu)選色譜步驟和順序。
用四極電噴霧(Quadrupole Electro Spray)質(zhì)譜確定這些肽的分子量。
用于生產(chǎn)本發(fā)明GRF衍生物的合成過程變化很廣泛，依賴于各種因素的性質(zhì)，即GRF衍生物中所含的GRF序列、連接基團(tuán)和反應(yīng)實(shí)體。為了確保簡(jiǎn)化、高產(chǎn)和可重復(fù)性以及保證高純度的產(chǎn)物，對(duì)合成程序加以選擇。正常情況下，在合成的最后階段，使化學(xué)反應(yīng)基團(tuán)偶聯(lián)。用于生產(chǎn)本發(fā)明GRF衍生物的特別方法在下面描述。
必須將化學(xué)反應(yīng)實(shí)體放在一個(gè)位點(diǎn)上，以使肽結(jié)合到血液組分上，同時(shí)保持原始GRF肽的主要部分，如果不是全部的話，活性和/或有益效果。
在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，每種GRF衍生物的合成將根據(jù)下列標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行如果末端羧基對(duì)于肽是合適的，而且對(duì)于保持藥理活性是不重要的，以及在肽上沒有其它的敏感官能團(tuán)，那么羧酸就被選作連接位點(diǎn)用于連接基團(tuán)—反應(yīng)實(shí)體修飾。如果末端羧基參與藥理活性，或者沒有合適的羧酸，那么，任何其它的對(duì)于保持藥理活性不重要的敏感官能團(tuán)將被選擇作為連接位點(diǎn)用于連接基團(tuán)—反應(yīng)實(shí)體的修飾。如果肽上有若干敏感官能團(tuán)是合適的，將使用保護(hù)基團(tuán)的組合，其使用方式是在加入連接基團(tuán)/反應(yīng)實(shí)體并對(duì)所有被保護(hù)的敏感官能團(tuán)去保護(hù)后，依然能夠保留藥理活性。如果肽上沒有合適的敏感官能團(tuán)，應(yīng)該試圖進(jìn)行合成以對(duì)原始肽進(jìn)行修飾，采用的方式是保留生物活性和保留受體或靶的特異性。在這種情況下，修飾應(yīng)優(yōu)選發(fā)生在肽的相對(duì)末端。
本發(fā)明GRF衍生物可以單獨(dú)使用也可以與其它的藥物或藥用產(chǎn)品結(jié)合使用以使得它們的治療效果最優(yōu)化。它們可以生理?xiàng)l件下可接受的介質(zhì)給藥，例如，去離子水、磷酸鹽緩沖液(PBS)、鹽水、含水乙醇或其它醇類、血漿、擬蛋白質(zhì)(proteinaceous)溶液、甘露醇、含水葡萄糖、醇、植物油等。其它可能含有的添加劑包括緩沖液，其中介質(zhì)緩沖液的pH范圍通常大約為5到10，緩沖液濃度一般是約50到250mM；鹽，其中鹽的濃度范圍一般是約5到500mM，生理上可接受的穩(wěn)定劑等。為了方便儲(chǔ)存和運(yùn)輸，組合物可以被凍干。
本發(fā)明肽衍生物可以通過口服、腸胃外給藥，例如血管內(nèi)(IV)、動(dòng)脈內(nèi)(IA)、肌內(nèi)(IM)、皮下(SC)等方式給藥。在合適的情況下，可以通過輸液的方式給藥。一些情況下，官能團(tuán)的反應(yīng)相對(duì)較慢，給藥可以通過口服、鼻、直腸、經(jīng)皮、氣霧劑進(jìn)行，其中結(jié)合物的特性容許轉(zhuǎn)運(yùn)到血管系統(tǒng)。雖然如果需要可以使用多于一次注射，但一般采用單次注射?？梢杂萌魏蝹鹘y(tǒng)的方式給藥肽衍生物，包括注射、套針、導(dǎo)管等。給藥的特殊方式可以根據(jù)給藥量是單次推注給藥還是連續(xù)給藥等而變化。優(yōu)選的給藥方式為血管內(nèi)，導(dǎo)入的位點(diǎn)對(duì)于本發(fā)明不重要，優(yōu)選的位點(diǎn)是該位點(diǎn)血流速度快，例如靜脈內(nèi)、外圍或中央靜脈。也發(fā)現(xiàn)了其它的途徑，給藥與緩釋技術(shù)或者保護(hù)性基質(zhì)結(jié)合。為了能夠與血液組分反應(yīng)，目的是肽可被有效地分配到血液中。結(jié)合物的濃度變化很大，一般范圍是從大約1pg/ml到50mg/ml。血管內(nèi)的總給藥量一般范圍是從大約0.1mg/ml到大約10mg/ml，更普遍的是從大約1mg/ml到大約5mg/ml。
通過結(jié)合到血液中的長(zhǎng)壽成分，例如免疫球蛋白、血清白蛋白、紅細(xì)胞和血小板，結(jié)果產(chǎn)生很多優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明肽衍生物的活性持續(xù)數(shù)天，有可能持續(xù)長(zhǎng)達(dá)幾星期。在這段時(shí)間內(nèi)只需要一次給藥。能夠得到更大的特異性，因?yàn)榛钚曰衔镏饕Y(jié)合在大分子上，不大可能被細(xì)胞內(nèi)吸收來參與其它的生理過程。
可對(duì)哺乳動(dòng)物宿主的血液中肽的活性和/或肽衍生物的存在進(jìn)行監(jiān)測(cè)。通過在不同的時(shí)間采集宿主血液的部分或樣品，人們可以確定肽是否已經(jīng)以治療活性的足夠量結(jié)合到長(zhǎng)壽的血液成分上，以及其后血液中肽的水平。如果需要，人們也可以確定肽共價(jià)結(jié)合到哪一種血液組分。對(duì)于特異性馬來酰亞胺取代的肽，僅僅需要簡(jiǎn)單計(jì)算血清白蛋白和IgG的半衰期。也可利用檢測(cè)肽的活性，HPLC-MS或針對(duì)肽的抗體進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
本發(fā)明的另一方面涉及利用特異于本發(fā)明肽的抗體確定在生物樣品(如血液)中GRF肽或其結(jié)合物的濃度的方法，和涉及以這樣的抗體作為一種治療方法用于治療與這樣的肽或結(jié)合物可能有關(guān)的毒性。這是有利的，因?yàn)樵诓∪梭w內(nèi)GRF衍生物延長(zhǎng)的存在和壽命可能導(dǎo)致在治療中新的問題出現(xiàn)，包括毒性有可能增加。通過利用對(duì)特殊衍生物具有特異性的單克隆或多克隆的“抗衍生物”抗體可以幫助調(diào)節(jié)任何這樣的問題。該抗體可能產(chǎn)生或來源于一宿主，該宿主被特殊修飾的肽，或藥物的免疫原性片段，或?qū)?yīng)于藥物的抗原決定簇的合成的免疫原免疫。優(yōu)選的抗體應(yīng)該對(duì)該肽衍生物的天然、衍生和結(jié)合形式具有高的特異性和親合性。這樣的抗體還可以被酶、熒光染料或放射性標(biāo)記標(biāo)記。
特異于GRF衍生物的抗體可以通過使用純化的肽誘導(dǎo)衍生的肽特異抗體來產(chǎn)生。通過誘導(dǎo)抗體，其目的不僅是通過注射動(dòng)物刺激免疫反應(yīng)，而且是類似的步驟生產(chǎn)合成抗體或其他特異性結(jié)合分子，例如篩選重組免疫球蛋白文庫。單克隆和多克隆的抗體可以通過本領(lǐng)域公知的程序來生產(chǎn)。
該抗體也可以用來監(jiān)控衍生物在血流中的存在。血液和/或血清樣品可以通過SDS-PAGE和western印跡進(jìn)行分析。這些技術(shù)可以用來分析血液或血清以便確定該GRF衍生物和血液組分的結(jié)合。
該抗治療劑抗體也可以用來治療由該GRF衍生物給藥誘導(dǎo)的毒性，并可能被用在離體或體內(nèi)。離體方法包括使用被固定到固相支持物上的抗治療劑抗體免疫透析治療毒性。體內(nèi)方法包括給藥抗治療劑抗體，其量足以有效地誘導(dǎo)抗體藥物復(fù)合物的清除。
通過在無菌的條件下將血液與抗體接觸，該抗體可用來在離體從病人的血液除去GRF衍生物及其結(jié)合物。例如抗體可以被固定在一柱基質(zhì)上，然后從病人身上移出血液，并通過該基質(zhì)。該GRF衍生物將與該抗體結(jié)合，然后含低濃度該GRF衍生物的血液可以被返回到該病人的循環(huán)系統(tǒng)。除去的GRF衍生物的量可以通過調(diào)節(jié)壓力和流速而得到控制。從一病人血液的血漿組分優(yōu)選移去該GRF衍生物可以實(shí)現(xiàn)，例如，通過利用半透膜，或者另外在將血漿組分通過含抗治療抗體的基質(zhì)之前首先以本領(lǐng)域公知的方法從細(xì)胞組分分離血漿組分?；蛘撸瑑?yōu)選移出衍生物結(jié)合的包括紅血球的血細(xì)胞可以實(shí)現(xiàn)，即通過收集和濃縮病人血液中的血細(xì)胞并將這些細(xì)胞與固定的抗肽抗體接觸以排除病人血液的血清組分。
該抗肽抗體可以體內(nèi)腸胃外被給藥到一接受了GRF衍生物或結(jié)合物治療的病人?？贵w將結(jié)合GRF衍生物和結(jié)合物。一旦結(jié)合，如果不是完全封閉，該GRF衍生物活性將被阻礙，從而減少GRF衍生物在該病人血流中的生物有效濃度，并將有害的副作用降至最小。另外，該結(jié)合抗體-肽復(fù)合體將促進(jìn)GRF衍生物和結(jié)合物從該病人血流中清除。
提供下列實(shí)施例以闡明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，并決不被看作是限制其范圍。除非另外指出，采用L-構(gòu)型光學(xué)活性保護(hù)的氨基酸。合成在產(chǎn)生GRF衍生物過程中，GRF衍生物的合成是在SymphonyTM肽合成儀上利用全自動(dòng)固相程序并在人工介入下進(jìn)行的。合成是利用Fmoc-保護(hù)的氨基酸在Fmoe保護(hù)的RamageTM酰胺接頭樹脂上進(jìn)行。偶聯(lián)的完成采用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中的O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙胺(DIEA)作為激活劑混合物。Fmoc保護(hù)基利用20％的哌啶/DMF除去。必要時(shí)，Boc-保護(hù)的氨基酸被用在N末端，為了在肽從樹脂上切割后產(chǎn)生游離的Nα-末端。在合成中所用的全部氨基酸具有L-立體化學(xué)構(gòu)型，除非另有說明。合成中使用Sigmacoted玻璃反應(yīng)罐。
實(shí)施例1Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-CONH2步驟1固相肽的合成以100μmol量級(jí)進(jìn)行。下列保護(hù)的氨基酸按添加到樹脂上Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-IIe-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Boc-Tyr(tBu)-OH。它們?nèi)芙獾絅，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，并且根據(jù)順序，利用O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙胺(DIEA)激活。Fmoc保護(hù)基團(tuán)的移去利用20％(V/V)哌啶的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液20分鐘(步驟1)來完成。最終的氨基酸的氨基利用O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙胺(DIEA)激活的乙酸而乙酰化。
步驟2利用85％TFA/5％TIS/5％苯硫基甲烷和5％苯酚從樹脂上切割肽，然后用干冰冷的(0-4℃)Et2O進(jìn)行沉降。粗肽收集在聚丙烯燒結(jié)的漏斗內(nèi)，干燥，并重新溶解在40％乙腈的水(0.1％TFA)混合物中，然后冷凍干燥產(chǎn)生相應(yīng)粗提物，用于純化過程中。
實(shí)施例2實(shí)施例1的GRF肽的長(zhǎng)效衍生物
Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Lys(MPA)-CONH2步驟1實(shí)施這個(gè)步驟如同上述實(shí)施例1，除了加到樹脂上的第一個(gè)氨基酸為Fmoc-Lys(Aloc)-OH。
步驟2Lys(Aloc)基團(tuán)的選擇性去保護(hù)人工進(jìn)行，并且通過用溶解在5mL C6H6∶CHCl3(1∶1)2.5％NMM(v∶v)5％AcOH(v∶v)中的3當(dāng)量Pd(PPh3)4溶液處理樹脂2小時(shí)完成。然后樹脂用CHCl3(6×5mL)、20％AcOH的DCM(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗滌。
步驟3該合成加入3-馬來酰亞胺丙酸(MPA)而重新自動(dòng)進(jìn)行。每次偶聯(lián)之間，樹脂用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和異丙醇分別洗滌三次。
步驟4利用85％TFA/5％TIS/5％苯硫基甲烷和5％苯酚將衍生物從使用的樹脂上切割，然后通過干冰冷的(0-4℃)Et2O進(jìn)行沉降。粗衍生物收集在一聚丙烯燒結(jié)的漏斗中，干燥，重新溶解在40％乙腈的水(0.1％TFA)混合物中，冷凍干燥產(chǎn)生相應(yīng)的粗GRF衍生物，用于純化過程中。
實(shí)施例3Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-CONH2步驟1固相肽的合成以100μmole量級(jí)進(jìn)行。下列被保護(hù)的氨基酸按序以實(shí)施例1的步驟1中所述的程序加到樹脂上Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-MetOH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-(D)ala-OH、Boc-Tyr(tBu)-OH。
步驟2該步驟的實(shí)施方式與實(shí)施例1的步驟2相同。
實(shí)施例4實(shí)施例3的GRF肽的長(zhǎng)效衍生物Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Lys(MPA)-CONH2步驟1這個(gè)步驟的操作如同實(shí)施例3，除了加到樹脂上的第一個(gè)氨基酸為Fmoc-Lys(Aloc)-OH。
步驟2-4這些步驟的實(shí)施方式與實(shí)施例2的步驟2-4相同。
實(shí)施例5Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Ser-Arg-CONH2步驟1固相肽的合成以100μmole量級(jí)進(jìn)行。下列被保護(hù)的氨基酸按序以實(shí)施例1的步驟1所述的程序加到樹脂上Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-(D)ala-OH、Boc-Tyr(tBu)-OH。
步驟2該步驟的實(shí)施方式與實(shí)施例1的步驟2相同。
實(shí)施例6實(shí)施例5的GRF肽的長(zhǎng)效衍生物Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Ser-Arg-Lys(MPA)-CONH2步驟1這個(gè)步驟的操作如同實(shí)施例5，除了加到樹脂上的第一個(gè)氨基酸為Fmoc-Lys(Aloc)-OH。
步驟2-4這些步驟的實(shí)施方式與實(shí)施例2的步驟2-4相同。
實(shí)施例7Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-(D)Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Ser-Arg-CONH2步驟1固相肽的合成以100μmole量級(jí)進(jìn)行。下列被保護(hù)的氨基酸按序以實(shí)施例1的步驟1所述的程序加到樹脂上Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-(D)Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-(D)Ala-OH、Boc-Tyr(tBu)-OH。
步驟2該步驟的實(shí)施方式與實(shí)施例1的步驟2相同。
實(shí)施例8實(shí)施例7的GRF肽的長(zhǎng)效衍生物Tyr-(D)Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-(D)Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Ser-Arg-Lys(MPA)-CONH2步驟1這個(gè)步驟的操作如同實(shí)施例7，除了加到樹脂上的第一個(gè)氨基酸為Fmoc-Lys(Aloc)-OH。
步驟2-4這些步驟的實(shí)施方式與實(shí)施例2的步驟2-4相同。
實(shí)施例9Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-Arg-((N-Me)Lys)-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Ser-Arg-CONH2步驟1固相肽的合成以100μmole量級(jí)進(jìn)行。下列被保護(hù)的氨基酸按序以實(shí)施例1的步驟1所述的程序加到樹脂上Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-(N-Me)Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-(D)Ala-OH、Boc-Tyr(tBu)-OH。
步驟2該步驟的實(shí)施方式與實(shí)施例1的步驟2相同。
實(shí)施例10實(shí)施例9的GRF肽的長(zhǎng)效衍生物Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-Arg-((N-Me)Lys)-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Ser-Arg-Lys(MPA)-CONH2步驟1這個(gè)步驟的操作如同實(shí)施例9，除了加到樹脂上的第一個(gè)氨基酸為Fmoc-Lys(Aloc)-OH。
步驟2-4這些步驟的實(shí)施方式與實(shí)施例2的步驟2-4相同。
實(shí)施例11實(shí)施例9的GRF肽的第二種長(zhǎng)效衍生物Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-Arg-Lys(MPA)-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Ser-Arg-CONH2步驟1固相肽的合成以100μmole量級(jí)進(jìn)行。下列被保護(hù)的氨基酸按序以實(shí)施例1的步驟1所述的程序加到樹脂上Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys(Aloc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-(D)Ala-OH、Boc-Tyr(tBu)-OH。
步驟2-4這些步驟的實(shí)施方式與實(shí)施例2的步驟2-4相同。
實(shí)施例12(牛GRF)Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Asn-Arg-CONH2步驟1固相肽的合成以100μmole量級(jí)進(jìn)行。下列被保護(hù)的氨基酸按序以實(shí)施例1的步驟1所述的程序加到樹脂上Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-(D)ala-OH、Boc-Tyr(tBu)-OH。
步驟2該步驟的實(shí)施方式與實(shí)施例1的步驟2相同。
實(shí)施例13實(shí)施例12的GRF肽的長(zhǎng)效衍生物Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Asn-Lys(MPA)-CONH2步驟1這個(gè)步驟的操作如同實(shí)施例12，除了加到樹脂上的第一個(gè)氨基酸為Fmoc-Lys(Aloc)-OH。
步驟2-4這些步驟的實(shí)施方式與實(shí)施例2的步驟2-4相同。
實(shí)施例14(牛GRF)Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-CONH2步驟1固相肽的合成以100μmole量級(jí)進(jìn)行。下列被保護(hù)的氨基酸按序以實(shí)施例1的步驟1所述的程序加到樹脂上Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-(D)ala-OH、Boc-Tyr(tBu)-OH。
步驟2該步驟的實(shí)施方式與實(shí)施例1的步驟2相同。
實(shí)施例14實(shí)施例13的GRF肽的長(zhǎng)效衍生物Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-Lys(AEEA-MPA)-CONH2步驟1這個(gè)步驟的操作如同實(shí)施例13，除了加到樹脂上的第一個(gè)氨基酸為Fmoc-Lys(Aloc)-OH。
步驟2Lys(Aloc)基團(tuán)的選擇性去保護(hù)人工進(jìn)行，并且通過用溶解在5mL C6H6∶CHCl3(1∶1)2.5％NMM(v∶v)5％AcOH(v∶v)的3當(dāng)量Pd(PPh3)4溶液處理樹脂2小時(shí)(步驟2)完成。然后樹脂用CHCl3(6×5mL)、20％AcOH的DCM(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗滌。
步驟3該合成然后加入Fmoc-AEEA-OH(Fmoc-氨基乙氧基乙氧基醋酸)而重新自動(dòng)進(jìn)行。每次偶聯(lián)之間，樹脂用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和異丙醇分別洗滌三次。在正確去保護(hù)后，MPA(3-馬來酰亞胺丙酸)被固定在AEEA間隔區(qū)，然后樹脂再用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和異丙醇分別洗滌三次。
步驟4利用85％TFA/5％TIS/5％苯硫基甲烷和5％苯酚將衍生物從使用的樹脂上切割，然后通過干冰冷的(0-4℃)Et2O進(jìn)行沉降。粗衍生物收集在一聚丙烯燒結(jié)的漏斗，干燥，重新溶解在40％乙腈的水(0.1％TFA)混合物中，冷凍干燥產(chǎn)生相應(yīng)的粗GRF衍生物，用于純化過程中。
實(shí)施例15(牛GRF)Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-(D)arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-CONH2步驟1固相肽的合成以100μmole量級(jí)進(jìn)行。下列被保護(hù)的氨基酸按序以實(shí)施例1的步驟1所述的程序加到樹脂上Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-(D)arg(Pbf)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-(D)ala-OH、Boc-Tyr(tBu)-OH。
步驟2該步驟的實(shí)施方式與實(shí)施例1的步驟2相同。
實(shí)施例16實(shí)施例15的GRF肽的長(zhǎng)效衍生物Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-(D)arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-Lys(AEEA-MPA)-CONH2步驟1這個(gè)步驟的操作如同實(shí)施例15，除了加到樹脂上的第一個(gè)氨基酸為Fmoc-Lys(Aloc)-OH。
步驟2-4這些步驟的實(shí)施方式與實(shí)施例14的步驟2-4相同。
實(shí)施例17(牛GRF)Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-Arg-((N-Me)Lys)-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-CONH2步驟1固相肽的合成以100μmole量級(jí)進(jìn)行。下列被保護(hù)的氨基酸按序以實(shí)施例1的步驟1所述的程序加到樹脂上Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-(N-Me)Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-(D)ala-OH、Boc-Tyr(tBu)-OH。
步驟2該步驟的實(shí)施方式與實(shí)施例1的步驟2相同。
實(shí)施例18實(shí)施例17的GRF肽的長(zhǎng)效衍生物Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-Arg-(C(N-Me)Lys)-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-Lys(MPA)-CONH2步驟1這個(gè)步驟的操作如同實(shí)施例17，除了加到樹脂上的第一個(gè)氨基酸為Fmoc-Lys(Aloc)-OH。
步驟2-4這些步驟的實(shí)施方式與實(shí)施例2的步驟2-4相同。
實(shí)施例19
實(shí)施例17的GRF肽的第二種長(zhǎng)效衍生物Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-Arg-Lys(MPA)-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-CONH2步驟1固相肽的合成以100μmole量級(jí)進(jìn)行。下列被保護(hù)的氨基酸按序以實(shí)施例1的步驟1所述的程序加到樹脂上Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys(Aloc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-(D)ala-OH、Boc-Tyr(tBu)-OH。
步驟2-4這些步驟的實(shí)施方式與實(shí)施例2的步驟2-4相同。
實(shí)施例20(鮭魚GRF)His-(D)ala-Asp-Gly-Met-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Ser-Leu-Met-Ala-Lys-CONH2步驟1固相肽的合成以100μmole量級(jí)進(jìn)行。下列被保護(hù)的氨基酸按序以實(shí)施例1的步驟1所述的程序加到樹脂上Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-(D)ala-OH、Boc-His(Boc)-OH。
步驟2該步驟的實(shí)施方式與實(shí)施例1的步驟2相同。
實(shí)施例21實(shí)施例20的GRF肽的長(zhǎng)效衍生物His-(D)ala-Asp-Gly-Met-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Ser-Leu-Met-Ala-Lys(AEEA-MPA)-CONH2步驟1該步驟的實(shí)施如同實(shí)施例20。
步驟2-4這些步驟的實(shí)施方式與實(shí)施例14的步驟2-4相同。
實(shí)施例22(鮭魚GRF)實(shí)施例20的GRF肽的第二種長(zhǎng)效衍生物His-(D)ala-Asp-Gly-Met-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys(MPA)-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Ser-Leu-Met-Ala-Lys-CONH2步驟1固相肽的合成以100μmole量級(jí)進(jìn)行。下列被保護(hù)的氨基酸按序以實(shí)施例1的步驟1所述的程序加到樹脂上Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Lys(Aloc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-(D)ala-OH、Boc-His(Boc)-OH。
步驟2-4這些步驟的實(shí)施方式與實(shí)施例2的步驟2-4相同。
實(shí)施例23(雞GRF)His-(D)ala-Asp-Gly-Ile-Phe-Ser-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Leu-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Asn-Tyr-Leu-His-Ser-Leu-Met-Ala-Lys-CONH2步驟1固相肽的合成以100μmole量級(jí)進(jìn)行。下列被保護(hù)的氨基酸按序以實(shí)施例1的步驟1所述的程序加到樹脂上Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-(D)ala-OH、Boc-His(Boc)-OH。
步驟2該步驟的實(shí)施方式與實(shí)施例1的步驟2相同。
實(shí)施例24實(shí)施例23的GRF肽的長(zhǎng)效衍生物His-(D)ala-Asp-Gly-Ile-Phe-Ser-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Leu-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Asn-Tyr-Leu-His-Ser-Leu-Met-Ala-Lys(AEEA-MPA)-CONH2步驟1該步驟的實(shí)施如同實(shí)施例23。
步驟2-4這些步驟的實(shí)施方式與實(shí)施例14的步驟2-4相同。
實(shí)施例25實(shí)施例23的GRF肽的第二種長(zhǎng)效衍生物His-(D)ala-Asp-Gly-Ile-Phe-Ser-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys(MPA)-Leu-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Asn-Tyr-Leu-His-Ser-Leu-Met-Ala-Lys-CONH2步驟1固相肽的合成以100μmole量級(jí)進(jìn)行。下列被保護(hù)的氨基酸按序以實(shí)施例1的步驟1所述的程序加到樹脂上Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Aloc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-(D)ala-OH、Boc-His(Boc)-OH。
步驟2-4這些步驟的實(shí)施方式與實(shí)施例2的步驟2-4相同。
實(shí)施例26實(shí)施例1的GRF肽的第二種長(zhǎng)效衍生物(N-MPA)-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-CONH2步驟1該步驟的實(shí)施如同上述實(shí)施例1，除了在合成結(jié)束時(shí)，將最后的組分(MPA)加入到樹脂中。
步驟2利用85％TFA/5％TIS/5％苯硫基甲烷和5％苯酚將衍生物從使用的樹脂上切割，然后通過干冰冷的(0-4℃)Et2O進(jìn)行沉降。粗衍生物收集在一聚丙烯燒結(jié)的漏斗，干燥，重新溶解在40％乙腈的水(0.1％TFA)混合物中，冷凍干燥產(chǎn)生相應(yīng)的粗GRF衍生物，用于純化過程中。
實(shí)施例27實(shí)施例1的GRF肽的第三種長(zhǎng)效衍生物
(N-AEEA-MPA)-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-CONH2步驟1這個(gè)步驟的操作如同上述實(shí)施例1，除了加到樹脂上的倒數(shù)第二個(gè)組分為Fmoc-AEEA，以及最后的組分為(MPA)。
步驟2該步驟以及與實(shí)施例26的步驟2相同。
純化程序利用Varian(Dynamax)制備性二元HPLC系統(tǒng)，通過制備性反相HPLC純化每個(gè)化合物。用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基，50mm×250mm柱(顆粒10μ)進(jìn)行純化，柱用水/TFA混合物(0.1％TFA的水(溶劑A)和乙腈/TFA(0.1％TFA的CH3CN(溶劑B)平衡。以50mL/min運(yùn)行28-38％B梯度180分鐘完成洗脫。通過在214和254mm處的UV吸光度(Varian Dynamax UVD II)檢測(cè)含有肽的組分。
以25mL等分收集組分。那些含有目的產(chǎn)物的組分在直接注射到LC/MS后通過質(zhì)量檢測(cè)進(jìn)行鑒定。選擇的組分隨后通過HPLC(20-60％B運(yùn)行20分鐘；Phenomenex Luna 5μ苯基-己基，10mm×250mm柱，0.5mL/min)分析鑒定，并把≥90％純度的組分合并。用液氮對(duì)合并物凍干，然后凍干至少2天以產(chǎn)生白色粉末。
體外結(jié)果一些本發(fā)明GRF衍生物經(jīng)評(píng)估具有顯著促進(jìn)GH在大鼠初級(jí)前腦垂體細(xì)胞培養(yǎng)物中分泌的能力。將新鮮的大鼠前腦垂體細(xì)胞與不同濃度的化合物接觸4小時(shí)，然后用市售的Linco Research(MO)的RIA試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)基中的GH水平。
方法從麻醉的正常Sprague-Dawley大鼠移去全部腦垂體，直接收集到含兩性霉素和慶大霉素硫酸鹽的新鮮培養(yǎng)基中。腦垂體收集后1小時(shí)內(nèi)的細(xì)胞用于制備初級(jí)細(xì)胞。把單個(gè)腦垂體切碎，組織碎片在持續(xù)溫和攪拌下用胰蛋白酶進(jìn)行降解。組織碎片經(jīng)巴斯德移液管機(jī)械破碎后再溫育15分鐘。研磨細(xì)胞，洗滌兩次，然后接種到含新鮮培養(yǎng)基的24孔板中。培養(yǎng)72小時(shí)后，細(xì)胞用不含血清的培養(yǎng)基洗滌兩次，然后用含或不含GRF類似物或衍生物溫育4小時(shí)。溫育后收集上清，并用放射免疫測(cè)定法定量檢測(cè)大鼠生長(zhǎng)激素(試劑盒購自LincoResearch，MO)。
如圖中所示，結(jié)果顯示所有本發(fā)明GRF衍生物都能刺激GH分泌，濃度范圍是10-6到10-13M之間。刺激指數(shù)等同于市售的GRF(1-29)和D-Ala-GRF(1-29)(兩者皆來自Polypeptide Laboratories，California)。
體內(nèi)結(jié)果本發(fā)明GRF衍生物的體內(nèi)活力經(jīng)評(píng)估具有顯著促進(jìn)自由活動(dòng)的動(dòng)物GH分泌的能力?；衔锿ㄟ^皮下濃注(1μmol/kg)到插有導(dǎo)管的標(biāo)準(zhǔn)Sprague-Dawley大鼠進(jìn)行給藥。收集連續(xù)的血液樣品來測(cè)定給藥化合物后的急性GH釋放。
方法插入導(dǎo)管的7-8周齡的雄性Sprague-Dawley大鼠在實(shí)驗(yàn)前至少5天安裝鼠具以避免應(yīng)激。實(shí)驗(yàn)只在上午9-11之間開始。每個(gè)處理組由8只大鼠組成?；衔锿ㄟ^皮下注射到腰背區(qū)的方式給藥1次。在注射后5、10、15、20、30和60分鐘時(shí)以前劑量采集系列血液樣品。收集血漿，然后將樣品直接送到Linco Research(MO)，通過放射免疫測(cè)定GH。用MicroSoft ExcelTM軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(t-檢驗(yàn))。
如圖中所示，結(jié)果顯示所有本發(fā)明GRF衍生物都能誘導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)大鼠模型分泌GH。
藥代動(dòng)力學(xué)研究對(duì)于實(shí)施例5和6的化合物進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)研究。每種化合物皮下(1μmol/kg)或靜脈內(nèi)(100nmol/kg)注射到雄性Sprague-Dawley大鼠體內(nèi)。在藥物注射后5、30和60分鐘以及2、4、8、24、48、72和96小時(shí)以前劑量采集系列血液樣品。收集血漿并冷凍直至放射免疫測(cè)定(RIA)進(jìn)行分析。市售的抗原始GRF(1-29)的多克隆抗體被用來檢測(cè)化合物。檢測(cè)靈敏度為300到10000pM。所以，一些樣品必須稀釋后分析。藥代動(dòng)力學(xué)圖譜的結(jié)果顯示于圖9。正如所見，實(shí)施例5的化合物即原始肽，消失得非?？?。實(shí)際上，實(shí)施例5的化合物無論是皮下還是靜脈內(nèi)給藥在給藥后60分鐘都不能檢測(cè)到。這與文獻(xiàn)中報(bào)告的有關(guān)GRF(1-29)及其它類似物在Sprague-Dawley大鼠中的半衰期和生物可利用率百分比(SC/IV)的結(jié)果吻合(參見例如Peptides，9207-209，和J.Endocr.，107R5-R8。
另外，實(shí)施例6的化合物，根據(jù)本發(fā)明它是實(shí)施例5原始肽的衍生物，在96小時(shí)后仍可檢測(cè)到。附加的數(shù)據(jù)顯示在下列表2中。
表2實(shí)施例6化合物的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

盡管本發(fā)明結(jié)合特定的實(shí)施方案得已描述，但是可以理解其能被進(jìn)一步的修飾，并且本申請(qǐng)意欲覆蓋遵循本發(fā)明一般原理，包括偏離本發(fā)明說明書但屬于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)已知或慣用的做法，和可應(yīng)用于上文所述的必要特征以及落入所附權(quán)利要求的范圍之中的任意變化、使用或改編。
權(quán)利要求
1.一種生長(zhǎng)激素釋放因子衍生物，其包含-一種具有生長(zhǎng)激素產(chǎn)生或釋放活性的肽；以及-一種偶聯(lián)到肽上的反應(yīng)實(shí)體，該衍生物能夠在體內(nèi)或體外與血液組分上的官能團(tuán)共價(jià)鍵合。
2.如權(quán)利要求1所述的衍生物，其中肽包括人GRF、牛GRF、雞GRF、鮭魚GRF和豬GRF。
3.如權(quán)利要求2所述的衍生物，其中肽含有的GRF序列如下A1-A2-Asp-A4-Ile-Phe-A7-A8-A9-Tyr-A11-A12-A13-leu-A15-Gln-Leu-A18-Ala-A20-A21-A22-Leu-A24-A25-A26-A27-A28-A29-A30其中，A1為Tyr、N-Ac-Tyr、His、3-MeHis、脫氨基His、脫氨基Tyr、Lys-Tyr、Lys-His或Lys-3-MeHis；A2為Val、Leu、Ile、Ala、D-Ala、N-甲基-D-Ala、(N-甲基)Ala、Gly、Nle或Nval；A4為Ala或Gly；A5為Met或Ile；A7為Asn、Ser或Thr；A8為Asn、Gln、Lys或Ser；A9為Ala或Ser；A11為Arg、D-Arg、Lys或D-Lys；A12為L(zhǎng)ys、(N-Me)Lys、Lys或D-Lys；A13為Val或Leu；A15為Ala、Leu或Gly；A18為Ser或Thr；A20為Arg、D-Arg、Lys或D-Lys；A21為L(zhǎng)ys、(N-Me)Lys或Asn；A22為Tyr或Leu；A24為Gln或His；A25為Ser或Asp；A26為L(zhǎng)eu或Ile；A27為Met、Ile、Leu或Nle；A25為Ser、Asn、Ala或Asp；A29為L(zhǎng)ys或Arg；以及A30為缺失、X或X-Lys，其中X缺失或者是序列Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu或其片段，其中片段從C末端減少1到15個(gè)氨基酸；以及其中片段的一個(gè)氨基酸殘基可被賴氨酸殘基任選取代；并且其中C末端可以是游離的羧酸或相應(yīng)的酰胺，附帶條件是如果A2為Ala，則該片段就不是減少了5-8個(gè)氨基酸的片段。
4.如權(quán)利要求3所述的衍生物，其中A30為X-Lys，以及其中X缺失。
5.如權(quán)利要求4所述的衍生物，其中A2為D-Ala。
6.如權(quán)利要求3所述的衍生物，其中A15為Ala。
7.如權(quán)利要求3所述的衍生物，其中A2為D-Ala，A8為Gln，A15為Ala，A27為L(zhǎng)eu，A30為X-Lys，以及X缺失。
8.如權(quán)利要求3所述的衍生物，其中GRF序列選自Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-CONH2；Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-CONH2；Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Ser-Arg-CONH2；Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-(D)Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Ser-Arg-CONH2；Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-Arg-((N-Me)Lys)-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Ser-Arg-CONH2；Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Asn-Arg-CONH2；Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-CONH2；Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-(D)arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-CONH2；Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-Arg-((N-Me)Lys)-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-CONH2；His-(D)ala-Asp-Gly-Met-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Ser-Leu-Met-Ala-Lys-CONH2；和His-(D)ala-Asp-Gly-Ile-Phe-Ser-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Leu-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Asn-Tyr-Leu-His-Ser-Leu-Met-Ala-Lys-CONH2；每個(gè)GRF序列任選在N-末端或C-末端包括一個(gè)賴氨酸殘基；以及其中反應(yīng)實(shí)體為含馬來酰亞胺的基團(tuán)。
9.如權(quán)利要求8所述的衍生物，其中GRF序列在C-末端包含一個(gè)附加的賴氨酸殘基。
10.如權(quán)利要求1所述的衍生物，其選自Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Lys(MPA)-CONH2；Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Lys(MPA)-CONH2；Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Ser-Arg-Lys(MPA)-CONH2；Tyr-(D)Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-(D)Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Ser-Arg-Lys(MPA)-CONH2；Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-Arg-((N-Me)Lys)-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Ser-Arg-Lys(MPA)-CONH2；Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-Arg-Lys(MPA)-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Ser-Arg-CONH2；Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Asn-Lys(MPA)-CONH2；Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-Lys(AEEA-MPA)-CONH2；Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-(D)arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-Lys(AEEA-MPA)-CONH2；Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-Arg-((N-Me)Lys)-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-Lys(MPA)-CONH2；Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-Arg-Lys(MPA)-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-CONH2；His-(D)ala-Asp-Gly-Met-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Ser-Leu-Met-Ala-Lys(AEEA-MPA)-CONH2；His-(D)ala-Asp-Gly-Met-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys(MPA)-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Ser-Leu-Met-Ala-Lys-CONH2；His-(D)ala-Asp-Gly-Ile-Phe-Ser-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Leu-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Asn-Tyr-Leu-His-Ser-Leu-Met-Ala-Lys(AEEA-MPA)-CONH2；His-(D)ala-Asp-Gly-Ile-Phe-Ser-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys(MPA)-Leu-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Asn-Tyr-Leu-His-Ser-Leu-Met-Ala-Lys-CONH2；(N-MPA)-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-CONH2；和(N-AEEA-MPA)-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-CONH2。
11.如權(quán)利要求3所述的衍生物，其中血液組分包括血蛋白。
12.一種藥物組合物，其包含與可藥用載體結(jié)合的如權(quán)利要求3所述的GRF衍生物。
13.如權(quán)利要求12所述的組合物，其用于促進(jìn)受試者內(nèi)源性GH產(chǎn)生或釋放。
14.如權(quán)利要求12所述組合物，其用于治療或預(yù)防由GH產(chǎn)生異常導(dǎo)致的疾病或癥狀。
15.一種促進(jìn)受試者內(nèi)源性產(chǎn)生或釋放GH的方法，其包括單獨(dú)或與藥物載體結(jié)合給受試者施用有效量的如權(quán)利要求3所述的衍生物。
16.一種用于治療或預(yù)防由GH產(chǎn)生異常導(dǎo)致的疾病或癥狀的方法，其包括單獨(dú)或與藥物載體結(jié)合給受試者施用有效量的如權(quán)利要求3所述的衍生物。
17.一種結(jié)合物，其包括與血液組分共價(jià)結(jié)合的如權(quán)利要求3所述的衍生物。
18.一種延長(zhǎng)具有生長(zhǎng)激素釋放活性的肽的體內(nèi)半衰期的方法，該方法包括使肽與血液組分共價(jià)結(jié)合。
19.一種用于治療或預(yù)防由GH產(chǎn)生異常導(dǎo)致的疾病或癥狀的方法，其包括單獨(dú)或與藥物載體結(jié)合給受試者施用有效量的如權(quán)利要求17所述的結(jié)合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生長(zhǎng)激素釋放因子(GRF)衍生物。具體地，本發(fā)明涉及具有體內(nèi)半衰期延長(zhǎng)的GRF肽衍生物，用于促進(jìn)人和動(dòng)物體內(nèi)生長(zhǎng)激素的內(nèi)源性產(chǎn)生或釋放。
文檔編號(hào)A61P5/10GK1491233SQ02804497
公開日2004年4月21日 申請(qǐng)日期2002年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月2日
發(fā)明者多米尼克·P·布賴頓, 尼賽布·布杰拉布, 羅杰·萊杰, 馬丁·羅比塔耶, 露西·熱泰, 科琳·邦蓋, 布杰拉布, 多米尼克 P 布賴頓, 熱泰, 羅比塔耶, 萊杰, 邦蓋 申請(qǐng)人:康久化學(xué)公司