專利名稱：牙鲆淋巴囊腫病的多肽疫苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及牙鲆淋巴囊腫病的多肽疫苗的制備方法。
背景技術(shù)：
淋巴囊腫病(Lymphocystis disease，LCD)是困擾水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)多年無法解決的難題之一。其病原體，淋巴囊腫病毒(Lymphocystis disease virus LCDV)可感染包括牙鲆在內(nèi)的100余種海淡水魚類。就牙鲆而言，感染LCDV的病魚在體表產(chǎn)生大量的瘤狀物，嚴(yán)重影響其經(jīng)濟(jì)價值，同時該病還可導(dǎo)致養(yǎng)殖牙鲆高達(dá)60-70％的死亡率。由于牙鲆是我國海水養(yǎng)殖的主要經(jīng)濟(jì)品種，而淋巴囊腫病又具有高流行性的特點(diǎn)，對養(yǎng)殖業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失十分巨大。因此，迫切需要有效的藥物或疫苗加以防治。
疫苗已被證明是最有效的疾病防治手段之一。經(jīng)過不斷的發(fā)展，第三代的亞單位(多肽)疫苗和第四代的核酸疫苗正在逐步替代傳統(tǒng)的滅活和減毒疫苗成為疫苗研發(fā)的重點(diǎn)。亞單位疫苗目前已在人類的衛(wèi)生健康體系中得到應(yīng)用，包括乙肝、流感等病毒性疾病的防治。亞單位疫苗的特點(diǎn)在于安全性好，能有效地誘導(dǎo)機(jī)體CD4+T細(xì)胞通過Th1途徑激活漿細(xì)胞的分化與增殖，從而提高體液免疫應(yīng)答水平。
亞單位疫苗研制的核心在于抗原蛋白的亞單位結(jié)構(gòu)必須保持原有的免疫原性和免疫反應(yīng)性。已知結(jié)構(gòu)與功能的抗原蛋白數(shù)量微乎其微，占據(jù)絕大多數(shù)的未知抗原蛋白嚴(yán)重制約了亞單位疫苗的研究與開發(fā)進(jìn)度，這是因為蛋白質(zhì)的分離、純化和結(jié)構(gòu)功能分析在生命科學(xué)已取得巨大突破的今天仍然是一個技術(shù)難題，需要耗費(fèi)大量的時間和人力物力才能解決。相反地，基因/基因組克隆、測序技術(shù)的飛速發(fā)展為反向的蛋白質(zhì)功能、結(jié)構(gòu)分析提供了有力的輔助手段。隨著海量的核酸數(shù)據(jù)庫以幾何級數(shù)形式不斷地增長，生物信息學(xué)作為挖掘序列蘊(yùn)含信息強(qiáng)有力的工具也應(yīng)運(yùn)而生，并正處于高速發(fā)展過程中。
本發(fā)明利用生物信息學(xué)技術(shù)推定產(chǎn)生的模擬表位，依據(jù)它們的氨基酸序列合成相應(yīng)模擬表位的多肽，經(jīng)過與載體的偶聯(lián)制備出特異性針對牙鲆淋巴囊腫病的多肽疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是憑借已有的LCDV-cn保護(hù)性抗原核衣殼蛋白和囊膜蛋白的三個模擬表位，構(gòu)建特異性針對牙鲆淋巴囊腫病的模擬表位多肽疫苗。
本發(fā)明的牙鲆淋巴囊腫病的多肽疫苗的制備方法是，利用對已知的淋巴囊腫病毒歐洲分離株(LCDV-1)基因組序列所進(jìn)行的生物信息學(xué)分析而得到牙鲆LCDV-cn(淋巴囊腫病毒中國分離株)核衣殼蛋白和囊膜蛋白的3個模擬表位，然后依據(jù)模擬表位的氨基酸序列，合成得到相應(yīng)的3種多肽，經(jīng)過與蛋白質(zhì)載體的偶聯(lián)與純化，即制備了牙鲆淋巴囊腫病的模擬表位多肽疫苗。進(jìn)而通過養(yǎng)殖牙鲆的動物實驗，驗證了多肽疫苗的特異性和保護(hù)性。
上述的3個模擬表位序列分別為(文中的氨基酸簡稱均采用IUPAC標(biāo)準(zhǔn))29ATKNNMSRTSETDNN，即NH2-Thr-Lys-Asn-Asn-Met-Ser-Arg-Thr-Ser-Glu-Thr-Asp-Asn-Asn-COOH29BCKKNSDSTDC，即NH2-Cys-Lys-Lys-Asn-Ser-Asp-Ser-Thr-Asp-Cys-COOHTK3TNEERRLMGT，即NH2-Thr-Asn-Glu-Glu-Arg-Arg-Leu-Met-Gly-Thr-COOH采用的蛋白質(zhì)載體為鑰孔槭血藍(lán)蛋白(簡稱為KLH)，也可采用血紅蛋白、小牛血清白蛋白等。
本發(fā)明所依據(jù)的原理如下其一，LCDV-1與LCDV-cn同屬虹彩病毒科、淋巴囊腫病毒屬，在親緣關(guān)系上具有較高的同源性(已知兩種病毒的核衣殼蛋白基因MCP在核酸序列上的同源性為77％)，因此適于進(jìn)行核酸序列的比較、分析。同時，由于兩種病毒侵染的宿主與組織、細(xì)胞類似、引起的病理反應(yīng)和癥狀也完全相同，兩種病毒產(chǎn)生的受體反應(yīng)與血清免疫反應(yīng)也是相似的，據(jù)此可以推定，兩種病毒間存在一致的保護(hù)性抗原。鑒于LCDV-1的基因組序列已被測定，利用LCDV-1的基因組序列推斷LCDV-cn的保護(hù)性抗原及其抗原決定簇因此成為可能。
其二，抗原決定簇(或稱表位)是保護(hù)性抗原誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生適應(yīng)性免疫應(yīng)答的關(guān)鍵。MHC I、II分子與表位形成的復(fù)合體分別為TC和TH所識別，引起細(xì)胞因子的分泌、B、T細(xì)胞的活化、增殖與分化，最終產(chǎn)生相應(yīng)的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。因此，利用表位直接構(gòu)建多肽疫苗能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)。
具體實施例方式
本方法利用經(jīng)生物信息學(xué)分析得到的牙鲆LCDV-cn保護(hù)性抗原模擬表位，合成得到與模擬表位序列相一致的多肽，經(jīng)過與載體蛋白質(zhì)的偶聯(lián)和純化，制備出牙鲆淋巴囊腫病的模擬表位多肽疫苗。具體方法如下
首先選擇出牙鲆LCDV-cn保護(hù)性抗原模擬表位通過對已知基因組序列的LCDV-1所進(jìn)行的生物信息學(xué)分析，篩選得到LCDV-cn兩種保護(hù)性抗原核衣殼蛋白和囊膜蛋白的3條模擬表位，即TK3、29A和29B。同時，為了識別不同抗原提呈途徑對多肽疫苗可能產(chǎn)生的影響，以及模擬表位多肽疫苗的特異性，分別選取了上述兩種保護(hù)性抗原模擬表位的參照序列(TK1)和對照序列(TK2、29C)共三條。選取的的模擬表位與參照和對照序列的說明列于下表

然后制備模擬表位多肽疫苗依據(jù)上表中所列的全部模擬表位序列和對照與參照序列，通過固相合成法制得了相應(yīng)的合成多肽6條，即TK1、TK2、TK3與29A、29B和29C，用質(zhì)譜分析鑒定了合成多肽序列的一致性。
合成多肽通過與載體連接制備得到模擬表位的多肽疫苗，具體方法如下合成多肽與KLH(鑰孔槭血藍(lán)蛋白)用PBS(磷酸鹽緩沖液，pH7.2)溶解，濃度均為2mg/ml，等體積混合，逐滴加入等體積的戊二醛(0.25％)，在室溫下混勻至少6hr，再用含50mM甘氨酸的PBS對連接產(chǎn)物透析純化過夜，所得純化產(chǎn)物即為模擬表位多肽疫苗。
以下，對本發(fā)明獲得的3種模擬表位多肽疫苗的誘導(dǎo)牙鲆產(chǎn)生細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答的效應(yīng)進(jìn)行了檢測，實驗驗證如下對純化的牙鲆LCDV-cn模擬表位多肽疫苗進(jìn)行了動物實驗，以鑒定疫苗的特異性和免疫效應(yīng)。實驗隨機(jī)選取養(yǎng)殖牙鲆共56條，體重約為250-300g。分為8組，實驗組共6組，6種待測多肽疫苗(含參照和對照疫苗，如上表所示)各為8條牙鲆一組。對照設(shè)2組，分為每組4條，分別用PBS和等量KLH取代多肽疫苗進(jìn)行注射。
偶聯(lián)的多肽疫苗以2mg/ml的濃度每條魚背部肌肉注射200μl，10天后同樣劑量注射進(jìn)行二次免疫。26天后用純化的20mg/ml LCDV-cn 200μl/條攻毒28條牙鲆(每組牙鲆取半數(shù)，實驗組每組4條，對照組每組2條)。56、76天后分別取部分牙鲆輕度麻醉，解剖取鰓、心、頭腎、脾四種組織分別用Davidson固定液固定或于RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液中保存?zhèn)溆谩?br> 采血方式為尾部靜脈采血，每條魚0.5ml/次，4℃保存過夜，10000g離心10分鐘，收集上清作為牙鲆抗血清。采血時間(初次免疫日期計為d0，即第0天)分別為d-2，d3，d8，d18，d27，d38，d56，d76。
免疫效應(yīng)評價方法為了檢測牙鲆LCDV-cn模擬表位多肽疫苗的免疫效應(yīng)，分別采用了ELISA(酶聯(lián)免疫吸附分析法)用于牙鲆抗LCDV-cn IgM的表達(dá)水平變化及其特異性檢測，MTT法檢測細(xì)胞因子的表達(dá)及淋巴細(xì)胞的增殖，免疫組化和免疫印跡用于病毒感染狀況與相對保護(hù)率的檢測。
免疫組化和免疫印跡分析結(jié)果表明，攻毒的對照組(KLH、PBS)在鰓、腎組織均產(chǎn)生陽性反應(yīng)(一抗為兔抗LCDV-cn多抗，效價1∶4000)，而實驗組的29B、29A為陰性，TK1/2/3、29C則顯示為弱陽性，按照陰性至陽性的遞增次序，6種疫苗和對照的結(jié)果為29B＜29A＜TK3＜TK1＜TK2＜29C＜KLH＜PBS，相對保護(hù)率(四個區(qū)域著色點(diǎn)的平均值)依次為96.4％、91.2％、83％、44％、11％、8％、3％，0％。這一結(jié)果說明，本發(fā)明的模擬表位多肽疫苗(29A、29B和TK3)具有明顯的免疫保護(hù)作用，同時也說明它們是特異性針對LCDV-cn的疫苗，而非模擬表位序列的對照疫苗基本不具備保護(hù)作用。
細(xì)胞因子的檢測結(jié)果表明，攻毒后牙鲆分離出的脾、頭腎淋巴細(xì)胞經(jīng)MTT檢驗，細(xì)胞因子的表達(dá)水平與淋巴細(xì)胞的增殖在實驗組的29B、A中最高，分別為0.445±0.067和0.395±0.059(均為OD570-OD630所得值，下同)，甚至高于PHA刺激的陽性對照(0.267±0.081)，其余依次為TK3(0.227±0.051)、TK1(0.098±0.043)、TK2(0.046±0.038)和29C(0.024±0.030)，對照組分別為KLH(0.040+0.037)、PBS(0.018±0.017)。概括起來，依照陽性遞減的次序，其結(jié)果為29B＞29A＞PHA＞TK3＞TK1＞KLH＞29C＞PBS。由此結(jié)果可以看出，經(jīng)過多肽的刺激，免疫后的牙鲆淋巴細(xì)胞能夠特異性地識別抗原并產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞增殖反應(yīng)并提高細(xì)胞因子的表達(dá)水平，而淋巴細(xì)胞基本不能將對照疫苗作為特異性抗原加以識別，其增殖與表達(dá)水平僅與非特異性的KLH相當(dāng)。
抗體水平的檢測結(jié)果如下(下述均為OD495光密度值)，免疫前的牙鲆體內(nèi)檢測不到抗LCDV-cn的抗體存在，抗體水平也較低，各組的平均值分別為0.053±0.037(病毒包被，二抗采用兔抗牙鲆IgM的多抗，效價1∶2000)和0.107±0.087(牙鲆抗血清包被，總蛋白50μg/ml，二抗為兔抗牙鲆IgM的多抗，效價1∶2000)。免疫后第8天的抗體水平(除PBS對照組外0.062±0.044)具有提高，平均為0.207±0.112。但是，其中僅有29A、29B免疫牙鲆所產(chǎn)生的抗體具有中和LCDV-cn活性，其特異性抗體表達(dá)水平分別為0.097+0.043和0.112±0.047(病毒包被)，其余實驗組(包括KLH對照組)均產(chǎn)生各自免疫原的抗體，各組平均為0.107±0.085(實驗組多肽包被，對照組KLH包被)。
第18天(二次免疫后8天)和第38天(攻毒后3天)出現(xiàn)兩次高峰，兩次的抗體水平分別為0.479±0.102(實驗組+KLH對照組平均值)和0.761±0.243(攻毒組平均值)。其中，只有29A和29B產(chǎn)生特異性抗體，分別為0.385±0.079/0.789±0.153與0.482±0.094/0.906±0.183(29A、29B的第18/38天抗體檢測值)。此后，29A、29B攻毒組的抗體水平急劇下降，至d76降至0.142±0.056，其余各組則基本維持在較穩(wěn)定的水平，約為0.351±0.120，并且在攻毒組中(除29A、29B外)，在d56、d76均能檢測到牙鲆抗LCDV-cn的抗體，其均值為0.122±0.063。
上述抗體檢測結(jié)果表明，模擬表位多肽疫苗29A和29B能夠誘導(dǎo)B細(xì)胞的增殖、分化，產(chǎn)生特異性的體液免疫應(yīng)答，并引起免疫記憶效應(yīng)，從而有效提高牙鲆對LCDV-cn的免疫預(yù)防能力。
因此，本發(fā)明制得的3種模擬表位多肽疫苗的免疫效應(yīng)檢測結(jié)果呈現(xiàn)出高度的一致，說明本發(fā)明采用的生物信息學(xué)設(shè)計的模擬表位具有強(qiáng)免疫原性和免疫反應(yīng)性，并據(jù)此構(gòu)建出的多肽疫苗能夠誘導(dǎo)牙鲆產(chǎn)生特異性的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，同時也可提供較高的相對保護(hù)率。此外，模擬表位多肽疫苗與對照疫苗免疫效應(yīng)的對比結(jié)果還證明，本發(fā)明的模擬表位與LCDV-cn保護(hù)性抗原核衣殼蛋白和囊膜蛋白的抗原決定簇是一致的?；谏鲜?，本發(fā)明中的三種模擬表位多肽疫苗(29A、29B和TK3)能夠起到有效的免疫預(yù)防與保護(hù)作用。
本方法制備簡便。與滅活疫苗不完善的免疫作用不同，模擬表位多肽疫苗能夠有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生全面的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答；而與減毒疫苗相比，多肽疫苗又具有很高的安全性，因此，本方法制備的疫苗能夠作為綜合了傳統(tǒng)減毒、滅活疫苗的優(yōu)勢而產(chǎn)生的替代品。
權(quán)利要求
1.牙鲆淋巴囊腫病的多肽疫苗的制備方法，首先對已知的淋巴囊腫病毒歐洲分離株基因組序列所進(jìn)行的生物信息學(xué)分析而得到牙鲆淋巴囊腫病毒中國分離株核衣殼蛋白和囊膜蛋白的3個模擬表位，然后依據(jù)模擬表位的氨基酸序列，合成得到相應(yīng)的3種多肽，經(jīng)過與蛋白質(zhì)載體的偶聯(lián)與純化，即制備了牙鲆淋巴囊腫病的模擬表位多肽疫苗。
2.如權(quán)利要求1所述的牙鲆淋巴囊腫病的多肽疫苗的制備方法，其特征在于上述的3個模擬表位序列分別為29ANH2-Thr-Lys-Asn-Asn-Met-Ser-Arg-Thr-Ser-Glu-Thr-Asp-Asn-Asn-COOH29BNH2-Cys-Lys-Lys-Asn-Ser-Asp-Ser-Thr-Asp-Cys-COOHTK3NH2-Thr-Asn-Glu-Glu-Arg-Arg-Leu-Met-Gly-Thr-COOH。
3.如權(quán)利要求1所述的牙鲆淋巴囊腫病的多肽疫苗的制備方法，其特征在于所述的蛋白質(zhì)載體為鑰孔槭血藍(lán)蛋白。
4.如權(quán)利要求1所述的牙鲆淋巴囊腫病的多肽疫苗的制備方法，其特征在于所述的蛋白質(zhì)載體為血紅蛋白、小牛血清白蛋白。
全文摘要
一種牙鲆淋巴囊腫病的多肽疫苗的制備方法，首先對已知的淋巴囊腫病毒歐洲分離株基因組序列所進(jìn)行的生物信息學(xué)分析而得到牙鲆淋巴囊腫病毒中國分離株核衣殼蛋白和囊膜蛋白的3個模擬表位，然后依據(jù)模擬表位的氨基酸序列，合成得到相應(yīng)的3種多肽，經(jīng)過與蛋白質(zhì)載體的偶聯(lián)與純化，即制備了牙鲆淋巴囊腫病的模擬表位多肽疫苗。本方法制備簡便、疫苗能夠有效誘導(dǎo)產(chǎn)生全面的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答，還具有很高的安全性。上述的3個模擬表位序列分別為TKNNMSRTSETDN、CKKNSDSTD和TNEERRLMGT。采用的蛋白質(zhì)載體為鑰孔槭血藍(lán)蛋白，也可采用血紅蛋白、小牛血清白蛋白等。
文檔編號A61P31/12GK1785425SQ20051010431
公開日2006年6月14日 申請日期2005年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月18日
發(fā)明者吳謖琦, 孫修勤, 張進(jìn)興, 鄭鳳榮, 洪旭光, 曲凌云 申請人:國家海洋局第一海洋研究所