專利名稱：對cd122的抗體的制作方法
對CD122的抗體
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序列清單參考
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在T細胞、NK細胞、單核細胞和B細胞的一個亞群上表達的⑶122為525氨基酸 長度的 I 型膜蛋白(Zamai 等，J. Biol. Regul. Homeost. Agents 15:95-97(2001))。CD 122分子是白細胞介素2(IL-2)和白細胞介素15(IL-15)這兩個I型細胞因子的受體的必不可少的一部分。⑶122，也稱為IL-2和IL-15受體的β鏈，與其他的受體亞成分結(jié)合，以產(chǎn)生顯示精確的細胞因子特異性和親和性的受體。在細胞表面上功能性地與CD122的聯(lián)合的分子包括⑶25 (也被稱為的IL-2受體α鏈或IL_2Ra )、⑶132(也稱為為共同Y或Y c鏈)和IL-15受體a鏈(也可簡稱為IL_15Ra ;還未分配CD名稱)(Waldmann，Nat.Rev. Immunol. 6 :595-601 (2006))。CD 122 與 CD 132 結(jié)合形成的受體顯示出對 IL-2 (KD = InM)和IL-15(KD = IOnM)兩者的中間水平的親和性(中間親和性受體)。⑶122與⑶25及⑶132的共同結(jié)合產(chǎn)生的受體特別對IL-2具有高親和性(KD= IOpM)，而⑶122與IL-15Ra及CD132的結(jié)合可產(chǎn)生對IL-15有高親和性的受體(KD = IOpM) (Ma, A.，等，Annu. Rev. Immunol. 24 :657-679 (2006))。
IL-2和IL-15共同分擔(dān)刺激T淋巴細胞增殖的能力，但在維護免疫系統(tǒng)方面卻各具獨特的活性。IL-2通過引發(fā)已激活的T細胞凋亡而限制T細胞反應(yīng)性，而IL-15對于NK細胞的發(fā)育及⑶8+記憶T細胞的發(fā)育和維護均必不可少(Waldmann, Nat. Rev. Immunol. 6 595-601 (2006))。這兩種細胞因子在其與各自的受體相互作用方法中也體現(xiàn)它們的根本區(qū)別。當(dāng)可溶的IL-2細胞因子與細胞表面上中度或高親和力的IL-2受體相互作用時，IL-2信號發(fā)生。該可溶的細胞因子的遞送，其中分泌自相同或不同細胞的細胞因子與單一細胞表面全部受體亞成分相互作用，是除IL-15外，所有I型細胞因子傳輸其信號的機制。相反，IL-15信號發(fā)生的實現(xiàn)是通過將結(jié)合于細胞表面IL-15Ra的IL-15呈遞到另一個表達⑶122和⑶132分子的細胞。這也被稱為反式呈遞。反式呈遞是這樣一種機制，與IL_15Ra受體亞成分或其片段結(jié)合的IL-15，以可溶的或結(jié)合于一個細胞的狀態(tài)存在，能被呈遞至一個可表達剩余受體亞成分(⑶122和⑶132)的另一細胞，隨后導(dǎo)致信號發(fā)生。分離的IL-15Ra或其片段對IL-15的親和性很高(KD = IOpM)，并認為IL-15與IL-15Ra在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)結(jié)合，然后以復(fù)合物的形式傳遞到細胞表面以反式呈遞到細胞表面能表達⑶122和⑶132的其他細胞。當(dāng)IL-15與表達在同一細胞的⑶122，⑶132和IL_15Ra結(jié)合時，順式呈遞即發(fā)生。絕大多數(shù)的IL-15信號發(fā)生是通過反式呈遞進行，順式呈遞的作用很小，而呈遞可溶性的IL-15所產(chǎn)生的信號幾乎沒有或完全沒有(Stonier與Schluns，Immunol. Lett. 127 :85-92(2010) ；Ma 等，Annu. Rev. Tmmunol. 24 :657-679(2006) ；Dubois等，Immunity 17 :537-547(2002))
和與I型細胞因子共享基本結(jié)構(gòu)、一些功能活性及某些受體亞成分一樣，IL-2和IL-15分別與免疫介導(dǎo)的疾病相關(guān)。比如，通過使用單克隆抗體靶向IL-2受體(CD25)的α鏈來抑制IL-2活性，是一種有效的免疫調(diào)節(jié)策略，目前被批準(zhǔn)用于急性腎移植排斥反應(yīng)(Vincenti 等，New Engl. J. Med. 338 :161_5 (1998))。另外，抗-CD25 方法的治療益處也被報道于應(yīng)對哮喘(Busse 等，Am. J. Respir. Crit. Care Med. 178 :1002-1008 (2008))、葡萄膜炎(Yehet 等，J. Autoimmun. 31 :91-97(2008))和多發(fā)性硬化癥(Rose 等，Neurology, 69 785-789(2007))的臨床試驗，這提示出IL-2參與了這些過程。IL-15特異性的單克隆抗體已被報道在臨床試驗中有積極的治療效果，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Baslund et al. , ArthritisRheum. 52 :2686-2692 (2005))，并且據(jù)報道在銀屑病(Villadsen 等，J. Clin. Invest. 112 1571-1580(2003))、腹腔疾病(Maiuri 等，Gastroenterology 119 :996-1066(2000))和系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Bo et等，Scand. J. Immunol. 69 :119-129(2009))的動物模型中具有療效。小鼠的抗人CD122單克隆抗體已產(chǎn)生自接種了人T細胞系的小鼠，隨后通過多種技術(shù)被認·定為對IL-2受體β鏈具有特異性。這些抗⑶122的單克隆抗體可抑制IL-2依賴性的具有中間親和力IL-2受體的細胞增殖，但它們不能有效地抑制IL-2依賴性的具有高度親和力IL-2受體的細胞增殖。此外，還未曾報道過能有效地抑制IL-15反式呈遞的抗⑶122的單克隆抗體。
一種抗 CD122 的抗體，Mik-β I (Tsudo 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1982-1986(1989))，已作為治療T細胞大顆粒淋巴細胞白血病的方法被用于測試(Morris等，Proc. Nat. Acad. Sci. USA 103 :401-406 (2006))。Mik- β I 亦被人源化，且此形態(tài)HuMik-β I (Hakimi 等，J. Immunol. 151 :1075-1085(1993))已被報道可延長非人類靈長類動物的心臟同種異體移植物的存活。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體，其可特異性地結(jié)合于⑶122，然后阻止IL-2及IL-15與包含⑶122及⑶132的受體結(jié)合。一些抗體阻止IL-2與包含⑶122，⑶132及⑶25的受體結(jié)合。一些抗體阻止反式呈遞于IL-15Ra的IL-15與包含⑶122及⑶132的受體結(jié)合。一些抗體阻止IL-15與包含⑶122，⑶132及IL_15Ra的受體結(jié)合。當(dāng)抗體相對于IL-2或IL-15提供不大于100倍摩爾的量時,一些抗體阻止上述環(huán)境中任何或全部結(jié)合的30%。
一些單克隆抗體與⑶122的結(jié)合可被如下情況阻止⑶122氨基酸序列(見SEQ ID NO 73)42,43和/或133殘基被丙氨酸取代和/或65殘基被蘇氨酸取代和/或70殘基被賴氨酸取代。一些單克隆抗體與⑶122的結(jié)合可被如下情況阻止⑶122氨基酸序列(見SEQID NO 73)42和/或43殘基被丙氨酸取代和/或65殘基被蘇氨酸取代。一些單克隆抗體與⑶122的結(jié)合可被如下情況阻止⑶122氨基酸序列(見SEQ ID NO :73)65殘基被蘇氨酸取代和/或70殘基被賴氨酸取代和/或133殘基被丙氨酸取代。一些單克隆抗體特異性地與一個抗原表位結(jié)合，包括SEQ ID NO :73序列中42殘基。一些單克隆抗體特異性地與一個抗原表位結(jié)合，包括SEQ ID NO :73序列中65殘基。一些抗體特異性地與一個⑶122的抗原表位結(jié)合，包括SEQ ID NO :73序列中133殘基。一些抗體特異性地與一個⑶122的抗原表位結(jié)合，包括SEQ ID NO :73序列中42、43、65、70和/或133殘基。一些單克隆抗體特異性地與一個⑶122的抗原表位結(jié)合，包括SEQ ID NO :73序列中42、43和65殘基。一些單克隆抗體特異性地與一個⑶122的抗原表位結(jié)合，包括SEQ ID NO :73序列中65、70和133殘基。一些單克隆抗體特異性地與一個⑶122的抗原表位結(jié)合，后者位于SEQ ID NO:73序列的纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域I中。一些單克隆抗體特異性地與一個⑶122的抗原表位結(jié)合，后者位于SEQ ID NO 73序列的纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域I和2中。SEQ ID NO 73的39或41殘基被取代為丙氨酸時，一些單克隆抗體與CD122的結(jié)合被檢測到不被阻止。
一些抗體與抗體ABC2或ABClOl競爭結(jié)合⑶122，其中ABC2的特征在于一個成熟的SEQID NO 30的輕鏈可變區(qū)和一個成熟的SEQ ID NO 25的重鏈可變區(qū)，ABClOl其特征在于一個成熟的SEQ ID NO 40的輕鏈可變區(qū)的和一個成熟的SEQ ID NO 35的重鏈可變區(qū)。一些 抗體結(jié)合于與ABC2或ABClOl相同的⑶122上的抗原表位。一些抗體包含三個輕鏈⑶Rs和三個重鏈CDRs，其中每個CDR至少有90%的序列與來自于ABC2 (SEQ ID NOS :27-29輕鏈和22-24重鏈)或ABClOl (SEQ ID NOS :37-39輕鏈，32-34重鏈)的相應(yīng)CDR相同。
一些抗體是嵌合的、人源化的、飾面(veneered)的或人的。一些抗體具有人IgGl κ同種型(isotype)。一種抗體可以是完整的抗體或單鏈抗體，F(xiàn)ab或F(ab’ )2片段。
本發(fā)明還提供人源化或嵌合的ABC2抗體，其特異地與CD122結(jié)合，其中ABC2是特征為一個成熟的SEQ ID NO :30的輕鏈可變區(qū)和一個成熟的SEQ ID NO :25的重鏈可變區(qū)的小鼠抗體。一些這樣的抗體包括一條人源化輕鏈和人源化的重鏈，該人源化輕鏈包括所述ABC2輕鏈的三個CDRs (SEQ ID NO :30)，該人源化的重鏈包括所述ABC2重鏈的三個CDRs (SEQID NO 25)。
一些抗體包括一條與SEQ ID NO :42至少90%相同的人源化的輕鏈和一條與SEQ IDNO :41至少90%相同的人源化的重鏈。通過Kabat編號，殘基T、I、A、I、A和Y分別占據(jù)某些抗體位點1128、!148、!149、冊8、!193和1^71。通過Kabat編號，殘基G占據(jù)某些抗體位點H42。一些抗體中，輕鏈 CDRs 是 SEQ ID N0S. 27-29 且重鏈 CDRs 是 SEQ ID NOS :22-24。
本發(fā)明進一步提供了人源化的或嵌合的ABClOl抗體，其特異性結(jié)合于CD122，其中ABClOl的特征在于一個成熟的SEQ ID NO 40的輕鏈可變區(qū)和成熟的SEQ ID NO 35的重鏈可變區(qū)。一些這樣的抗體包括一條人源化輕鏈和一條人源化重鏈，其中所述輕鏈包含SEQID NO :40的三個⑶Rs，所述重鏈包括SEQ ID N0:35的三個⑶Rs。一些這樣的抗體包含一條與SEQ ID NO :44至少90%相同的成熟的人源化輕鏈可變區(qū)和一條與SEQ ID NO :43至少90 %氨基酸序列相同的成熟的人源化重鏈可變區(qū)。通過Kabat編號，殘基Y、T、M、Q、I、R和K分別占據(jù)這樣一些抗體位點H27、H30、H48、H66、H67、H71和L49。一些這樣的抗體中，輕鏈 CDRs 是 SEQ ID N0S. 37-39 且重鏈 CDRs 是 SEQ ID N0S. 32-34。
本發(fā)明進一步提供了一種藥物組合物，該組合物由包括任何上述的抗體和藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明進一步提供在患者體內(nèi)抑制不希望的免疫應(yīng)答的方法，包括給患者施用任何上述抗體的有效方案。在一些方法中，病人有一種自身免疫性疾病，如，例如，多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、糖尿病、牛皮癬、腹腔疾病或葡萄膜炎。在一些方法中，患者有哮喘或過敏。在一些方法中，病人有移植物抗宿主疾病。在一些方法中，病人有宿主抗移植物疾病。
本發(fā)明進一步提供了一種在患者體內(nèi)治療癌癥的方法，包括給患者施用任何上述抗體的有效方案。在一些方法中，所述癌癥表達可檢測到的⑶122。
本發(fā)明進一步提供一個SEQ ID NO 73中的不超過100個的連續(xù)殘基的分離片段，其包括一個或多個43、65和133殘基。一些分離的片段包括SEQ ID NO :73的43和65殘基。一些分離的片段包括SEQ ID NO 73的65和133殘基。一些分離的片段包括10個或更少的連續(xù)的SEQ ID NO :73中的殘基。一些這樣的分離的片段連接到一個載體，該載體可幫助誘發(fā)應(yīng)對所述片段的抗體的產(chǎn)生，并且/或者該載體作為一個組合物的組件與佐劑一起以幫助誘發(fā)應(yīng)對所述片段的抗體的產(chǎn)生。


圖I. ABC2和ABClOl對IL-15反式呈遞的影響。
圖2. ABC2和ABClOl對通過高親和性IL-2受體由IL-2介導(dǎo)的細胞增殖的影響。
圖3. ABC2 VH的一致cDNA序列及對應(yīng)的推測的氨基酸序列。
圖4. ABC2 VL的一致cDNA序列及對應(yīng)的推測的氨基酸序列。
圖5. ABClOl VH的一致cDNA序列及對應(yīng)的推測的氨基酸序列。
圖6. ABClOl VL的一致cDNA序列及對應(yīng)的推測的氨基酸序列。
圖7.成熟的ABC2 VH，人源化的ABC2 VH (HuABC2 VH)及人受體DA430129 VH區(qū)的氨基酸序列比對。
圖8.側(cè)翼有SpeI及HindIII位點的設(shè)計的HuABC2 VH基因的核苷酸及推測的氨基酸序列。
圖9.成熟的ABC2VL，人源化的ABC2 VL (HuABC2 VL)及人受體M29469 VL區(qū)的氨基酸序列比對。
圖10.側(cè)翼有NheI及EcoRI位點的設(shè)計的HuABC2 VL基因的核苷酸及推測的氨基酸序列。
圖 11.成熟的 ABC101VH，人源化的 ABClOl VH (HuABClOl VH)及人受體 DA936142 VH區(qū)的氨基酸序列比對。
圖12.側(cè)翼有SpeI及HindIII位點的設(shè)計的HuABClOl VH基因的核苷酸及推測的氨
基酸序列。
圖 13.成熟的 ABClOl VL，人源化的 ABClOl VL (HuABClOl VL)及人受體 Z46622 VL VH區(qū)的氨基酸序列比對。
圖14.側(cè)翼有NheI及EcoRI位點的設(shè)計的HuABClOl VL基因的核苷酸及推測的氨基酸序列。
圖15. pHuABC2及pHuABClOl表達載體的原理構(gòu)造。
圖16. HuABC2及HuABClOl對IL-15反式呈遞的影響。
圖17. HuABC2和Hu ABC101對通過高親和性IL-2受體由IL-2介導(dǎo)的細胞增殖的影響。
圖 18. ABC2, ABC10U ABCl 16 和 Mik-β I 與多種 CD 122 結(jié)構(gòu)的結(jié)合。
圖19. ABC2、ABC101、ABCl 16和Mik-β I與多種人CD122的單氨基酸取代突變體的結(jié)合。
圖20.在GM-CSF、IL-2或IL-15/IL-15Ra復(fù)合物存在下，可表達野生型或突變型⑶122的TF-I轉(zhuǎn)染子的生長。
定義
單克隆抗體或其他生物實體，如⑶122的一個片段通常以分離的形式提供。這意味著抗體或其他生物實體通常是源自產(chǎn)物或提純物的干擾蛋白或其他污染物的至少50% w/w的純度，但不排除這樣的可能，即所述的抗體與過量的一種(或多種)藥物上可接受的載體 或其他介質(zhì)結(jié)合，以方便其使用。通常分離的單克隆抗體或其他的生物實體劑是純化后剩余的優(yōu)勢大分子種類。
單克隆抗體與其靶抗原的的特異性結(jié)合意味著親非和力至少有106、107、108、109或IOkiM'特異性結(jié)合可檢測到更高的量級，且可從非特異性結(jié)合至少一個不相關(guān)靶標(biāo)的情況中區(qū)分。特異性結(jié)合能產(chǎn)生于特定官能團或特定空間配合(例如，鎖和鑰匙型)之間形成的鍵，而非特異性結(jié)合產(chǎn)生于范德華力。然而特異性結(jié)合并不必然意味著單克隆抗體只結(jié)合一個且只有一個祀標(biāo)。
當(dāng)CD122中的突變抑制了抗體與CD122的特異性結(jié)合，該結(jié)合強度(無論是由復(fù)合信號、親和常數(shù)或其他測量方法)檢測結(jié)果較CD122(SEQ ID NO :73)的野生型形式低(例如，降低至超過平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差，SEM)，且可比野生型形式的結(jié)合低50%或10%。所述結(jié)合的減少也可以通過與陽性對照抗體的結(jié)合對比而進行評估，如實施例中使用的市售的L5抗FLAG 抗體，該陽性對照抗體結(jié)合于鏈接到CD122的FLAG 多肽。例如，如果抗體與突變CD 122的結(jié)合強度低于抗FLAG抗體與鏈接的FLAG 多肽的結(jié)合強度的50%或更優(yōu)地低于10%，則所述突變可抑制抗⑶122抗體的結(jié)合。
基本的抗體結(jié)構(gòu)單元是由亞基組成的四聚體。每個四聚體包含兩對相同的多肽鏈，每對多肽鏈有一個“輕”鏈(約25kDa)和一個“重”鏈(約50-70kDa)。每條鏈的氨基末端部分包括一個可變區(qū)來主要負責(zé)抗原識別，可變區(qū)約100至110或更多的氨基酸。該可變區(qū)最初被表達時連接到一個可分裂的信號肽上。沒有信號肽的可變區(qū)，有時也被稱為成熟的可變區(qū)。因此，例如，成熟的輕鏈可變區(qū)，意味著沒有輕鏈信號肽的輕鏈可變區(qū)。每條鏈的羧基末端部分被定義為恒定區(qū)，主要負責(zé)效應(yīng)功能。
輕鏈被分類為為K或λ輕鏈。重鏈被分類為γ、μ、α、δ或ε ,并定義對應(yīng)抗體的同種型(isotype)分別為IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。在輕鏈和重鏈內(nèi)，可變區(qū)和恒定區(qū)通過一個約12個或12個以上的氨基酸的“J”區(qū)連接，同時重鏈還包括一個約10個或更多個氨基酸“D”區(qū)。
每個輕/重鏈對的成熟可變區(qū)形成抗體結(jié)合位點。因此，一個完整的抗體具有2個結(jié)合位點。除雙功能抗體或雙特異性抗體外，所述兩個結(jié)合位點是相同的。所述的鏈都表現(xiàn)出相同的通用結(jié)構(gòu)或相對保守的骨架區(qū)(FR)，其通過3個高變區(qū)連接，所述的高變區(qū)也叫互補決定區(qū)或CDRs。源自每個輕/重鏈對的兩條鏈的CDRs是由框架區(qū)對準(zhǔn)，以結(jié)合到特定的抗原表位。從N-末端至C-末端，輕鏈和重鏈均包括結(jié)構(gòu)域FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、⑶R3和FR4。每個結(jié)構(gòu)域的氨基酸分配與Kabat《免疫學(xué)重要的蛋白質(zhì)的序列》(Sequencesof Proteins of Immunological Interest)(國立衛(wèi)生研究院，Bethesda,MD, 1987和 1991)中的定義或 Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196 :901-917(1987) ;Chothia 等，Nature 342 878-883(1989)的定義是一致的。Kabat的還提供了一種廣泛使用的編號慣例(Kabat編號)，其中，不同重鏈或不同輕鏈之間的相應(yīng)殘基被分配了相同的編號。
術(shù)語“抗體”包括完整的抗體和其所結(jié)合的片段。通常情況下，片段與產(chǎn)生它們的完整的抗體競爭結(jié)合特定的靶標(biāo)，包括單獨的重鏈和輕鏈Fab、Fab'、F (ab' )2、F (ab) C、Dabs、納米體和Fv。片段可以產(chǎn)生自重組DNA技術(shù)完整的免疫球蛋白酶分離或化學(xué)分離。術(shù)語“抗體”還包括雙特異性抗體。雙特異性抗體或雙功能抗體是具有兩個不同的重/輕鏈對和兩個不同結(jié)合位點的人工雜交抗體。
術(shù)語“抗原表位”是指位于抗原上的能與抗體結(jié)合的位點。抗原表位可由一個或多個蛋白三級折疊的并列的連續(xù)的氨基酸或不連續(xù)的氨基酸形成。由連續(xù)氨基酸形成的抗原表位(也稱為線性表位)通常暴露于變性劑后受影響，而由三級折疊形成的抗原表位(也稱為構(gòu)象表位)通常經(jīng)變性劑處理后不受影響。抗原表位的獨特空間構(gòu)象中通常包括至少為3個，更通常為5個或8-10個氨基酸?？乖砦华毺乜臻g構(gòu)象的測定方法包括，例如，X-射線結(jié)晶學(xué)和二維核磁共振，見，例如 Methods in Molecular Biology, Vol. 66,Glenn E. Morris,Ed. (1996)中的抗原表位定位標(biāo)準(zhǔn)試驗流程(Epitope Mapping Protocols)。。
識別相同或重疊抗原表位的抗體可被簡單的免疫分析法檢定，該免疫分析法顯示一個抗體相對于另一個抗體競爭結(jié)合靶抗原的能力?？贵w的對應(yīng)抗原表位也可以是確定的結(jié)合于抗原的抗體的X-射線晶體學(xué)(以鑒定接觸殘基)?；蛘撸绻蓽p少或消除一種抗體結(jié)合的抗原所有氨基酸突變類型也可減少或消除另一種抗體的結(jié)合，則這兩種抗體具有相同的抗原表位。如果可減少或消除一種抗體結(jié)合的抗原某些氨基酸突變類型也可減少或消除另一種抗體的結(jié)合，則這兩種抗體具有重疊的抗原表位。
抗體間的競爭由試驗分析來確定，其中被測的抗體抑制參照抗體與共有抗原的特異結(jié)合(見，如Junghans等，Cancer Res. 50 :1495,1990)。在競爭性結(jié)合試驗分析中，若過量的被測試抗體(例如，至少2x、5x、10x、20x或IOOx)抑制至少50%，但優(yōu)選為75%、90%或99%參照抗體的結(jié)合，則被測試抗體與參照抗體競爭。由競爭法確定的抗體(競爭性抗體)包括與參照抗體具有相同結(jié)合抗原表位的抗體，及與一個毗鄰抗原表位(由于空間位阻發(fā)生，該毗鄰抗原表位充分接近與參照抗體結(jié)合的抗原表位)結(jié)合的抗體。
術(shù)語“患者”包括接受預(yù)防或治療處理的人類和其他哺乳動物測試體。
為了對氨基酸替換的保守性和非保守性進行分類，氨基酸分組如下組I (疏水性側(cè)鏈)甲硫氨酸、丙氨酸、纈氨酸亮，氨酸、異亮氨酸；組II (中性親水性側(cè)鏈)半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸；組III (酸性側(cè)鏈)天冬氨酸、谷氨酸；組IV(基本側(cè)鏈)天冬酰胺、谷氨酰胺、組氨酸、賴氨酸、精氨酸；組V(影響鏈定位的殘基)甘氨酸、脯氨酸；組VI (芳香側(cè)鏈)色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸。保守的替換涉及同一類氨基酸之間的替換，非保守替換構(gòu)成一類氨基酸的成員被另一類氨基酸的成員替換。
序列一致性百分率根據(jù)Kabat編號法則對抗體序列進行最大比對。如果受試抗體區(qū)域(如一條輕鏈或一條重鏈的完整的成熟可變區(qū))與一個參照抗體的相同序列比對，比對后，受試抗體與參照抗體相同序列百分率為受試抗體與參照抗體中占據(jù)相同位置的氨基酸數(shù)量除以兩個區(qū)域的比對位置的總數(shù)，缺口不算在內(nèi)，乘以100以轉(zhuǎn)換成百分率。
“包括”的一個或多個例舉元素的組合物或方法還囊括其它沒有特別例舉的元素。例如，一個包括抗體的組合物，該組合物可以僅含有該抗體，也可與其它成分相結(jié)合。詳細說明
I.概要
本發(fā)明提供單克隆抗體，該抗體特異性地結(jié)合⑶122，⑶122是IL-2和IL-15的受體的一個組分。所述單克隆抗體實質(zhì)上可以抑制IL-2和IL-15介導(dǎo)的功能，這是通過抑制這些細胞因子與它們的受體結(jié)合實現(xiàn)的。所述單克隆抗體可以用于抑制不需要的免疫反應(yīng)或治療癌癥，以及其他應(yīng)用。
II.革巴#〒
除非另有說明，CD122是指人CD122。一個示例性的人類序列被指定為Swiss Prot注冊號P14784。其中已知的自然等位基因的變異性包括10L —V :dbSNP rs57770674、83 S —F，dbSNP rs2228143 和 391 D — E :dbSNP rs228942。完整的人 CD122 序列具有 551 個氨基酸，其中氨基酸1-26為一個信號肽。約27-240殘基構(gòu)成胞外結(jié)構(gòu)域。約241-265殘基構(gòu)成跨膜結(jié)構(gòu)域，約266-551殘基構(gòu)成胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的所述抗體結(jié)合到位于CD122胞 外結(jié)構(gòu)域內(nèi)的抗原表位。
突變殘基通過SEQ ID N0:73定義，SEQ ID NO :73為無信號序列的完整的CD122序列。如果在結(jié)合實驗中實際使用的CD122不同于SEQ ID NO :73 (例如，N-端截短的SEQ ID NO:73)，則突變體為當(dāng)與SEQ ID NO 73進行最大匹配時，任何形式所使用的⑶122的相應(yīng)殘基。
如背景中討論的，⑶122與⑶132、⑶25和/或IL-15Ra的結(jié)合形成受體。簡言之，⑶122和⑶132的組合構(gòu)成的受體對IL-2和IL-15具有中等親合力。⑶122、⑶132和⑶25的組合構(gòu)成的受體對IL-2具有高親和力，而⑶122、⑶132和IL_15Ra的構(gòu)成的受體對IL-15具有高親和力。
除非另有指明，否則⑶132、⑶25和/或IL-15Ra是指這些蛋白質(zhì)的人類形式。人⑶132的一個示例性人類序列被指定為Swiss Prot注冊號P31785，這是一種含369個氨基酸的蛋白質(zhì)，其中約殘基1-22是信號肽，23-262是胞外結(jié)構(gòu)域，263-283是跨膜結(jié)構(gòu)域，284-369是胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
⑶25的示例性的人類序列被指定Swiss Prot P01589，它有272個殘基，其中約殘基1-21是信號肽，22-240是胞外結(jié)構(gòu)域，殘基241-259是跨膜結(jié)構(gòu)域，殘基260-272是胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
IL-15Ra的示例性的人類序列被指定Swiss Prot Q13261，它有267個殘基，其中約殘基1-30是信號肽，31-205是胞外結(jié)構(gòu)域，殘基206-228是跨膜結(jié)構(gòu)域，殘基229-267是胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
除非以其他方式從上下文可知，參照上述受體之一意味著至少指蛋白質(zhì)的細胞外結(jié)構(gòu)域，通常也指完整的蛋白質(zhì)，而不是可裂解的信號肽。
如背景中討論的，上述受體與IL-2和IL-15結(jié)合，其中后者可以表現(xiàn)為順式或反式。除非另從上下文可知，這些分子是指這些蛋白質(zhì)的人類形式。人IL-2的示例性序列被指定為Swiss Prot P60568，它是一種含153個氨基酸的蛋白質(zhì)，其中氨基酸1-20是信號肽。人IL-15的示例性序列的被指定為Swiss Prot P40933，它是一種含162個氨基酸的蛋白質(zhì)，其中氨基酸1_29是彳目號妝。除非另從上下文可知，參照IL-2或IL-15意味著是已經(jīng)去除信號肽的成熟蛋白。III.本發(fā)明的抗體
A.結(jié)合特異性和功能特性
本發(fā)明提供能與CD122蛋白內(nèi)的抗原表位結(jié)合的單克隆抗體。指定的抗體ABC2和ABClOl就是2個這樣的示例性的小鼠抗體。ABC2和ABClOl均可特異性結(jié)合人類⑶122。本發(fā)明中ABC2、ABClOl和一些其它的抗體，其特征在于，其進一步可特異性結(jié)合到獼猴⑶122，且不能有效地與小鼠和狗⑶122結(jié)合。結(jié)合到⑶122被證明為單獨結(jié)合⑶122和/或上面討論的并入了 CD122的受體。本發(fā)明的單克隆抗體，其特征在于，單克隆抗體作為一個單一試劑，可以阻止并入了 CD122的受體與IL-2和IL-15的結(jié)合及隨后作為應(yīng)答的細胞增殖的信號。
優(yōu)選的抗體可以抑制IL-2和IL-15結(jié)合到并入了 CD122的低和高親和力受體，也可抑制IL-15的順式和反式結(jié)合。這樣的抗體區(qū)別于以前報道對⑶122的抗體，包括Mik-β I和其人源化形式。如實施例8中所示，HuMik-β I僅示出了抑制可溶型IL-15介導(dǎo)的細胞 (該細胞具有CD122)增殖的弱能力，且不能檢測出抑制IL-2介導(dǎo)的細胞增殖(該細胞具有高親和力IL-2受體，包括⑶122)的能力。Mik-β I、其人源化形式和其它已知的抗⑶122抗體來也缺乏任何或至少實質(zhì)的能力來抑制以反式呈遞呈現(xiàn)的IL-15。
抑制可以用結(jié)合試驗來證明，其中，細胞上表達的并入了 CD122的受體，在被測試抗體的存在下，與IL-2或IL-15結(jié)合?？商鎿Q地，或另外地，抑制也可以用如下方法證明，即在IL-2或IL-15存在下于合適細胞上表達并入了⑶122的受體，然后測試單克隆抗體對IL-2或IL-15介導(dǎo)的細胞增殖的效果。抑制IL-15可以在這樣的模式下順式或反式測試。體現(xiàn)抑制的示例性的測定模式在實施例中有描述。任選地，所試抗體的抑制也通過與下述物質(zhì)進行比較而證明，即不結(jié)合CD122或其受體聯(lián)合組件的不相關(guān)對照抗體、或IL-2及IL-15、或不含抗體的載體。
實質(zhì)性抑制意味著至少抑制25、30、40、50或75% (如25-75%或30-70% )的由IL-2或IL-15介導(dǎo)的結(jié)合、細胞的增殖和/或其他功能活性。抑制通常在如下條件下可證明，即相對于IL-2或IL-15配體，抗體不超過100倍摩爾過量(例如，2_50或2_10或2_5倍摩爾過量)。對于功能測定，在抗體存在條件下，IL-2或IL-15通常呈現(xiàn)為可充分刺激功能活性所需的最低劑量水平?？贵w通常為50ηΜ-5 μ M之間的濃度。優(yōu)選的抗體顯示可抑制IL-2與低或高親和力受體(或兩者)相互作用的至少40%，對以順式和反式呈現(xiàn)的IL-15的抑制則至少為40%。抑制程度也可以被量化為50%增殖抑制濃度(IC50)，如實施例2和實施例8中描述的，所述的增殖是由IL-15反式介導(dǎo)至TF-I β細胞所致。抗體的濃度低于2 μ g/ml,且優(yōu)選地,低于I μ g/ml,如O. 1-1或O. 5-1 μ g/ml是優(yōu)選的。如實施例8中描述的，能抑制IL-2介導(dǎo)的TF-I α β增殖(該細胞具有高親和力IL-2受體)50%的抗體濃度優(yōu)選地低于 100 或 50 μ g/ml,如 10-50 μ g/ml。
從這些結(jié)果中可明顯發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的抗體的IC50取決于被抑制的相互作用的性質(zhì)。對于具有高親和力IL-2受體的細胞，相比于抑制IL-15的反式呈遞，抗⑶122抗體對IL-2的抑制更困難(即，相同的所需抗體的濃度更高)。對于只具有中等親合力IL-2受體的細胞，相比于抑制可溶性IL-2或IL-15，抑制IL-15反式呈遞更困難(即，相同的所需抗體的濃度更高)。
在動物模型或臨床試驗中，優(yōu)選的抗體也能抑制免疫性失調(diào)或癌癥。在實施例中討論了動物模型中對抗移植物抗宿主疾病的測試活性。動物模型的一些其他示例在背景技術(shù)部分中討論。其中一個這樣的模型是由Villadsen等人(同上)描述的SCID/牛皮癬模型。在非人類靈長類動物的器官移植中，可與猴CD122交叉反應(yīng)的抗人CD122抗體可被測試(Tinubu等人，同上)。腫瘤動物模型被廣泛使用，其中人類腫瘤細胞被注入到免疫缺陷實驗動物體內(nèi)，如小鼠或大鼠。
本發(fā)明的某些抗體可結(jié)合到與一個抗體(被指定為ABC2或ABC101)相同的或覆蓋的抗原表位。這些抗體的成熟的可變區(qū)的重鏈和輕鏈被分別指定為SEQ ID NO S. 25和30，及35和40。其它具有該結(jié)合特征的抗體能通過以下方法獲得用CD122或含有所期望抗原表位的CD122的一部分來免疫小鼠,然后篩選能結(jié)合CD122的抗體,可選擇地,可與ABC2或ABClOl競爭的抗體。通過該試驗認定的抗體可將之篩選以用于抑制IL-2和IL-15的相互作用，這在實施例中和其他部分有所描述。也可對突變形式的CD122抗原的相應(yīng)抗體進行篩選，以鑒定出能顯示與ABC2或ABClOl具有相同或相似結(jié)合屬性的抗體(結(jié)合于突變改變集合)。所述的突變可以是位于貫穿CD122胞外結(jié)構(gòu)域或其一部分(具有抗原表位)的每次一個殘基的丙氨酸替換(若丙氨酸已有，或者為絲氨酸)，或更廣泛的多個空間間隔上的替換。
SEQ ID NO 73殘基42,43和65的突變可抑制ABC2特異性地結(jié)合CD 122 (例如，實施例中描述的，< 10%的陽性對照抗FLAG抗體的結(jié)合)。同樣，SEQ ID NO :73殘基65、70和133的突變可抑制ABClOl特異性結(jié)合到CD122。由于相對極少的殘基可影響結(jié)合，且所述的殘基在空間的分布比一個典型的線性表位(例如3-20個連續(xù)氨基酸)分布更廣泛，這些結(jié)果顯示，ABClOl并且很可能ABC2結(jié)合到構(gòu)象表位?；蛘?，一個或多個影響結(jié)合的殘基可不直接接觸抗體而別構(gòu)調(diào)節(jié)。65號殘基突變?yōu)樘K氨酸可以抑制結(jié)合，而突變?yōu)楸彼岵灰种平Y(jié)合的現(xiàn)象表明，該殘基對結(jié)合的影響是變構(gòu)調(diào)節(jié)的。結(jié)合抗原表位(該表位包括SEQ IDNO73的42、43、65、70和133殘基中的一個或更多個殘基)的其他抗體，且特別地，結(jié)合抗原表位(該表位包括42、65和133殘基中的一個或更多個殘基)的抗體，很可能共享ABC2及ABClOl的結(jié)合屬性。因此，當(dāng)一種抗體，其特異性結(jié)合可被SEQ ID NO :73殘基42、43和65中一個或多個突變抑制，或特別地，被42和65殘基的突變抑制，則該抗體共享ABC2的相似屬性。一些這樣的抗體可結(jié)合到一個抗原表位，該抗原表位包括SEQ ID NO:73的42、43和/或65殘基或者由其組成。一些這樣的抗體可結(jié)合到一個抗原表位，該抗原表位包括42和43殘基或者由其組成，且在其中殘基65別構(gòu)影響抗體的結(jié)合。所述的抗原可以是線性的，例如一個抗原表位(例如，2-5，3-5，3-10，3-15，3-20, 5-10，5-15或5-20個連續(xù)氨基酸)包括指定的氨基酸(42、43和65)中的一個、兩個或全部三個，或由其組成，所述的抗原表位也可以是構(gòu)象表位，其包括指定的氨基酸中的一個，兩個或全部三個，或由其組成。特異性結(jié)合可以被突變(SEQID NO 73的殘基65、70和133中一個、兩個或全部三個突變)阻止的抗體很可能與ABClOl共享相似的抑制屬性。一些這樣的抗體可結(jié)合到一個抗原表位，該抗原表位具有SEQ ID NO : 73的65或133殘基，或65和133殘基。這樣的抗原表位可以是線性表位(例如，2-5、3-5、3-10、3-15、3-20、5-10、5-15或5-20個連續(xù)氨基酸)，其包括指定的氨基酸出5、70和133)中的一個，兩個或全部三個，或由其組成。某些本發(fā)明的抗體可特異性結(jié)合于CD122，該結(jié)合實質(zhì)上并不被取代SEQ ID NO 73的殘基39或41 (取代為丙氨酸)阻止(例如，實施例中描述的，至少陽性對照抗體結(jié)合的50%)。(39和41殘基的突變抑制Mik-β I抗體的結(jié)合。)。任何上述抗體類型包括這樣的抗體，該抗體特異性結(jié)合到抗原表位(該表位不包括SEQ ID NO 73的殘基39或41)，或換句話說，該抗體與⑶122的結(jié)合并不能被殘基的取代檢測性地抑制(在實施例中，高于陽性對照抗FLAG抗體50%的
口口乂 O
結(jié)合到抗原表位的抗體，所述的抗原表位含有一個或多個特定殘基，可以通過免疫處理CD122的片段(該片段含有這些一個或多個特定殘基)而產(chǎn)生。片段可以例如具有不超過SEQ ID NO :73的100、50、25、10或5個連續(xù)的氨基酸。通常有這樣的片段至少有SEQ IDNO 73中的5個，6個，7個，8個或9個連續(xù)的殘基。這些片段可以被鏈接到載體，這有利于誘發(fā)應(yīng)對該片段的抗體反應(yīng)的產(chǎn)生，且/或與一個佐劑結(jié)合以幫助誘發(fā)上述反應(yīng)。結(jié)合到所希望殘基的抗體也可通過如下方法產(chǎn)生免疫處理一個全長CD122(信號序列除外)或纖連蛋白III結(jié)構(gòu)域I和/或2的全長胞外結(jié)構(gòu)域(信號序列除外)。然后，這樣的抗體可以被篩選以差異性地結(jié)合人和鼠的雜交CD 122，或與特定殘基突變的突變型對比，被篩選以差
異性結(jié)合野生型⑶122。針對人和鼠的雜交⑶122的篩選可以定位結(jié)合于⑶122內(nèi)特定結(jié)構(gòu)域(例如纖維連接蛋白III結(jié)構(gòu)域I和/或2)的抗體。針對突變體的篩選更精確地定義了結(jié)合特異性，以允許認定這樣一些抗體，其結(jié)合可以通過殘基43、43、65、70和/或133的突變而受抑制，且與示例抗體共享抑制屬性。
具有選定的的鼠抗體的結(jié)合特異性的抗體(如ABC2或ABC101)也可以用多種噬菌體展示技術(shù)生產(chǎn)。見Winter，WO 92/20791。此方法是特別適合用于生產(chǎn)人抗體。在該方法中，選定的鼠抗體的重鏈或輕鏈可變區(qū)作為起始材料使用。例如，如果輕鏈可變區(qū)被選作起始材料，一個噬菌體文庫被構(gòu)建，其中的組分顯示相同的所述輕鏈可變區(qū)(即鼠起始材料)和不同的重鏈可變區(qū)。所述的重鏈可變區(qū)能例如產(chǎn)生自一個重排的人重鏈可變區(qū)的文庫。對⑶122顯示強特異性結(jié)合(例如，至少108，優(yōu)選至少IO9M4)的噬菌體被篩選。所述的來自該噬菌體的重鏈可變區(qū)然后作為起始材料用于進一步構(gòu)建一個噬菌體文庫。在這個文庫中，每個噬菌體顯示相同的重鏈可變區(qū)(即第一個顯示文庫認定的區(qū)域)和不同的輕鏈可變區(qū)。所述的輕鏈可變區(qū)能例如產(chǎn)生自一個重排的人輕鏈可變區(qū)的文庫。同理，對CD122顯示強特異性結(jié)合的噬菌體被篩選。所生成的抗體通常與鼠起始材料有相同或相似的抗原表位特異性。
其它抗體可以通過突變編碼示例抗體(如ABC2或ABC101)重鏈和輕鏈的cDNA的方式獲得。本發(fā)明還包括這樣一些單克隆抗體，它們與ABC2或ABClOl的成熟重和/或輕鏈可變區(qū)氨基酸序列至少有90%、95%或99%相同，且保持其功能特性，和/或由于少部分功能上不重要的氨基酸替換(如保守性替換)，缺失，或插入，不同于單獨的抗體。本發(fā)明還包括這樣一些單克隆抗體，它們具有至少一個，更優(yōu)地為6個CDR(S)(由Kabat定義)，它們與ABC2 或 ABClOl 相應(yīng)的 CDRs 具有 90%、95%、99%或 100%相同。
B.非人抗體
其他應(yīng)對CD122的非人單克隆抗體，例如，鼠、豚鼠、靈長類動物、兔或大鼠，其生產(chǎn)可以通過，例如，免疫動物來獲得，該免疫可以使用⑶122或它們的片段、具有⑶122的細胞，任選地，以上討論過的共同表達其共受體蛋白的細胞。見Harlow & Lane, Antibodies, ALaboratory Manual (CSHP NY, 1988)(以引用的方式并入本文中)。這樣的免疫原能天然獲得、通過肽合成法獲得或重組表達。任選地，所述免疫原的操作能通過混合或與載體蛋白絡(luò)合。任選地，所述免疫原的操作能通過佐劑。如下文所述，多種類型的佐劑可以被使用。弗氏完全佐劑及隨后使用弗氏不完全佐劑對于免疫試驗動物是優(yōu)選的。兔子和豚鼠通常用來制作多克隆抗體。小鼠通常用于制備單克隆抗體?？贵w被篩選用于與CD122的特異性結(jié)合。所述的篩選可以通過測定抗體與一組⑶122刪除突變的結(jié)合而進行，然后測定哪一種刪除突變結(jié)合了該抗體。結(jié)合可以通過例如Western blot、FACS或ELISA被分析。
C-人源化抗體
人源化抗體是一種基因工程抗體，其中來自于非人“供體”抗體的CDRs被轉(zhuǎn)移到人“受體”的抗體序列上(見，例如 Queen，US 5, 530, 101 and 5, 585, 089 ；ffinter,US 5,225,539，Carter, US 6, 407, 213, Adair, US 5, 859, 205 6，881，557，F(xiàn)oote，US 6,881,557)。所述受體抗體序列可以是，例如，一個成熟的人抗體序列，這樣的序列的組合物，人抗體序列的共有序列，或一個種系的區(qū)域序列。因此，人源化抗體是這樣一種抗體，該抗體具有全部或?qū)嵸|(zhì)上源于供體抗體的某些或所有的CDRs，及可變區(qū)框架序列和恒定序列，如果存在，完全或?qū)嵸|(zhì)上源于人抗體序列。同樣地，人源化的重鏈具有至少一個，兩個和通常所有三個CDRs， 其完全或?qū)嵸|(zhì)上源自一個供體抗體的重鏈，及重鏈可變區(qū)框架序列和重鏈恒定區(qū)，如果存在的話，基本上源自人重鏈可變區(qū)框架和恒定區(qū)序列。同樣地，人源化輕鏈具有至少一個，兩個和通常所有三個CDRs，其完全或?qū)嵸|(zhì)上源于一個供體抗體的輕鏈，及輕鏈可變區(qū)框架序列和輕鏈恒定區(qū)，如果存在的話，基本上源自人輕鏈可變區(qū)的框架和恒定區(qū)序列。除了納米抗體和dAbs外，人源化抗體包括人源化重鏈和人源化輕鏈。當(dāng)各自CDRs的相應(yīng)殘基(由Kabat定義)至少有85 %、90 %、95 %或100 %是相同時，人源化抗體的一個CDR實質(zhì)上源自相應(yīng)的非人類抗體CDR。當(dāng)85、90、95或100%相應(yīng)殘基(由Kabat定義)相同時，抗體鏈的可變區(qū)框架序列或抗體鏈的恒定區(qū)實質(zhì)上分別源自人可變區(qū)框架序列或人恒定區(qū)序列。
雖然人源化抗體通常并入6個源自鼠抗體的CDRs (優(yōu)選由Kabat定義)，它們也可以被制成少于全部⑶Rs的抗體(例如，至少為3、4或5),⑶Rs源自鼠抗體(如Pascalis等，J. Immunol. 169 :3076, 2002 ；Vajdos 等，Journal of Molecular Biology, 320 415-428, 2002 ；Iwahashi 等，Mol. Tmmunol. 36 :1079-1091,1999 ；Tamura 等，Journal ofImmunology, 164 :1432-1441,2000)
在一些抗體中，只有CDRs的一部分，即用于結(jié)合所需要的CDR殘基的子集，稱為特異性決定殘基(SDRs)，需要在人源化抗體中保留以供結(jié)合使用。不接觸抗原的且不在SDRs內(nèi)的⑶R殘基，可以通過以往的研究加以認定(例如在⑶R H2中的殘基H60-H65常常不是必需的)，或在位于 Chothia 超變量環(huán)之外的 Kabat CDRs 區(qū)域(Chothia, J. Mol. Biol. 196 :901,1987),或用分子建模和或以經(jīng)驗為主地,或如Gonzales等在Mol. Immunol. 41 :863, 2004中所描述的。人源化抗體的某些位置的一個或更多供體CDR殘基空缺或全部供體CDR消失，占據(jù)在該位置上的氨基酸可以是占據(jù)受體抗體序列的相應(yīng)位點(根據(jù)Kabat編碼)的氨基酸。受體的CDR中的供體氨基酸替換數(shù)目反映了競爭平衡的考慮。這種替換對于減少人源化抗體中鼠氨基酸的數(shù)目從而減少潛在的免疫原性是有潛在優(yōu)點的。然而，所述的替換也可能導(dǎo)致親和性變化，要優(yōu)先避免親和力顯著減少。CDRs內(nèi)的替換位點和替換氨基酸的選擇可以依據(jù)經(jīng)驗。
人受體抗體序列可以任選地選自于眾多已知的人抗體序列，以提供人受體序列的可變區(qū)框架和相應(yīng)的供體抗體鏈的可變區(qū)框架的高度序列同一性(例如,65-85%的同一性)。源自人可變區(qū)框架殘基的某些氨基酸可被選擇以用于替換，該替換是基于它們對CDR構(gòu)象和/或?qū)乖慕Y(jié)合的影響。檢測這種影響可以通過如下方法進行建模、檢測特定位置的氨基酸的特征、或經(jīng)驗觀測替換帶來的影響、或誘變特定的氨基酸。
例如，當(dāng)鼠的可變區(qū)框架殘基和一個選定的人可變區(qū)框架殘基之間的氨基酸不同，人框架氨基酸可以被源自鼠抗體的等效框架氨基酸取代，只要氨基酸可被合理地預(yù)期
(1)與抗原直接非共價結(jié)合，
(2)毗鄰CDR區(qū)域，
(3)否則與CDR區(qū)相互作用(例如在一個CDR區(qū)內(nèi)約6A )。
其他替換候選是在那個位點通常不作為人免疫球蛋白的受體人框架氨基酸。這些氨基酸可被源自鼠供體抗體同等位置的氨基酸替換，或被源自更典型的人免疫球蛋白同等位置的氨基酸替換。其他替換候選是在那個位點通常不作為人免疫球蛋白的受體人框架氨基酸。
本發(fā)明的一個示例性的人源化抗體是ABC2的人源化形式，其特征在于一個SEQ ID NO:42的成熟的輕鏈可變區(qū)的和一個SEQ ID N0:41的成熟的重鏈可變區(qū)，且被指定為HuABC2。本發(fā)明還提供HuABC2的變異型。這樣的變異型通常由少數(shù)(例如，典型地不超過1、2、3、5或10)替換、缺失或插入而造成與HuABC2序列的不同。這種差異通常發(fā)生在框架中，但也可發(fā)生在CDRs。例如，只有在H28、H48、H49、H68、H93和L71位點的替換子集可以被制備。人源化的單克隆抗體(mAb)中許多不接觸CDRs的框架殘基能適應(yīng)源于供體鼠mAb或其他鼠或人抗體的相應(yīng)位置的氨基酸的替換，且甚至許多潛在的CDR-接觸殘基也服從替換或CDRs內(nèi)的的氨基酸可以被改變。一個示例性的CDR替換是將一個CDR內(nèi)的一個殘基替換為用于提供可變區(qū)框架的占據(jù)人受體序列相應(yīng)位置的殘基。
通常，在變異的人源化ABC2序列內(nèi)的替換關(guān)于被替換的HuABC2氨基酸是保守的。優(yōu)選地，發(fā)生在HuABC2內(nèi)的替換(不論是否保守)對結(jié)合親和力或人源化mAb效價沒有實質(zhì)性的效果，即，它抑制包括⑶122的受體與IL-2和IL-15之間相互作用的能力(例如，展示的實施例和背景中描述的分析方法中的一些或所有變型的人源化ABC2抗體“效價”本質(zhì)上是相同的，即，實驗誤差范圍內(nèi)，與HuABC2 “效價”相同)。優(yōu)選地，成熟的變型的輕鏈和重鏈V區(qū)的序列至少90 %，更優(yōu)地，至少95 %，并且最優(yōu)選地，至少98 %相同于各自的HuABC2成熟的輕鏈和重鏈V區(qū)。或者，特別是那些與ABC2的可變區(qū)框架序列具有高度序列一致性的其他人抗體受體序列，也適合提供人源化抗體可變區(qū)框架序列。
在一些變型的HuABC2中，至少1、2、3、4、5或所有6個受體-供體替換位點，其已在示例性抗體中提及(即H28、H48、H49、H68，、H93和L71)，優(yōu)選地分別被殘基T、I、A、I、A和Y替換(所述殘基占據(jù)鼠供體抗體重鏈的相應(yīng)位置)。在一些變型體中，H42被G替換。如果所述重鏈?zhǔn)荏w序列是DA430129cDNA (GenBank登錄號)編碼的序列之外的序列，或所述輕鏈?zhǔn)荏w序列M29469cDNA (GenBank登錄號)編碼的序列之外的序列，受體-供體替換對于特定可變框架區(qū)位點的特定占據(jù)可以是或不是必須的，這取決于占據(jù)特定位點的殘基是否在受體與供體之間相同。
本發(fā)明的另一示例性的人源化抗體是ABClOl的人源化形式，其特征為一個SEQ ID NO44的成熟的輕鏈可變區(qū)和一個SEQ ID NO :43的成熟的重鏈可變區(qū)的，且被指定HuABClOl。本發(fā)明還提供HuABClOl的變異型。這樣的變異型通常由少數(shù)(例如，典型地不超過1、2、3、5或10)替換、缺失或插入而造成與HuABClOl序列的不同。這種差異通常發(fā)生在框架中，但也可發(fā)生在CDRs。例如，只有在H27、H30、H48、H66、H67、H71和L49位點的替換子集可以被制備。人源化抗體中許多不接觸CDRs的框架殘基能適應(yīng)源于供體鼠抗體或其他鼠或人抗體的相應(yīng)位置的氨基酸的替換，且甚至許多潛在的CDR-接觸殘基也服從替換或CDRs內(nèi)的的氨基酸可以被改變。一個示例性的CDR替換是將一個CDR內(nèi)的一個殘基替換為用于提供可變區(qū)框架的占據(jù)人受體序列相應(yīng)位置的殘基。
通常，在變異的人源化ABClOl序列內(nèi)的替換關(guān)于被替換的ABClOl氨基酸是保守的。優(yōu)選地，發(fā)生在ABClOl內(nèi)的替換(不論是否保守)對結(jié)合親和力或人源化mAb效價沒有實質(zhì)性的效果，即，它抑制包括⑶122的受體與IL-2和IL-15之間相互作用的能力(例如，展示的實施例和背景中描述的分析方法中的一些或所有變型的人源化ABClOl抗體“效價”本質(zhì)上是相同的，即，實驗誤差范圍內(nèi)，與HuABC2 “效價”相同)。優(yōu)選地，成熟的變型的輕鏈和重鏈V區(qū)的序列至少90 %，更優(yōu)地，至少95 %，并且最優(yōu)選地，至少98 %相同于各自的HuABClOl成熟的輕鏈和重鏈V區(qū)?；蛘?，特別是那些與HuABClOl的可變區(qū)框架序列具有高度序列一致性的其他人抗體可變區(qū)框架受體序列，也適合提供人源化抗體框架。
在一些變型的HuABClOl中，至少1、2、3、4、5、6或所有7個受體-供體替換位點，其已在示例性抗體中提及(即H27、H30、H48、H66、H67、H71和L49)，優(yōu)選地分別被殘基Y、T、M、Q、I、R和K替換(所述殘基占據(jù)小鼠供體抗體重鏈的相應(yīng)位置)。如果所述重鏈?zhǔn)荏w序列是DA936142cDNA(GenBank登錄號)編碼的序列之外的序列，或所述輕鏈?zhǔn)荏w序列Z46622cDNA (GenBank登錄號)編碼的序列之外的序列，受體-供體替換對于特定可變框架區(qū)位點的特定占據(jù)可以是或不是必須的，這取決于占據(jù)特定位點的殘基是否在受體與供體之間相同。
P-嵌合抗體與飾面抗體
本發(fā)明進一步提供了非人類抗體，特別是實施例中的ABC2和ABClOl抗體，其嵌合形式與飾面形式(Veneered)。
嵌合抗體是這樣一種抗體，其中非人類抗體(例如，鼠)的輕鏈和重鏈的成熟的可變區(qū)與人輕鏈和重鏈恒定區(qū)結(jié)合。這樣的抗體，實質(zhì)上或完全保留鼠抗體的結(jié)合特異性，并且具有大約三分之二的人類序列。
飾面抗體是這樣一種類型的人源化抗體，該抗體保留一些通常所有非人抗體的CDRs和一些的非人可變區(qū)框架殘基，但將其他可變區(qū)框架殘基(可能對B或T細胞抗原表位有貢獻，例如暴露的殘基(Padlan, Mol. Immunol. 28 :489,1991)取代為源自人抗體序列相應(yīng)位點的殘基。其結(jié)果是這樣一種抗體，其中CDRs全部或?qū)嵸|(zhì)上來源于非人抗體，且非人抗體的可變區(qū)框架則由于取代而變得更人源化。本發(fā)明包括ABC2或ABC101抗體的飾面形式。
E-人的抗體
人類抗CD122的抗體用下面的多種技術(shù)來描述。有些人抗體通過競爭結(jié)合實驗來篩選，通過Winter的(如上)噬菌體展示法篩選，或以其他方式，以獲得與特定小鼠抗體(如實施例中小鼠單克隆抗體之一)具有相同抗原表位特異性。具有特定抗原表位特異性的人抗體也可以通過只用⑶122的一個片段作為目標(biāo)抗原來篩選，和/或用⑶122的缺失突變體集合作為抗原來篩選。
人抗體的制造方法包括的三源雜交瘤方法，Oestberg等，Hybridoma 2 361-367 (1983) ;Oestberg，美國專利 No. 4，634，664 ;和 Engleman 等，美國專利 4，634，666，轉(zhuǎn)基因小鼠的使用，其中包括人免疫球蛋白基因(見，如Lonberg等，W093/12227(1993) ；US5，877，397，US 5，874，299，US 5，814，318，US 5，789，650，US 5，770，429，US 5，661，016，US5，633，425，US 5，625，126，US 5，569，825，US 5，545，806，Nature 148，1547-1553 (1994)，Nature Biotechnology 14,826(1996), Kucherlapati, WO 91/10741 (1991))和卩遼菌體展示方法(見，如 Dower 等，WO 91/17271 和 McCafferty 等，WO 92/01047, US 5，877，218，US5，871，907，US 5，858，657，US 5，837，242，US 5，733，743 和 US 5,565,332)。
F.恒定區(qū)選擇
嵌合抗體、人源化抗體(包括面飾抗體)，或人抗體的重和輕鏈可變區(qū)可以被連接到人恒定區(qū)的至少一部分。在某種程度上，恒定區(qū)的選擇取決于抗體依賴性補體和/或細胞介導(dǎo)的細胞毒性是否是所期望的。例如，人類的同種型IgGl和IgG3具有補體介導(dǎo)的細胞毒性但人類同種型IgG2和IgG4不具有。輕鏈恒定區(qū)可以是λ或κ?？贵w可以表達為含有兩條輕鏈和兩條重鏈的四聚體、表達為單獨的重鏈和輕鏈、表達為Fab，F(xiàn)abi , F(ab/ )2,和Fv，或單鏈抗體，其中重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域通過間隔區(qū)鏈接。
人恒定區(qū)在不同個體間顯示同種異型(alIotypic)的變化和同族同種異型的(isoallotypic)變化，即恒定區(qū)在不同個體的一個或多個多態(tài)性位點可以不同。同種異型和同族同種異型的(isoallotypic)區(qū)別在于血清識別一個結(jié)合于一個或多個其他同種型(isotype)的非多態(tài)性區(qū)域的同族同種異型(isoallotype)。關(guān)于人的恒定區(qū),包括具有天然的的同種異型的恒定區(qū)，或具有在多態(tài)性位點被置換殘基占據(jù)了的天然同種異型的恒定區(qū)。
在輕鏈和/或重鏈的氨基端或羧基端的一個或多個氨基酸，例如重鏈C-末端的賴氨酸，可能會丟失或在某一部分或全部分子上衍生化?？稍诤愣▍^(qū)制備替換，以減少或增加效應(yīng)子功能，如補體介導(dǎo)的細胞毒性或ADCC(參見，例如Winter等，US PatentNo. 5, 624, 821 ；Tso 等，US Patent No. 5, 834, 597 ；and Lazar 等·，Proc. Natl. Acad. Sci.USA 103 :4005, 2006)，或在人體內(nèi)延半衰期(參見，例如 Hinton 等，J. Biol. Chem. 279 6213，2004)。示例性的的替換包括在250位的谷氨酰胺和/或428位的亮氨酸(EU編號)，可以增加抗體的半衰期。234、235、236和/或237任意位點的替換可以降低對？0^受體的親和力，有其是Fe YRI受體(參見，例如US 6，624，821)。任選地，在人IgG2的234、236和/或237位被丙氨酸取代，235位被谷氨酰胺取代。(參見，例如US5，624，821)。
H.重鉬杭體的表汰
嵌合的，人源化的(飾面的)和人的抗體通常由重組表達產(chǎn)生。重組多核苷酸構(gòu)建體通常包括一個連接到抗體鏈編碼序列的表達控制序列，其包含天然聯(lián)合的或異源的啟動子區(qū)。優(yōu)選地，所述表達控制序列是在載體內(nèi)的能夠轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染進真核宿主細胞的真核啟動子系統(tǒng)。一旦該載體已被納入適當(dāng)?shù)乃拗?，宿主被置于合適的環(huán)境，以高水平地表達所述的核苷酸序列，及收集和純化交叉反應(yīng)抗體。
哺乳動物細胞是一種優(yōu)選的表達核苷酸片段(編碼免疫球蛋白或其片段)的宿主。見ffinnacker, From Genes to Clones, (VCH Publishers, NY, 1987)。一些能分泌完整的異源蛋白質(zhì)的合適宿主細胞系已在本領(lǐng)域中被開發(fā)，包括CHO細胞系、各種COS細胞系、Hela細胞、HEK293細胞、L細胞，和包括Sp2/0和NSO的非抗體產(chǎn)生骨髓瘤。優(yōu)選地，所述細胞是非人的。這些細胞的表達載體可以包括表達控制序列，如復(fù)制起點、啟動子、增強子(Queen等，Immunol. Rev. 89 :49 (1986))，和必要的加工信息位點，如核糖體結(jié)合位點、RNA剪接位點、聚腺苷酸化位點和轉(zhuǎn)錄終止序列。優(yōu)選的表達控制序列是來自內(nèi)源性基因、巨細胞病毒、SV40、腺病毒、牛乳頭狀瘤病毒等的啟動子。見Co等，J. Immunol. 148 :1149(1992)。
一旦表達，抗體可根據(jù)本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)程序被純化，包括HPLC純化、柱色譜法、凝膠電泳等(一般見《蛋白純化》(Springer-Verlag, NY, 1982)中的范圍(Scope)部分)
IV.治療的應(yīng)用
所述抗體可用于抑制各種不希望的免疫反應(yīng)，包括那些其中已使用的可抑制IL-2或IL-15各自相互作用的抗體。
由本發(fā)明的抗體治療的免疫系統(tǒng)疾病中的一類是移植排斥反應(yīng)。當(dāng)同種異體的細胞或器官(如皮膚、腎臟、肝臟、心臟、肺，胰腺、骨髓)移植到宿主(即，供體和受體是同一物種中的不同個體)，宿主的免疫系統(tǒng)很可能產(chǎn)生對移植物中外來抗原的免疫應(yīng)答(宿主抗移植物疾病)，導(dǎo)致移植的破壞。本發(fā)明的單克隆抗體對于阻止受體內(nèi)的異體抗原引發(fā)的免疫反應(yīng)是特別有用的。
本發(fā)明的單克隆抗體的一個相關(guān)應(yīng)用是參與“移植物抗宿主”疾病(GVHD)的免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)。當(dāng)免疫性感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)移到異體受體中時移植物抗宿主病(GVHD)是一種潛在致命的疾病。在這種情況下，供體的免疫活性細胞可能攻擊受體的組織。皮膚、腸道上皮細胞和肝組織是頻繁的被攻擊目標(biāo)，在GVHD過程中可能會被破壞。當(dāng)免疫組織被移植時，該病呈現(xiàn)出特別嚴重的問題，如骨髓移植，但在其他情況下，不太嚴重的GVHD也被報道，包括心臟和肝臟移植。
需要免疫抑制的進一步的情形是在治療I型糖尿病、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、多發(fā)性硬化癥、僵人綜合征、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、重癥肌無力、紅斑狼瘡等自身免疫性疾病。在這些疾病中，機體發(fā)展出細胞或體液免疫應(yīng)答，來應(yīng)對自身抗原之一(導(dǎo)致該抗原的摧毀)，和潛在的嚴重的和/或致命后果。自身免疫性疾病可通過施用本發(fā)明的單克隆抗體之一來治療。
其他的可用本發(fā)明的單克隆抗體來治療的免疫系統(tǒng)疾病包括哮喘、過敏癥、腹腔疾病、牛皮癬、和葡萄膜炎。麩質(zhì)過敏癥、牛皮癬、葡萄膜炎是自身免疫性疾病。
其他的可用本發(fā)明的單克隆抗體來治療的失常包括癌癥，尤其是血液系統(tǒng)惡性腫瘤，如白血病(例如，T細胞大顆粒淋巴細胞白血病)或淋巴瘤。一些這樣的癌癥可檢測到的CD 122水平，該CD122的檢測在蛋白質(zhì)(例如，使用示例抗體進行免疫測定)或mRNA水平。相對于非癌組織，優(yōu)選來自同一病人，一些這樣的癌癥顯示出提高的CD122水平。任選地，癌癥中⑶122的水平在給予處理之前測量。
單克隆抗體的有效施用方案意味著劑量、給藥途徑和給藥頻率可以延遲發(fā)病、減少嚴重性、抑制進一步惡化，和/或改善疾病的至少的一個跡象或癥狀。如果患者已經(jīng)患有的疾病，所述方案可以稱作治療性有效方案。如果病人相對于一般人群顯示出更高的疾病風(fēng)險，但尚未出現(xiàn)癥狀，所述方案可以被稱為預(yù)防性有效方案。在某些情況下，治療或預(yù)防效果可以通過與同一患者內(nèi)的歷史對照或過去經(jīng)驗比較，而觀察患者得出。在其他情況下，治療或預(yù)防疾病的功效可以通過與為未受治療的病人對照群體比較，對接受了治療的病人群體進行前臨床和臨床試驗來證明。
示例性的單克隆抗體的劑量為O. 1-20，或O. 5-5mg/kg體重(例如，O. 5、1、2、3、4或5mg/kg)，或10-1500mg作為固定劑量。該劑量依賴于病人的狀況和前期治療反應(yīng)，若有的話，該處理是預(yù)防性的還是治療性的，該紊亂是急性的還是慢性的，以及其他因素。
給藥可以是腸胃外、靜脈內(nèi)的、口服的、皮下的、動脈內(nèi)的、顱內(nèi)的、鞘內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、局部的、鼻內(nèi)的或肌內(nèi)的。施用進入體循環(huán)采用靜脈內(nèi)的或皮下給藥的是優(yōu)選的。靜脈內(nèi)給藥可以是，例如，通過一段30-90分鐘的輸注。
給藥的頻率取決于在循環(huán)中的抗體的半衰期、患者的病情和給藥途徑，以及其他因素。所述的頻率可以是每天、每周、每月、每季度或不定期，這要針對病人的所治療的疾病的病情變化或進展。一個示例性的靜脈給藥頻率是在一個連續(xù)的治療過程中每周和季度之間，雖然也可以以更高或更低的頻率。對于皮下給藥，一個示例性的給藥頻率是在每周和每月之間，雖然也可以以更高或更低的頻率。
給藥劑量的數(shù)目取決于該紊亂是急性還是慢性，和治療后該紊亂的響應(yīng)。對于急性紊亂或慢性紊亂的急性發(fā)作，I至10之間劑量通常就足夠了。有時一個快速注射，可選擇地，以分開的形式，足夠應(yīng)對急性紊亂或慢性紊亂的急性發(fā)作。急性紊亂或急性發(fā)作的治療可 以重復(fù)或循環(huán)。對于慢性紊亂，可以在固定的時間間隔給藥，如在病人至少I年、5年或10年或?qū)Σ∪艘簧鷥?nèi)每周、每兩周、每月、每季度、每半年給藥。
用于腸胃外給藥的藥物組合物優(yōu)選是無菌的，實質(zhì)上等滲并且在GMP條件下制造。藥物組合物可以以單位劑量形式(即，單次給藥的劑量)提供。藥物組合物可使用一種或多種生理上可接受的載體、稀釋劑、賦形劑或助劑配制。該配制取決于所選擇的給藥途徑。對于注射劑，抗體可在水溶液中配制，優(yōu)選在生理性相容緩沖液中如Hank氏溶液、林格氏溶液、或生理鹽水或醋酸鹽緩沖液(以減少在注射部位的不適)。該溶液可以含有配制劑，如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑?；蛘呖贵w在使用前可以是凍干形式，以與合適的載體(如無菌無熱原水)共同構(gòu)成。
使用本發(fā)明的抗體進行治療，可以與其他應(yīng)對所治療的紊亂的有效療法一起使用。傳統(tǒng)的治療免疫紊亂的方法包括肥大細胞脫顆粒抑制劑、皮質(zhì)類固醇、非類固醇消炎藥和較強的抗炎藥物，如硫唑嘌呤、環(huán)磷酰胺、瘤可寧，F(xiàn)K506和環(huán)孢菌素。生物類抗炎劑，如Tysabri (那他珠單抗)或Humira (阿達木單抗)，也可以被使用。當(dāng)用于治療癌癥時，本發(fā)明的抗體可以結(jié)合化療、輻射、干細胞治療、外科手術(shù)，或用其他生物制劑治療，如對抗HER2抗原的赫賽汀 (曲妥珠單抗)、對VEGF的抗阿瓦斯丁 (貝伐單抗)，或EGF受體的抗體，如(愛必妥 ,西妥昔單抗)，和Vectibix (帕尼單抗)?；焺┌ū蕉∷岬?、環(huán)磷酰胺、苯丙氨酸氮芥、卡鉬、柔紅霉素、阿霉素、依達比星，和米托蒽醌、甲氨蝶呤、氟達拉濱、阿糖胞苷、足葉乙甙或托泊替康、長春新堿和長春花堿。
V.其他應(yīng)用
所述的抗CD122抗體可以用于檢測臨床診斷或治療中的CD122或用于研究。例如，該抗體可用于檢測T-細胞上呈現(xiàn)的⑶122，可作為患者是否遭受可服從治療的免疫介導(dǎo)的紊亂進行指示。腫瘤上表達的CD122也可以指示該腫瘤是適合本發(fā)明的抗體治療的。所述抗體也可以作為用于實驗室研究的試劑出售，該研究是檢測T細胞和它們對各種刺激的反應(yīng)。在上述用途中，單克隆抗體可以被熒光分子、自旋標(biāo)記分子、酶或放射性同位素標(biāo)記，亦可以試劑盒(含有必要的檢測CD122的試劑)的形式提供。該抗體也可以被用來純化CD122，例如，通過親和層析法。所有以上和以下引用的專利申請、網(wǎng)站、其出版物、注冊號等以全文引用的方式并入，其引用程度就如同將每一項特定且個別地以全文引用的方式并入。如果不同版本的序列在不同時期結(jié)合了不同注冊號，則所述版本及其注冊號以本申請的有效申請日為準(zhǔn)。如果適用，關(guān)于所述的注冊號，有效申請日意味著比實際申請日更早或優(yōu)先申請的申請日。同樣，如果不同版本的公開文本、網(wǎng)站等公開于不同時間，則以最接近本申請有效申請時間的版本為準(zhǔn)，除非另有說明。本發(fā)明的任何功能，步驟，元件，實施例可以結(jié)合任何其他使用，除非另有說明。雖然本發(fā)明已經(jīng)通過圖示和實施例描述了本發(fā)明的一些細節(jié)，以便于清楚和理解，很明顯某些實施某些變化和修改也是在權(quán)利要求保護范圍之內(nèi)的。
實施例
下面的例子討論人抗CD122的單克隆抗體的生產(chǎn)、表征和人源化，并提供示例方法，通過方法，本發(fā)明描述的抗體對CD122的結(jié)合特性可以被確定。
實施例I· 鼠抗人CD122單克隆抗體的分離
使用兩種形式的免疫原來引起的小鼠的抗CD122響應(yīng)分離的融合了人IgGlFc區(qū)(CD122-Fc)的人CD122胞外結(jié)構(gòu)域的和鼠骨髓瘤細胞(NSO)轉(zhuǎn)染子，該轉(zhuǎn)染子能在細胞表面穩(wěn)定表達全長人CD122和人CD132(完整的天然人IL-2/15中間親和力受體)(NSO-β Y)。能編碼⑶122-Fc的基因的產(chǎn)生通過以下方法制備將編碼5’序列的人CD122的細胞外區(qū)域(包括它的信號肽)融合到人IgGl Fe編碼序列。所述的CD122_Fc基因在人CMV早期啟動子控制下被克隆進一個表達載體。該表達載體還含有一個gpt標(biāo)記用于篩選，所述的CD122-FC表達載體然后通過電穿孔導(dǎo)入到小鼠骨髓瘤細胞系NSO (歐洲動物細胞培養(yǎng)協(xié)會，索爾斯伯利，威爾特郡，英國)，且使用gpt標(biāo)記來篩選轉(zhuǎn)染子。消耗培養(yǎng)基采用ELISA篩選分析分泌的⑶122-Fc，高產(chǎn)細胞系用無血清培養(yǎng)基HybridomaSFM(Invitrogen, Carlsbad, CA)進行擴大培養(yǎng)。將消耗的無血清培養(yǎng)基中的CD122_Fc用Protein A Sepharose⑩親和層析進行純化。對于NSO-β Y穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子,其同樣通過將含全長人CD122和CD132的編碼序列的表達載體轉(zhuǎn)染進NSO細胞來創(chuàng)建。同時在細胞表面上表達基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)染子通過使用市售的抗人CD122和CD132的抗體通過流式細胞術(shù)來識別。
鼠雜交瘤的生產(chǎn)使用標(biāo)準(zhǔn)程序進行。首先篩選雜交瘤培養(yǎng)上清液，用ELISA篩選對人CD 122的反應(yīng)性。用CD122-Fc或不相干-Fe融合蛋白包被微量滴定板。將小鼠雜交瘤的消耗培養(yǎng)基加入到微量滴定板的各孔中。孵育后，用PBS洗滌板，再與過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠κ多克隆抗體孵育，再次洗滌，并與過氧化物酶底物ABTS反應(yīng)。顯示對CD122-Fc反應(yīng)性，卻不顯示對不相干-Fe融合蛋白反應(yīng)性的上清液被認定為對CD122具有特異性，然后擴大培養(yǎng)該雜交瘤。對在細胞表面表達的天然人CD122的反應(yīng)性可以由如下證明建立，即通過流式細胞術(shù)證明這些上清液對NSO- β Y和由PHA及IL-2激活的人T細胞的反應(yīng)性，但不對非轉(zhuǎn)染的NSO具有反應(yīng)性。
能分泌與天然人CD122特異性結(jié)合的抗體的鼠雜交瘤，被分別亞克隆、同型化(isotyped),且在無血清培養(yǎng)基(使用Hybridoma-SFM)以純化單克隆抗體。鼠IgG2a和IgG2b抗體用Protein A Sepharose _親和層析純化，鼠IgGl用G蛋白純化。純化的鼠抗人CD122單克隆抗體最初的表征是通過流式細胞術(shù)確定與人CD122的結(jié)合，其中CD122表達于普通(人T細胞)和轉(zhuǎn)染的(NSO-β Y)細胞。根據(jù)最初與⑶122結(jié)合和功能表現(xiàn)，兩種抗 CD 122 抗體，ABC2 (IgGl/ κ )的 ABClOl (IgG2b/ κ )被篩選出。ABC2 和 ABClOl 均特異性地結(jié)合到人和獼猴⑶122，但缺乏顯著的狗和鼠⑶122結(jié)合(與不相關(guān)對照抗體在檢測上無區(qū)別)。
實施例2
IL-15介導(dǎo)的增殖的抑制
人類紅白血病細胞株TF-I (ATCC，馬納薩斯，弗吉尼亞州)的增長是完全依賴于外源提供的細胞因子，如 GM-CSF 或 IL-3 (Kitamura, T.等，Blood 73 =375-380 (1989))。TF-I 表達共有 Y 鏈(CD132)和 IL-15 的受體 α 鏈(Mortier 等，J. Biol. Chem. ,281 1612-1619 (2006))，但不表達 IL-2/IL-15 受體 β 鏈(CD122)，因此 IL-15 不能支持 TF-I的增長。TF-I內(nèi)⑶122基因的表達允許中度和高度親和力的IL-15受體的表達，且允許人IL-15支持所述轉(zhuǎn)染子的增殖。TF-Ιβ產(chǎn)生自穩(wěn)定的TF-I轉(zhuǎn)染子，該轉(zhuǎn)染子具有攜帶編 碼人類⑶122的哺乳動物表達載體和一個嘌呤霉素抗性基因。TF-I β在人IL-15的存在下，及提供一個可溶的復(fù)合物的條件下增殖，該復(fù)合物為人IL-15結(jié)合到人IL-15R的胞外域的一部分上(scIL-15/IL_15Ra)，這取代了細胞結(jié)合的IL-15/IL-15Ra復(fù)合物并代表7 IL-15 的反式呈遞(Mortier 等，J. Biol. Chem.，281 :1612-1619(2006))。所述的 IL-15/IL-15Ra片段復(fù)合物(scIL-15/IL-15Ra)是通過將人IL-15R a sushi結(jié)構(gòu)域通過肽連接到人IL-15，并且在羧基末端加入了 6個組氨酸殘基，這基本上都由Mortier報道(J. Biol.Chem. ,281 :1612-1619 (2006))，且他還提供了一個IL-15反式呈遞的模型。
抗CD122單克隆抗體抑制由反式呈遞介導(dǎo)的細胞增殖的能力，是用TF-I β細胞和scIL-15/IL-15Ra檢測。在典型的實驗中，6x IO4TF-I β細胞與不同量的純化的鼠抗⑶122單克隆抗體在37°C下孵育10分鐘。然后加入10ng/ml scIL-15/IL-15R,然后將細胞在37°C下額外孵育72小時，然后加入四唑鹽WST-8 (Dojindo分子技術(shù)，羅克韋爾市，美國馬里蘭州)。用WST-8在37°C下孵育3小時后，細胞增殖通過測定450nm處的吸光度而被推斷，該測定可指示脫氫酶活性并與活細胞數(shù)目成正比。在被測抗體存在下的細胞增殖水平和不添加抗體的細胞增殖水平進行比較，以測定抑制活性。如圖I所示，ABC2和ABClOl實質(zhì)上抑制了由IL-15反式呈遞(體現(xiàn)為scIL-15/IL-15Ra)介導(dǎo)的TF-Ιβ細胞的生長，在ABC2濃度為1.0yg/m I及ABClOl濃度為O. 5 μ g/ml時，可顯示約50%的抑制。
也使用TF-I β檢測抗CD122單克隆抗體抑制由順式呈遞IL-15介導(dǎo)的細胞增殖的能力。在典型的實驗中，6x IO4 TF-I β細胞與不同量的純化的鼠抗⑶122單克隆抗體在37°C下孵育10分鐘。然后加入10ng/ml IL-15，然后將細胞在37°C下額外孵育72小時。細胞增殖水平的測定使用上述的四唑鹽WST-8，且與無抗體對照相比較。當(dāng)濃度為370ng/ml時，ABC2和ABClOl實質(zhì)上分別抑制約75%和40%的TF-I β細胞的生長。
實施例3
通過中度或高親和力IL-2受體由IL-2介導(dǎo)的細胞增殖的抑制
ABC2和ABClOl被用來分析抑制細胞增殖的能力，該增殖由IL-2通過中度親和力IL-2受體介導(dǎo)的，該分析使用TF-I β細胞。在典型的實驗中，6x IO4TF-I β細胞與不同量的純化的鼠抗CD122抗體在37°C下孵育10分鐘。然后加入200ng/ml IL-2，然后將細胞在37°C下孵育72小時。細胞增殖水平的測定使用上述的四唑鹽WST-8，且與無抗體對照相比較。當(dāng)濃度為80ng/ml時，ABC2和ABClOl實質(zhì)上平均抑制超過50%的由IL-2介導(dǎo)的TF-I β 細胞生長。 ABC2和ABClOl被用來分析抑制細胞增殖的能力，該增殖由IL-2通過高親和力IL-2受體介導(dǎo)。TF-Ia β由轉(zhuǎn)染了哺乳動物表達載體(編碼人⑶25和⑶122)的TF-I產(chǎn)生，因此表達IL-2的高親和力受體。在典型的實驗中，6x IO4TF-I α β細胞與不同量的純化的鼠抗 CD122抗體在37°C下孵育10分鐘。然后加入10ng/ml IL-2，然后將細胞在37°C下孵育額外的72小時。細胞增殖水平的測定使用上述的四唑鹽WST-8，且與無抗體對照相比較。如圖2所示，在IL-2存在下，ABC2和ABClOl實質(zhì)上抑制了 TF-I α β細胞的增長。在10 μ g/ ml濃度下，ABC2和ABClOl分別可抑制TF-I α β 49%和46%的增殖。 實施例4 重鏈和輕鏈可變區(qū)的序列用TRIzol試劑(Invitrogen)從約IO7雜交瘤細胞中提取總RNA，5’ -RACE中的 oligo dT-primed cDNA使用GeneRacer試劑盒(Invitrogen公司，卡爾斯巴德，加利福尼亞州)或SMARTer RACE cDNA Amplification試劑盒(Clontech,山景城，加利福尼亞州)，按照供應(yīng)商的說明書操作。重鏈和輕鏈可變區(qū)的cDNAs的擴增用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進行，使用使鼠Y-I和K鏈恒定區(qū)分別退火的3'引物和GeneRacer試劑盒或SMARTer RACE cDNA Amplification試劑盒提供的5 ' RACE引物。重鏈可變區(qū)(VH)的 PCR，3 '引物具有序列5 ' -GCCAGTGGATAGACAGATGG-3 '(對于 Y -I) (SEQ ID NO: 17)，5 ' -GCCAGTGGATAGACCGATGG-3 '(對于 Y _2a) (SEQ ID NO: 18)或 5' -GCCAGTGGATAGACTGATGG-3'(對于 Y _2b) (SEQ ID NO: 19)。對于輕鏈可變區(qū)(VL)， 3'引物具有序列5' -GATGGATACAGTTGGTGCAGC-3' (SEQ ID NO :20)。擴增出的 VH 和 VL cDNAs被亞克隆進pCR4Blunt-T0P0載體(Invitrogen)以進行序列測定。一些重鏈和輕鏈克隆被測序，與典型鼠重鏈和輕鏈可變區(qū)同源的單拷貝序列被認定。ABC2VH的一致cDNA序列和推測的氨基酸序列在圖3中顯示。信號肽序列 (MKLffLNWVFLLTLLHGIQC) (SEQ ID NO 21)為斜體。成熟多肽(E)的N-末端氨基酸序列用雙下劃線標(biāo)注。根據(jù) Kabat 等· (Sequences of Proteins of Immunological Interests,第五版，NIH出版No. 91-3242，美國衛(wèi)生和公共服務(wù)部，1991)定義的⑶R序列用下劃線標(biāo)注。 ABC VH的CDR1、CDR2和CDR3序列分別為DFYME(SEQ ID NO 22), ASRNKANDYTTEYSASVKG (SEQ ID NO 23)和 SYYRYDGMDY (SEQ ID NO :24)。成熟 ABC2VH 氨基酸序列是 EVKLVESGGGLVQPGG SLRLSCATSGFTFSDFYMEWVRQPPGKRLEWIAASRNKANDYTTEYSASVKGRFIVSRDTSQSILYLQMNALRAEDT AIYYCARSYYRYDGMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO :25)。ABC2VL 一致的cDNA序列或推測的氨基酸序列在圖4中顯示。信號肽序列 (MDFQVQIFSFLLISASVIVSRG) (SEQ ID NO 26)為斜體。成熟多肽(Q)的N-末端氨基酸序列用雙下劃線標(biāo)注。根據(jù)Kabat等.(同上)定義的⑶R序列用下劃線標(biāo)注。ABC2VL的 CDRl、CDR2 和 CDR3 序列分別為 SAISSVSYMY (SEQ ID NO :27)、DTSNLVS (SEQ ID NO 28)和 QQffNTYPYT (SEQ ID NO :29)。成熟 ABC2VL 氨基酸序列是 QVVLTQSPVMSASPGEKVTMTCSAISSV SYMYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNLVSGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQWNTYPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO 30)。ABClOl VH—致的cDNA序列或推測的氨基酸序列在圖5中顯示。信號肽序列(MRVLILVYLLTVLPGILS) (SEQ ID NO 31)為斜體。成熟多肽(D)的N-末端氨基酸序列用雙下劃線標(biāo)注。根據(jù)Kabat等.(同上)定義的⑶R序列用下劃線標(biāo)注。ABClOl VH的⑶R1、 CDR2 和 CDR3 序列分別為 NDNHWffN(SEQ ID NO 32)，YIDSSGSSDNNPSLKS (SEQ ID NO 33)和 GGGRDYYGMDY (SEQ ID NO :34)。成熟 ABClOl VH 氨基酸序列是 DVQLQESGPGLVKPSQTVSLTCTV TGYSITNDNHWWNWIRQVSGSKLEWMGYIDSSGSSDNNPSLKSQISITRDTSKNQLFLQLNSVTIEDIGTYYCARGG GRDYYGMDYffGQGTSVTVSS(SEQ ID NO :35)。ABClOl VL—致的cDNA序列或推測的氨基酸序列在圖6中顯示。信號肽序列 (METDTLLLffVLLLffVPGSTG) (SEQ ID NO 36)為斜體。成熟多肽(D)的N-末端氨基酸序列用雙下劃線標(biāo)注。根據(jù)Kabat等.(同上)定義的⑶R序列用下劃線標(biāo)注。ABClOl VL的⑶R1、 CDR2 和 CDR3 序列分別為 RASQSVSTSSYSYVH(SEQ ID NO 37)，YASNLES(SEQ ID NO 38)和 QHSffDIPFT (SEQ ID NO :39)。成熟 ABClOl VL 氨基酸序列是 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRAS QSVSTSSYSYVHWYQQKPGQPPKLLIKYASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDTATYYCQHSffDIPFTFG GGTKLEIK(SEQ ID NO 40)。實施例5ABC2VH和VL的人源化人源化VH和VL基因的設(shè)計和構(gòu)建根據(jù)已有方法進行(Tsurushita，N.，等.，Methods 36:69-83(2005))。與小鼠ABC2 VH同源的人VH序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中搜索，且由人 DA430129cDNA(DA430129 VH)(GenBank 注冊號；Kimura，K.，等·，Genome Res. 16 55-65(2006))編碼的VH序列被選擇作為人源化受體。圖7顯示了成熟ABC2 VH、人源化 ABC2 VH(HuABC2 VH)和人受體DA430129 VH區(qū)氨基酸序列的比對。序列上面的數(shù)字指示了根據(jù)Kabat等人(同上)規(guī)定的位置。由Kabat等人(同上)定義的⑶R序列在ABC2 VH氨基酸序列中用下劃線標(biāo)注。為設(shè)計HuABC2 VH氨基酸序列，小鼠ABC2 VH的⑶R序列首先被轉(zhuǎn)接到DA430129VH的相應(yīng)位置。下一步，在框架區(qū)位置(該位置是小鼠ABC2可變區(qū)的三維模型，其被建議與CDRs的聯(lián)系具有重要意義)，小鼠ABC2VH氨基酸殘基替換相應(yīng)的人殘基。這些取代，在HuABC2氨基酸序列用下劃線表示，發(fā)生在位置28、48、49、68和 93(圖.7)。另外，被發(fā)現(xiàn)在相應(yīng)V區(qū)亞群中非典型的DA430129 VH人框架在氨基酸殘基被典型的殘基取代，減少潛在的免疫原性。這種類型的取代，在HuABC2 VH氨基酸序列用雙下劃線標(biāo)注，發(fā)生在位置42 (圖7)。編碼HuABC2 VH的基因被設(shè)計為外顯子，該外顯子包括一個信號肽、一個剪接供體信號、和適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶位點以為后續(xù)克隆到哺乳動物表達載體中。HuABC2 VH基因的信號肽序列來自小鼠ABC2 VH基因。HuABC2 VH外顯子的剪接供體信號來自人類生殖系JHl段。側(cè)翼為Spe I和HindIII位點的所設(shè)計HuABC2 VH基因核苷酸序列及推測的氨基酸如圖8所示。信號肽序列用斜體標(biāo)注。成熟多肽的N-末端的氨基酸殘基用雙下劃線標(biāo)注。根據(jù)Kabat等人(同上)的定義的CDR序列以下劃線標(biāo)出。 成熟 HuABC2 VH 的氨基酸序列是 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDFYMEWVRQAPGKGLEWIA ASRNKANDYTTEYSASVKGRFIVSRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARSYYRYDGMDYWGQGTTVTVSS. (SEQ ID NO 41)。與小鼠ABC2 VL同源的人Vk序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中搜索，且由人 M29469cDNA (M29469VL) (GenBank 注冊號；Spatz 等，J. Immunol. 144 =2821-2828 (1990))編碼的Vk序列被選擇作為人源化受體。圖9顯示了成熟ABC2VL、人源化ABC2 VL(HuABC2 VH)和人受體M29469 VL區(qū)氨基酸序列的比對。序列上面的數(shù)字指示了根據(jù)Kabat等人(同上)規(guī)定的位置。由Kabat等人(同上)定義的⑶R序列在ABC2 VL氨基酸序列中用下劃線標(biāo)注。為設(shè)計HuABC2 VL氨基酸序列，小鼠ABC2 VL的CDR序列首先被轉(zhuǎn)接到M29469 VL 的相應(yīng)位置。下一步，在框架區(qū)位置(該位置是小鼠ABC2可變區(qū)的三維模型，其被建議與 CDRs的聯(lián)系具有重要意義)，小鼠ABC2 VL氨基酸殘基71位，在HuABC2 VL中用下劃線標(biāo)注，替換相應(yīng)的人殘基(圖9)。編碼HuABC2 VL的基因被設(shè)計為外顯子，該外顯子包括所述的小鼠ABC2 VL基因的信號肽和來自小鼠生殖系Jkl段的剪接供體信號。偵彳翼為NheI和 EcoRI位點的所設(shè)計HuABC2 VL基因核苷酸序列及推測的氨基酸如圖10所示。信號肽序列用斜體標(biāo)注。成熟多肽的N-末端的氨基酸殘基用雙下劃線標(biāo)注。根據(jù)Kabat等人(1991) 的定義的CDR序列以下劃線標(biāo)出。成熟HuABC2VL的氨基酸序列是EIVLTQSPATLSLSPGERAT LSCSAISSVSYMYWYQQKPGQAPRLLIYDTSNLVSGVPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQffNTYPYTF GGGTKVEIK(SEQ ID NO 42)。實施例6ABClOIVH和VL的人源化與小鼠ABC101VH同源的人VH序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中搜索，且由人 DA936142cDNA(DA936142VH) (GenBank 注冊號；Kimura 等，Genome Res. 16 :55-65 (2006)) 編碼的VH序列被選擇作為人源化受體。圖11顯示了成熟ABClOl VH、人源化A BClOl VH (HuABClOl VH)和人受體DA936142 VH區(qū)氨基酸序列的比對。序列上面的數(shù)字指示了根據(jù) Kabat等人(同上)規(guī)定的位置。由Kabat等人(同上)定義的⑶R序列在ABClOl VH氨基酸序列中用下劃線標(biāo)注。為設(shè)計HuABClOl VH氨基酸序列，小鼠ABClOl VH的CDR序列首先被轉(zhuǎn)接到DA936142 VH的相應(yīng)位置。下一步，小鼠27、30、48、66、67和71位氨基酸，該位置是小鼠ABClOl可變區(qū)的三維模型，其被建議與CDRs的聯(lián)系具有重要意義，替換相應(yīng)的人框架殘基。這些位置的氨基酸殘基在HuABClOlVH序列(圖11)用下劃線標(biāo)注。編碼 HuABClOl VH的基因被設(shè)計為外顯子，該外顯子包括所述的小鼠ABClOl VH基因的信號肽和來自人生殖系JH6段的剪接供體信號。側(cè)翼為SpeI和HindIII位點的所設(shè)計HuABClOl VH 基因核苷酸序列及推測的氨基酸如圖12所示。信號肽序列用斜體標(biāo)注。成熟多肽的N-末端的氨基酸殘基用雙下劃線標(biāo)注。根據(jù)Kabat等人(1991)的定義的CDR序列以下劃線標(biāo)出。成熟 HuABClOl VH 的氨基酸序列是 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYSITNDNHWffNWIRQHP GKGLEWMGYIDSSGSSDNNPSLKSQITISRDTSKNQLSLKLSSVTAADTAVYYCARGGGRDYYGMDYffGQGTTVTVS S (SEQ ID NO 43)。為人源化小鼠 ABC101 VL,由人 Z46622cDNA(Z46622VL) (GenBank 注冊號；Giachino 等，J. Exp. Med. 181 =1245-1250(1995))編碼的Vk序列被選擇作為受體。圖13顯示了成熟 ABC101 VL、人源化ABC101 VL (HuABClOl VL)和人受體Z46622VL區(qū)氨基酸序列的比對。序列上面的數(shù)字指示了根據(jù)Kabat等人(同上)規(guī)定的位置。由Kabat等人(同上)定義的 ⑶R序列在ABC101VL氨基酸序列中用下劃線標(biāo)注。為設(shè)計HuABClOl VL氨基酸序列，小鼠 ABC101 VL的⑶R序列首先被轉(zhuǎn)接到Z46622 VL的相應(yīng)位置。下一步，下一步，小鼠49位氨基酸，該位置是小鼠ABC101可變區(qū)的三維模型，其被建議與CDRs的聯(lián)系具有重要意義， 替換相應(yīng)的人框架殘基。這些位置的氨基酸殘基在HuABClOl VL序列(圖13)用下劃線標(biāo)注。編碼HuABClOl VL的基因被設(shè)計為外顯子，該外顯子包括所述的小鼠ABC101 VL基因的信號肽和來自小鼠生殖系Jk2段的剪接供體信號。側(cè)翼為NheI和EcoRI位點的所設(shè)計 HuABClOl VL基因核苷酸序列及推測的氨基酸如圖14所示。信號肽序列用斜體標(biāo)注。成熟多肽的N-末端的氨基酸殘基用雙下劃線標(biāo)注。根據(jù)Kabat等人(1991)的定義的CDR序列以下劃線標(biāo)出。成熟HuABClOl VL的氨基酸序列是DIVMTQSPDSLGVSLGERATINCRASQSVSTSS YSYVHWYQQKPGQPPKLLIKYASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHSWDIPFTFGQGTKLEI K(SEQ ID NO 44)。實施例7HuABC2 和 HuABClOl IgGl/κ 抗體的表達設(shè)計有SpeI和HindIII位點的HuABC2 VH基因和設(shè)計有Nhe I和EcoR I位點的HuABC2 VL基因，被插進一個哺乳動物表達載體中的相應(yīng)位點，以生成pHuABC2。設(shè)計有Spe I和 HindIII位點的HuABClOl VH和設(shè)計有Nhe I和EcoR I位點的HuABClOl VL，被插進一個哺乳動物表達載體中的相應(yīng)位點，以生成pHuABClOl。pHuABC2和pHuABClOl (全體地，表達載體)的結(jié)構(gòu)見圖15。從頂部的SalI位點沿順時針方向，所述的表達載體包含的重鏈轉(zhuǎn)錄單元，該單元開始于人巨細胞病毒(CMV)的主要立即早期啟動子和增強子(CMV啟動子) 以起始抗體體重鏈基因的轉(zhuǎn)錄。CMV之后是VH外顯子，它是一個含有人Y-I重鏈恒定區(qū)的基因組序列，該區(qū)包括CH1、鉸鏈、CH2和CH3與其間的內(nèi)含子，CH3之后還有為mRNA加工的 Y -I基因的多聚腺苷酸化位點。重鏈基因序列之后，輕鏈轉(zhuǎn)錄單元開始于CMV啟動子，隨后為VL的外顯子和一個基因組序列，該基因組序列含有人κ鏈恒定區(qū)外顯子(CL)及其前部的部分內(nèi)含子和該κ基因的poly A信號。所述的輕鏈基因后是SV40早期啟動子(SV40啟動子)，大腸桿菌黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因(谷丙轉(zhuǎn)氨酶)，和含有SV40多聚腺苷酸化位點(SV40poly(A)位點)的片段。最后，所述的表達載體含有質(zhì)粒pUC19的一部分， 其包含細菌的復(fù)制起點(pUC ori)和beta-內(nèi)酰胺酶基因(β內(nèi)酰胺酶)。為了獲得穩(wěn)定產(chǎn)生HuABC2和HuABClOl IgGl的/ κ抗體的細胞系(分別為HuABC2 和HuABClOl)，表達載體pHuABC2和pHuABClOl分別為被引入到小鼠骨髓瘤細胞系NSO的染色體中。通過電穿孔進行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NSO,電穿孔技術(shù)為Bebbington等人所描述(Bio/ Technology 10 :169-175，1992)。(生物/10 :169-175，1992)。在轉(zhuǎn)染前，表達載體使用 FSPI 將之線性化。用10 μ g線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染約IO7細胞，懸浮在含有10% FBS的DME培養(yǎng)基中， 并鍍在幾個96-孔中。24小時后，選擇培養(yǎng)基(含有10% FBS、HT培養(yǎng)基補充物(Sigma， St. Louis,MO)、0· 25mg/ml黃嘌呤和I μ g/ml霉酹酸的DME培養(yǎng)基)被施加。經(jīng)過約10天的處篩選，來自轉(zhuǎn)染子成活篩選的培養(yǎng)上清液被用于抗體生產(chǎn)的分析。通過標(biāo)準(zhǔn)步驟，用夾心ELISA測定HuABC2和HuABClOl的表達，通常使用羊抗人IgG Fe多克隆抗體來捕獲，使用HRP標(biāo)記的羊抗人κ鏈多克隆抗體來檢測結(jié)合的人源化抗體。 不同量的合適的人IgGl/κ抗體被用來構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線以用于定量。分別高產(chǎn)HuABC2和 HuABClOl的NSO穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子在無血清培養(yǎng)基(使用Hybridoma SFM(Invitrogen))中適應(yīng)并擴增。用Protein A親和層析法純化HuABC2和HuABClOl。實施例8人源化的抗CD 122抗體的特征對純化的HuABC2和HuABClOl進行抑制TF-I β增殖能力的測試，所述的增殖是通過可溶的IL-15/IL-15Ra復(fù)合體介導(dǎo)的(如上文所述的，用scIL-15/IL_15Rα作為IL-15反式呈遞的方式)(圖16)。HuABC2和HuABClOl實質(zhì)上均可抑制TF-I β的增長，然而小鼠抗 ⑶122單克隆抗體的人源化形式(HuMik-β I ；Hakimi等，同上)在測試的最高濃度(10 μ g/ ml)只顯示了輕微抑制。對于抑制IL-15反式呈遞到TF-I β細胞而介導(dǎo)的細胞增殖，50% 抑制所需要的抗體濃度為對于HuABC2是O. 7 μ g/ml，對于HuABClOl是O. 5 μ g/ml，對于 HuMik-β I 是約 10 μ g/ml。對純化的HuABC2和HuABClOl進行抑制TF-I α β增殖能力的測試，上文已描述， TF-I α β在IL-2的存在下能表達高親和力的IL-2受體(圖17)。HuABC2和HuABClOl實質(zhì)上均可抑制TF-Ia β的增長,然而HuMik-β I在測試的最高濃度(100 μ g/ml)不顯示活性，只顯示了與同型對照相同的抑制水平。對于抑制IL-2介導(dǎo)的TF-I α β細胞增殖，50% 抑制所需要的抗體濃度為對于HuABC2是14 μ g/ml，對于HuABClOl是42 μ g/ml。實施例9人源化的抗CD122抗體對對抗主體疾病的異種骨移植發(fā)育的體內(nèi)分析HuABC2療法對移植物抗宿主病發(fā)展的效果，可以通過給予免疫缺陷小鼠人 immuocompetant 細胞(van Rijn, R. S.,等·，Blood 102 :2522_2531 (2003))建立異種 (xenographic)模型而檢測。通過引入人外周血單個核細胞(PBMC),異種的移植物抗宿主疾病(XGVH D)可誘導(dǎo)于 NOD/Shi-scid，IL-2R y nul1 (NOG)小鼠(描述于 Ito，R.等， Transplantation 87 1654-1658 (2009)) 特別地，每次間隔注射的 Ix IO7 人 PBMC 的 8_10 周年齡的NOG小鼠在注射前一天接受2. 5Gy的輻照。對小鼠每天進行監(jiān)測及每周兩次稱重來跟蹤疾病的發(fā)展。發(fā)展了 XGVHD的小鼠在注射PBMC2-3天后開始體重降低，并表現(xiàn)出駝背姿勢、豎起皮毛、行動不便、呼吸急促、貧血，注射了 Ix IO7人PBMC的輻照受體在10-14天后死亡。為了顯示接受了人源化抗⑶122抗體的小鼠在XGVHD過程中的改變，NOG小鼠在注射PBMC前一天接受腹膜內(nèi)注射10mg/kg (抗體/體重)對照人IgGl抗體或HuABC2，或在注射PBMC當(dāng)天接受，或在注射PBMC后3天、7天和10天接受。在實施每種抗體前對小鼠稱重，且在死之前或按IA⑶C準(zhǔn)則犧牲之前檢測XGVHD的跡象，該跡象已在上文描述。人類細胞的轉(zhuǎn)移是一個疾病進展的跡象指示，其在注射PBMC10天后通過檢測人CD45+百分含量進行監(jiān)測，所述的CD45+百分含量是通過流式細胞術(shù)對每只小鼠的血液中的CD45+百分含量進行檢測。在注射PBMC10天后，被施用對照抗體的小鼠體重平均降低了 20±2.8%，而被施用HuABC2的小鼠體重平均僅降低了 10+2. 3%。在注射PBMC10天后，被施用對照抗體的小鼠其血液中平均有89. 2±4. 2%人⑶45+細胞，而被施用HuABC2的小鼠其血液中平均有64. 9± 11. 6%人⑶45+細胞。在注射PBMC10天后，被施用對照抗體的全部6只小鼠死亡，而被施用HuABC2的小鼠當(dāng)天僅有2只死亡。因此，通過3個獨立的參數(shù)體重下降百分數(shù)、人細胞轉(zhuǎn)移百分數(shù)和死亡數(shù)，可以發(fā)現(xiàn)，相比于施用對照抗體，被施用HuABC2的小鼠顯示了較輕的GVHD癥狀。例10在牛皮癬模型中分析人源化抗CD122抗體當(dāng)將人牛皮癬患者皮膚移植到嚴重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠時，牛皮癬的表型特征(例如，表皮增厚、廣泛的表皮突形成和炎性細胞的出現(xiàn))仍然存在(NickolofT等.， Am. J. Pathol. 146 :580_588 (1995))。這個模型已被用于研究牛皮癬病候選藥物的療效(Zegler 等，Lab Invest. 81 :1253-1261 (2001) ；Villadsen 等，J. Clin. Invest. 112 1571-1580(2003) ;Bhagavathula 等，Am. J. Pathol. 166 :1009-1016 (2005))，并且對人的療效，該模型也是有積極影響的。本實施例描述了體內(nèi)研究，其可在牛皮癬患者皮膚-SCID小鼠移植模型中證明HuABC2的功效。在一個典型的實驗中，人牛皮癬患者皮膚移植到SCID小鼠。組織愈合后，小鼠經(jīng)腹腔注射HuABC2或?qū)φ湛贵w，劑量為每3天(共21天)每只動物10mg/kg。處理期結(jié)束后， 處死動物。將移植的人牛皮癬皮膚及周圍的少量鼠皮膚切下，用10%福爾馬林緩沖液固定，組織切片用光學(xué)顯微鏡進行組織學(xué)檢查。每個組織切片的表皮面積以相等部分(equal segments)獲得,表皮厚度以盲法(blinded manner)計算。移植前的一小片固定在10%福爾馬林緩沖液中牛皮癬供體皮膚用于表皮厚度的零時間分析(zero-time assessment)。將 HuABC2組和對照組的表皮厚度對比，來評價HuABC2對牛皮癬的功效。HuABC2的影響還通過以下方式進一步評價(I)分析皮膚移植的組織學(xué)特征，來分析牛皮癬的特征，包括表皮增生和表皮突的形成，及(2)將組織切片染色，染料為對抗人CD3的抗體或其他細胞表面標(biāo)記物，以認定浸潤細胞。實施例11表位定位 ⑶122的胞外區(qū)由兩個纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域組成，稱為Dl和D2(Wang，X.等.Science 310 :1159-1163(2005))。為定位由ABC2和ABClOl識別的CD122分子的抗原表位，所有的小鼠抗人⑶122抗體分子(來源于JN Biosciences)，他們結(jié)合于多種鼠/人嵌合⑶122 分子的形式，及在HEK293細胞的表面表達的人CD122分子的分離的結(jié)構(gòu)域由流式細胞術(shù)確定。此外，小鼠抗 CD 122 單克隆抗體 Mik- β I (Tsudo 等.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 1982-1986(1989))包含進所述的分析，其作為本發(fā)明的產(chǎn)生的進一步的一個鼠抗⑶122抗體，ABCl 16，它相對于ABC2和ABClOl抑制CD 122與IL-2和IL-15相互作用的能力較低。描述于圖18中的所述的6個不同的重組⑶122構(gòu)建體被用于分析。HuDl/HuD2包含人 ⑶122 Dl (成熟蛋白的I位丙氨酸至101位苯丙氨酸，SEQ ID NO 49)和D2(成熟蛋白的第 102位谷氨酸至214位蘇氨酸，SEQ ID NO 50)結(jié)構(gòu)域。I位的丙氨酸相當(dāng)于在人⑶122編碼區(qū)N-末端計數(shù)過來第27個氨基酸。MoDl/MoD2包含鼠⑶122 Dl (成熟蛋白I位的丙氨酸至第102位的苯丙氨酸，SEQ ID N051)和D2(成熟蛋白的第103位的天冬氨酸至215 位的異亮氨酸，SEQ ID NO 52)結(jié)構(gòu)域。HuDl/MoD2包含人Dl和鼠D2結(jié)構(gòu)域(分別為SEQ ID NO 49 和 SEQ ID NO 52)。MoDl/HuD2 包含鼠 Dl 和人 D2 結(jié)構(gòu)域(分別為 SEQ ID NO 51 和SEQ ID NO 50)。HuDl包含分離的人Dl結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO :49)，及HuD2包含分離的人 D2結(jié)構(gòu)域(SEQ ID N0:50)。所有的六個構(gòu)建體的羧基末端融合接到其后為源自人CD55基因的GPI錨定信號的FLAG肽上(SEQ ID NO :53)。這些構(gòu)建體被克隆進合適的質(zhì)粒載體以在HEK293細胞表面上表達。ABC2、ABC101、ABC116和Mik-β I (5 μ g/ml)結(jié)合到表達6種CD 122構(gòu)建體的轉(zhuǎn)染子的測定通過標(biāo)準(zhǔn)程序由流式細胞術(shù)進行。細胞表面上表達這些構(gòu)建體，可用大鼠抗FLAG肽抗體L5 (BioLegend, San Diego, CA)認證。能瞬時表達上述6種⑶122構(gòu)建體中任何一種的 HEK293細胞首先與被測試抗體中的一種進行孵育。ABC2、ABC101、ABCl 16和Mik-β I與這些CD122構(gòu)建體的結(jié)合特性在圖18中總結(jié)。圖中的符號“ + ”表示，對每個轉(zhuǎn)染子，結(jié)合一個測試抗體的MCF (幾何平均通道熒光)值是結(jié)合L5的MCF值的至少50%。符號表示，結(jié)合一個測試抗體的MCF值是結(jié)合L5的MCF值的低于10% (即，指示在結(jié)合可測量精確的邊緣內(nèi)缺乏結(jié)合特異性)。單獨的人⑶122的Dl結(jié)構(gòu)域?qū)τ诮Y(jié)合ABC2和Mik-β I是足夠的。單獨的人CD122的D2結(jié)構(gòu)域?qū)τ诮Y(jié)合ABC116是足夠的。對于結(jié)合ABC101，人的 Dl結(jié)構(gòu)域和人D2結(jié)構(gòu)域或鼠D2結(jié)構(gòu)域之一是必要的，這顯示，ABClOl的抗原表位需要來自Dl和D2結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基。更具體地定位ABC2、ABClOl和Mik-β I識別的CD122分子抗原表位，在HuDl/HuD2構(gòu)建體(SEQ ID NO 54)中通過標(biāo)準(zhǔn)方法的定點誘變，來產(chǎn)生單氨基酸替換突變體。每個突變的HuDl/HuD2構(gòu)建體的羧基末端融合接到其后為源自人CD55基因的GPI錨定信號的FLAG 肽上(SEQ ID N0:53)，這些構(gòu)建體在HEK293細胞表面上被測定和表達。在分析中使用的 HuDl/HuD2突變體列于圖19中。每個突變體名字中左邊的字母、中間的數(shù)字、右側(cè)的字母分別表示野生型⑶122中的一個氨基酸、⑶122中的位置、和突變體中的一個氨基酸。符號 “ + ”和在圖中表示，當(dāng)測試抗體濃度為100ng/ml時，結(jié)合一個測試抗體的MCF值是結(jié)合大鼠抗FLAG肽抗體L5的MCF值的至少50%、10%和20%之間、不超過10%。人⑶122位置39和41的氨基酸殘基被確定為對Mik- β I結(jié)合到表達⑶122的細胞十分重要。Dionyssopoulou 等人(J. Immunol. Methods, 241 :83_95 (2000)),米用固相妝掃描技術(shù)，在此前曾報道，Mik-β I識別一個不連續(xù)抗原表位，該表位由D2結(jié)構(gòu)域中位于2個區(qū)域的氨基酸形成；一個區(qū)域在106位的亮氨酸至148位的脯氨酸之間，另一個在170位的谷氨酸和202位的丙氨酸之間。我們的研究檢測了細胞表面表達的CD122，顯示D2結(jié)構(gòu)域?qū)?Mik-β I結(jié)合到⑶122不是關(guān)鍵的，而決定性的Mik-β I識別的殘基只位于Dl結(jié)構(gòu)域。Dl結(jié)構(gòu)域的42、43和65位氨基酸殘基被發(fā)現(xiàn)對于ABC2結(jié)合到人⑶122是非常重要的(圖19)。對于ABClOl，Dl結(jié)構(gòu)域的65和70位的氨基酸殘基及D2結(jié)構(gòu)域的第133位的殘基則是重要的(圖19)。因此，氨基酸殘基的特殊設(shè)置與ABC2和ABClOl結(jié)合到⑶122 是有關(guān)的。HuABC2和HuABClOl與人⑶122的18個單氨基酸的取代突變體的結(jié)合顯示于圖19，且也用上面描述的步驟通過FACS檢測，除了結(jié)合的人源化抗體用PE標(biāo)記的羊抗人IgG抗體檢測。HuABC2和ABC2表現(xiàn)出相同的與這18個⑶122突變體結(jié)合的模式。同樣，HuABClOl 與這些⑶122突變體的結(jié)合模式跟ABC101相同。人⑶122的Dl和D2結(jié)構(gòu)域的29個其他的單取代氨基酸突變體，實質(zhì)上并不能降低HuABC2或HuABClOl與⑶122的結(jié)合。人⑶122上位于42、43、65和133的氨基酸殘基，其發(fā)送IL-2和IL-15介導(dǎo)的信號的功能重要性用如下方法測量。全長⑶122(SEQ ID NO 73)的表達載體，其之前在實施例2 中用于產(chǎn)生TF-I β細胞，在位點42、43、65和133接受定點突變。產(chǎn)生的突變⑶122基因 (被指定為 F-R42A(SEQ ID NO :74)，F(xiàn)-R43A (SEQ ID NO :75)，F(xiàn)-G65T (SEQ ID NO 76)和 F-Hl33A(SEQ ID NO 77)(圖20))攜帶了單氨基酸突變分別為，位置42的精氨酸到丙氨酸、43位的精氨酸到丙氨酸、65位的甘氨酸到蘇氨酸及133位的組氨酸到丙氨酸。如實施例2所描述的，TF-I穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子隨著這4個突變的⑶122基因每一個產(chǎn)生。當(dāng)含有10% FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基時，TF-I在2ng/ml GM-CSF的存在下健康增長，在無GM-CSF時不生長。TF-I在存在200ng/ml IL-2或10ng/ml of IL-15/ IL-15Ra復(fù)合物(scIL-15/IL_15Ra ;—種可溶性的復(fù)合物人IL-15結(jié)合于人IL-15Ra 胞外域的一部分)時也不生長。TF-Ιβ，其可表達中度或高親和力的IL-2/IL-15受體，其在GM-CSF、IL-2或IL-15/IL-15Ra復(fù)合物的存在下健康生長。表達人CD122的F-R42A、 F-G65T或F-H133A突變體的TF-I細胞，在IL-2或IL-15/IL-15R α復(fù)合物的存在下失去生長能力，而在GM-CSF存在下具有生長能力。表達F-R43A突變體的TF-I細胞在IL_2、IL-15/ IL15Ra復(fù)合物或GM-CSF存在下具有生長能力。SEQ ID N0S.和序列對應(yīng)表 SEQ ID NO 1 ABC2 VH cDNA 序列ATGAAGTTGTGGTTAAACTGGGTTTTTCTTTTAACACTTTTACATGGTATCCAGTGTGAGGTGAAGCTGGTGGAATCTGGAGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGTTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAACTTCTGGGTTCACCTTCAGTGATTTCTACATGGAGTGGGTCCGCCAGCCTCCAGGGAAGAGACTGGAGTGGATTGCTGCAAGTAGAAACAAAGCTAATGATTATACAACAGAGTACAGTGCATCTGTGAAGGGTCGGTTCATCGTCTCCAGAGACACTTCCCAAAGCATCCTCTACCTTCAGATGAATGCCCTGAGAGCTGAGGACACTGCCATTTATTACTGTGCAAGATCCTACTATAGGTACGACGGTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCASEQ ID NO 2ABC2 VH氨基酸序列MKLWLNWVFLLTLLHGIQCEVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFYMEWVRQPPGKRLEWIAASRNKANDYTTEYSASVKGRFIVSRDTSQSILYLQMNALRAEDTAIYYCARSYYRYDGMDYWGQGTSVTVSSSEQ ID NO 3ABC2 VL cDNA 序列ATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAGTGTCCAGAGGACAAGTTGTTCTCACCCAGTCTCCAGTAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCATCTCAAGTGTAAGTTACATGTACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAGACTCCTGATTTATGACACATCCAACCTGGTTTCTGGAGTCCCTGTTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGcCGAATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAATACTTACCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAASEQ ID NO 4ABC2 VL氨基酸序列MDFQVQIFSFLLISASVIVSRGQVVLTQSPVIMSASPGEKVTMTCSAISSVSYMYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNLVSGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQffNTYPYTFGGGTKLEIKSEQ ID NO 5ABClOl VH cDNA 序列ATGAGAGTGTTGATTCTTGTGTACCTGTTGACAGTCCTTCCTGGTATACTGTCTGATGTACAGCTTCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGAAGCCTTCTCAGACAGTGTCCCTCACCTGCACTGTCACTGGCTACTCTATCACTAATGATAATCACTGGTGGAACTGGATCCGGCAGGTTTCAGGAAGCAAACTGGAGTGGATGGGGTACATAGACTCCAGTGGTAGTTCTGACAACAATCCATCTCTCAAAAGTCAAATCTCCATCACTAGAGACACTTCCAAGAACCAGTTATTCCTGCAGTTGAACTCTGTGACTATTGAAGATATAGGCACATATTACTGTGCAAGAGGCGGTGGTAGGGATTACTATGGCATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA SEQ ID NO 6 ABClOl VH氨基酸序列MRVLILVYLLTVLPGILSDVQLQESGPGLVKPSQTVSLTCTVTGYSITNDNHWffNWIRQVSGSKLEWMGYIDSSGSSDNNPSLKSQISITRDTSKNQLFLQLNSVTIEDIGTYYCARGGGRDYYGMDYffGQGTSVTVSSSEQ ID NO 7ABClOl VL cDNA 序列ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTGCTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCATGCAGGGCCAGCCAAAGTGTCAGTACATCTAGCTATAGTTATGTTCACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCAAGTATGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATACTGCAACATATTACTGTCAGCACAGTTGGGACATTCCGTTCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAASEQ ID NO 8ABClOl VL氨基酸序列METDTLLLWVLLLWVPGSTCDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASQSVSTSSYS YVHWYQQKPGQPPKLLIKYASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDTATY YCQHSffDIPFTFGGGTKLEIK SEQ ID NO 9人源化ABC2 (HuABC2) VH基因的核苷酸序列ACTAGTACCACCATGAAGTTGTGGTTGAACTGGGTTTTTCTTTTGACACTTTTGCATGGAATCCAGTGTGAAGTGCAGCTCGTGGAATCTGGAGGAGGCTTGGTTCAGCCTGGGGGATCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGGTTCACCTTCAGTGATTTCTACATGGAGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTCGAGTGGATTGCTGCAAGTAGAAACAAAGCTAATGATTATACAACAGAGTACAGTGCATCTGTGAAGGGTCGGTTCATCGTCTCCAGAGACGATTCCAAGAACTCACTCTACCTTCAGATGAATAGCCTGAAAACCGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCAAGATCCTACTATAGGTACGACGGTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCACAGTCACCGTCTCCTCAGGTAAGTTGGCTTTTTTAAGCTTSEQ ID NO 10人源化ABC2 (HuABC2) VH氨基酸序列MKLWLNWVFLLTLLHGIQCEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDFYMEW VRQAPGKGLEWIAASRNKANDYTTEYSASVKGRFIVSRDDSKNSLYLQMNSLKTE DTAVYYCARSYYRYDGMDYWGQGTTVTVSS SEQ ID NO 11人源化ABC2 (HuABC2) VL基因的核苷酸序列GCTAGCACCACCATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTGATCAGTGCCTCAGTCATCGTGTCCAGAGGAGAAATTGTGCTCACCCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAGAGAGCCACCCTCTCCTGCAGTGCCATCTCAAGTGTGAGTTACATGTACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGGCTCCCAGACTCCTGATTTATGACACATCCAACCTGGTGTCTGGAGTCCCTGCCCGCTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACCGACTACACTCTCACAATCAGCAGCCTGGAGCCTGAAGATTTTGCCGTTTATTACTGCCAGCAGTGGAATACTTACCCCTACACCTTCGGAGGGGGGACCAAAGTGGAAATCAAACGTAAGTAGAATCCAAGAATTCSEQ ID NO 12人源化ABC2 (HuABC2) VL氨基酸序列MDFQVQIFSFLLISASVIVSRGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSAISSVSYMY WYQQKPGQAPRLLIYDTSNLVSGVPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQ QffNTYPYTFGGGTKVEIK SEQ ID NO 13人源化ABClOl (HuABClOl) VH基因的核苷酸序列ACTAGTACCACCATGAGAGTGTTGATTCTTGTGTACCTGTTGACAGTCCTTCCTGGTATTCTGTCTCAGGTACAGCTTCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTCAAGCCTTCTCAGACACTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGCTACTCTATCACTAATGATAATCACTGGTGGAACTGGATCCGGCAGCACCCAGGAAAGGGCCTGGAATGGATGGGGTACATCGACTCCAGTGGTTCCTCTGACAACAATCCATCTCTCAAAAGTCAAATCACCATCTCAAGAGACACTTCCAAGAACCAGCTCTCCCTGAAGTTGAGCTCTGTGACTGCCGCCGATACAGCCGTGTATTACTGTGCAAGAGGCGGAGGCAGGGATTACTATGGCATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCACCGTCACCGTCTCCTCAGGTAAGAATGGCCTCTCAAGCTTSEQ ID NO 14人源化ABClOl (HuABClOl) VH氨基酸序列MRVLILVYLLTVLPGILSQVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYSITNDNHWffN WIRQHPGKGLEWMGYIDSSGSSDNNPSLKSQITISRDTSKNQLSLKLSSVTAADT AVYYCARGGGRDYYGMDYffGQGTTVTVSS SEQ ID NO 15人源化ABClOl (HuABClOl) VL基因的核苷酸序列 GCTAGCACCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTGCTGCTGCTCTGGG TTCCAGGTTCCACTGGTGACATTGTGATGACACAGTCTCCTGACTCCTTAGGCGT ATCTCTGGGGGAGAGGGCCACCATCAACTGCAGGGCCAGCCAAAGTGTCAGCACA32TCTAGCTATAGTTATGTTCACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCAAGTATGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGACAGGTTCAGCGGCTCTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAGGATGTGGCAGTCTATTACTGTCAGCACAGTTGGGACATTCCCTTCACATTCGGACAGGGGACCAAACTCGAAATCAAACGTAAGTAGTCTTCTCAGAATTCSEQ ID NO 16人源化ABClOl (HuABClOl) VL氨基酸序列METDTLLLWVLLLWVPGSTCDIVMTQSPDSLGVSLGERATINCRASQSVSTSSYSYVHWYQQKPGQPPKLLIKYASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHSffDIPFTFGQGTKLEIKSEQ ID NO 17小鼠Y-13’ PCR引物GCCAGTGGATAGACAGATGGSEQ ID NO 18小鼠Y _2a 3’ PCR引物GCCAGTGGATAGACCGATGGSEQ ID NO 19小鼠Y-2b的3，PCR引物GCCAGTGGATAGACTGATGGSEQ ID NO 20小鼠κ的3’ PCR引物GATGGATACAGTTGGTGCAGCSEQ ID NO 21ABC2 VH信號肽序列MKLffLNWVFLLTLLHGIQCSEQ ID NO 22ABC2 VH CDRl氨基酸序列DFYMESEQ ID NO 23ABC2 VH CDR2氨基酸序列ASRNKANDYTTEYSASVKGSEQ ID NO 24ABC2 VH CDR3氨基酸序列SYYRYDGMDYSEQ ID NO 25成熟ABC2 VH氨基酸序列EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFYMEWVRQPPGKRLEWIAASRNKANDYTTEYSASVKGRFIVSRDTSQSILYLQMNALRAEDTAIYYCARSYYRYDGMDYWGQGTSVTVSSSEQ ID NO 26ABC2 VL信號肽序列MDFQVQIFSFLLISASVIVSRGSEQ ID NO 27ABC2 VL CDRl氨基酸序列SAISSVSYMYSEQ ID NO 28ABC2 VL CDR2氨基酸序列DTSNLVSSEQ ID NO 29ABC2 VL CDR3氨基酸序列QQWNTYPYTSEQ ID NO 30成熟ABC2 VL的氨基酸序列QVVLTQSPVIMSASPGEKVTMTCSAISSVSYMYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNLVSGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQWNTYPYTFGGGTKLEIKSEQ ID NO 31ABClOl VH信號肽序列MRVLILVYLLTVLPGILSSEQ ID NO 32ABClOl VH CDRl氨基酸序列NDNHWWNSEQ ID NO 33ABClOl VH CDR2氨基酸序列YIDSSGSSDNNPSLKSSEQ ID NO 34ABClOl VH CDR3氨基酸序列GGGRDYYGMDYSEQ ID NO 35成熟ABClOl VH的氨基酸序列DVQLQESGPGLVKPSQTVSLTCTVTGYSITNDNHWWNWIRQVSGSKLEWMGYIDSSGSSDNNPSLKSQISITRDTSKNQLFLQLNSVTIEDIGTYYCARGGGRDYYGMDYWGQGTSVTVSSSEQ ID NO 36ABClOl VL信號肽序列METDTLLLWVLLLWVPGSTGSEQ ID NO 37ABClOl VL CDRl氨基酸序列 RASQSVSTSSYSYVHSEQ ID NO 38ABClOl VL CDR2氨基酸序列YASNLESSEQ ID NO 39ABClOl VL CDR3氨基酸序列QHSffDIPFTSEQ ID NO 40成熟ABClOl VL的氨基酸序列DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASQSVSTSSYSYVHWYQQKPGQPPKLLIKYASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDTATYYCQHSWDIPFTFGGGTKLEIKSEQ ID NO 41成熟HuABC2 VH的氨基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDFYMEWVRQAPGKGLEWIAASRNKA NDYTTEYSASVKGRFIVSRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARSYYRYDGMDY WGQGTTVTVSS SEQ ID NO 42成熟HuABC2 VL的氨基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSAISSVSYMYWYQQKPGQAPRLLIYDTSNLVS GVPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQWNTYPYTFGGGTKVEIK SEQ ID NO 43成熟HuABClOl VH的氨基酸序列QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYSITNDNHWWNWIRQHPGKGLEWMGYIDS SGSSDNNPSLKSQITISRDTSKNQLSLKLSSVTAADTAVYYCARGGGRDYYGMDY WGQGTTVTVSS SEQ ID NO 44成熟HuABClOl VL的氨基酸序列DIVMTQSPDSLGVSLGERATINCRASQSVSTSSYSYVHWYQQKPGQPPKLLIKYA SNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHSWDIPFTFGQGTKLEI KSEQ ID NO 45人DA430129cDNA編碼的成熟mature VH區(qū)的氨基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSDHYMDWVRQAPVKGLEWVGRTRDKANSYTTEYAASVKGRFTVSRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRGGAAMARGYQDGLDVffGQGTTVTVSSSEQ ID NO 46人M29469cDNA編碼的成熟VL區(qū)的氨基酸序列 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNKA TGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSKWPLTFGGGTKVEIKSEQ ID NO 47人DA936142 cDNA編碼的成熟VH區(qū)的氨基酸序列QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIDNTGFYWSWIRQHPGKGLEWIGNIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQLSLKLSSVTAADTAVYYCARDWGNSWDRGMDVffGQGTTVTVSSSEQ ID NO 48人Z46622cDNA編碼的成熟VL區(qū)的氨基酸序列 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIY WASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTPSYTFGQGTK LEIKSEQ ID NO 49人⑶122 Dl結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFSEQ ID NO 50人⑶122 D2結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列ENLRLMAPISLQVVHVETHRCNISffEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTffEEAP LLTLKQKQEWICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALG KDTSEQ ID NO 51小鼠CD122 Dl結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列AVKNCSHLECFYNSRANVSCMWSHEEALNVTTCHVHAKSNLRHWNKTCELTLVRQASWACNLILGSFPESQSLTSVDLLDINVVCWEEKGWRRVKTCDFHPFSEQ ID NO 52小鼠CD122 D2結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列DNLRLVAPHSLQVLHIDTQRCNISWKVSQVSHYIEPYLEFEARRRLLGHSWEDASVLSLKQRQQWLFLEMLIPSTSYEVQVRVKAQRNNTGTWSPWSQPLTFRTRPADPMKEISEQ ID NO 53攜帶FLAG多肽和GPI錨定信號的區(qū)域的氨基酸序列 TGGGDYKDDDDKGGGPNKGSGTTSGTTRLLSGHTCFTLTGLLGTLVTMGLLT SEQ ID NO 54人⑶122 Dl和D2結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQ ASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPI SLQVVHVETHRCNISffEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTffEEAPLLTLKQKQE WICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDT SEQ ID NO 55人⑶122 Dl和D2結(jié)構(gòu)域W38K突變體的氨基酸序列AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAKPDRRRWNQTCELLPVSQ ASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPI SLQVVHVETHRCNISffEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTffEEAPLLTLKQKQE WICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDT SEQ ID NO 56人⑶122 Dl和D2結(jié)構(gòu)域P39S突變體的氨基酸序列 AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWSDRRRWNQTCELLPVSQ ASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPI SLQVVHVETHRCNISffEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTffEEAPLLTLKQKQE WICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDT SEQ ID NO 57人⑶122 Dl和D2結(jié)構(gòu)域D40A突變體的氨基酸序列 AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPARRRWNQTCELLPVSQ ASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPI SLQVVHVETHRCNISffEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTffEEAPLLTLKQKQE WICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDT SEQ ID NO 58人⑶122 Dl和D2結(jié)構(gòu)域R41A突變體的氨基酸序列 AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDARRWNQTCELLPVSQ ASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPI SLQVVHVETHRCNISffEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTffEEAPLLTLKQKQE WICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDT SEQ ID NO 59人⑶122 Dl和D2結(jié)構(gòu)域R42A突變體的氨基酸序列 AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRARWNQTCELLPVSQ ASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPI SLQVVHVETHRCNISffEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTffEEAPLLTLKQKQE WICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDT SEQ ID NO 60人⑶122 Dl和D2結(jié)構(gòu)域R43A突變體的氨基酸序列 AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRAWNQTCELLPVSQ ASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPI SLQVVHVETHRCNISffEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTffEEAPLLTLKQKQE WICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDT SEQ ID NO 61人⑶122 Dl和D2結(jié)構(gòu)域W44A突變體的氨基酸序列 AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRANQTCELLPVSQ ASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPI SLQVVHVETHRCNISffEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTffEEAPLLTLKQKQEWICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDT SEQ ID NO 62人⑶122 Dl和D2結(jié)構(gòu)域L64A突變體的氨基酸序列 AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQ ASWACNLIAGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPI SLQVVHVETHRCNISffEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTffEEAPLLTLKQKQE WICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDT SEQ ID NO 63人⑶122 Dl和D2結(jié)構(gòu)域G65A突變體的氨基酸序列 AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQ ASWACNLILAAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPI SLQVVHVETHRCNISffEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTffEEAPLLTLKQKQE WICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDT SEQ ID NO 64人⑶122 Dl和D2結(jié)構(gòu)域G65T突變體的氨基酸序列 AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQ ASWACNLILTAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPI SLQVVHVETHRCNISffEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTffEEAPLLTLKQKQE WICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDT SEQ ID NO 65人⑶122 Dl和D2結(jié)構(gòu)域A66S突變體的氨基酸序列 AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQ ASWACNLILGSPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPI SLQVVHVETHRCNISffEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTffEEAPLLTLKQKQE WICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDT SEQ ID NO 66人⑶122 Dl和D2結(jié)構(gòu)域S69A突變體的氨基酸序列 AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQ ASWACNLILGAPDAQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPI SLQVVHVETHRCNISffEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTffEEAPLLTLKQKQE WICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDT SEQ ID NO 67人⑶122 Dl和D2結(jié)構(gòu)域Q70A突變體的氨基酸序列 AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQ ASWACNLILGAPDSAKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPI SLQVVHVETHRCNISffEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTffEEAPLLTLKQKQE WICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDT SEQ ID NO 68人⑶122 Dl和D2結(jié)構(gòu)域Q70K突變體的氨基酸序列AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQ ASWACNLILGAPDSKKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPI SLQVVHVETHRCNISffEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTffEEAPLLTLKQKQE WICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDT SEQ ID NO 69人⑶122 Dl和D2結(jié)構(gòu)域K71A突變體的氨基酸序列 AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQ ASWACNLILGAPDSQALTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPI SLQVVHVETHRCNISffEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTffEEAPLLTLKQKQE WICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDT SEQ ID NO 70人⑶122 Dl和D2結(jié)構(gòu)域S132A突變體的氨基酸序列 AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQ ASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPI SLQVVHVETHRCNISffEISQAAHYFERHLEFEARTLSPGHTffEEAPLLTLKQKQE WICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDT SEQ ID NO 71人⑶122 Dl和D2結(jié)構(gòu)域H133A突變體的氨基酸序列 AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQ ASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPI SLQVVHVETHRCNISffEISQASAYFERHLEFEARTLSPGHTffEEAPLLTLKQKQE WICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDT SEQ ID NO 72人⑶122 Dl和D2結(jié)構(gòu)域Y134A突變體的氨基酸序列AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPISLQVVHVETHRCNISffEISQASHAFERHLEFEARTLSPGHTffEEAPLLTLKQKQEWICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDTSEQ ID NO 73全長人CD 122氨基酸序列AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQ ASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPI SLQVVHVETHRCNISffEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTffEEAPLLTLKQKQE WICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPffSQPLAFRTKPAALGKDTIPWLGH LLVGLSGAFGFIILVYLLINCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHG⑶VQ KWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLLQQDKVPEPASLSSNHSLT SCFTNQGYFFFHLPDALEIEACQVYFTYDPYSEEDPDEGVAGAPTGSSPQPLQPL SGEDDAYCTFPSRDDLLLFSPSLLGGPSPPSTAPGGSGAGEERMPPSLQERVPRD WDPQPLGPPTPGVPDLVDFQPPPELVLREAGEEVPDAGPREGVSFPWSRPPGQGEFRALNARLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLV SEQ ID NO 74全長人⑶122的F-R42A突變體的氨基酸序列AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRARWNQTCELLPVSQASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPISLQVVHVETHRCNISffEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTffEEAPLLTLKQKQEWICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPffSQPLAFRTKPAALGKDTIPWLGHLLVGLSGAFGFIILVYLLINCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHG⑶VQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLLQQDKVPEPASLSSNHSLTSCFTNQGYFFFHLPDALEIEACQVYFTYDPYSEEDPDEGVAGAPTGSSPQPLQPLSGEDDAYCTFPSRDDLLLFSPSLLGGPSPPSTAPGGSGAGEERMPPSLQERVPRDWDPQPLGPPTPGVPDLVDFQPPPELVLREAGEEVPDAGPREGVSFPWSRPPGQGEFRALNARLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLVSEQ ID NO 75全長人⑶122的F-R43A突變體的氨基酸序列AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRAWNQTCELLPVSQASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPISLQVVHVETHRCNISffEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTffEEAPLLTLKQKQEWICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPffSQPLAFRTKPAALGKDTIPWLGHLLVGLSGAFGFIILVYLLINCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHG⑶VQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLLQQDKVPEPASLSSNHSLTSCFTNQGYFFFHLPDALEIEACQVYFTYDPYSEEDPDEGVAGAPTGSSPQPLQPLSGEDDAYCTFPSRDDLLLFSPSLLGGPSPPSTAPGGSGAGEERMPPSLQERVPRDWDPQPLGPPTPGVPDLVDFQPPPELVLREAGEEVPDAGPREGVSFPWSRPPGQGEFRALNARLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLVSEQ ID NO 76全長人⑶122的F-G65T突變體的氨基酸序列AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQASWACNLILTAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPISLQVVHVETHRCNISffEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTffEEAPLLTLKQKQEWICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPffSQPLAFRTKPAALGKDTIPWLGHLLVGLSGAFGFIILVYLLINCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHG⑶VQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLLQQDKVPEPASLSSNHSLTSCFTNQGYFFFHLPDALEIEACQVYFTYDPYSEEDPDEGVAGAPTGSSPQPLQPLSGEDDAYCTFPSRDDLLLFSPSLLGGPSPPSTAPGGSGAGEERMPPSLQERVPRDWDPQPLGPPT PGVPDLVDFQPPPELVLREAGEEVPDAGPREGVS FPffSRPPGQGEFRALNARLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLVSEQ ID NO 77全長人⑶122的F-Hl33A突變體的氨基酸序列AVNGTSQFTCFYNSRANISC VWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQ ASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPI SLQVVHVETHRCNISffEISQASAYFERHLEFEARTLSPGHTffEEAPLLTLKQKQE WICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPffSQPLAFRTKPAALGKDTIPWLGH LLVGLSGAFGFIILVYLLINCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHG⑶VQ KWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLLQQDKVPEPASLSSNHSLT SCFTNQGYFFFHLPDALEIEACQVYFTYDPYSEEDPDEGVAGAPTGSSPQPLQPL SGEDDAYCTFPSRDDLLLFSPSLLGGPSPPSTAPGGSGAGEERMPPSLQERVPRD WDPQPLGPPTPGVPDLVDFQPPPELVLREAGEEVPDAGPREGVSFPWSRPPGQGE FRALNARLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLV
權(quán)利要求
1.一種單克隆抗體，所述單克隆抗體特異性結(jié)合CD122并且能阻止IL-2和IL-15與含有⑶122和⑶132的受體結(jié)合。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的單克隆抗體，其與CD122的結(jié)合可以被CD122殘基42、43和/或133替換為丙氨酸和/或殘基65替換為蘇氨酸和/或殘基70替換為賴氨酸所阻止，殘基編號如SEQ ID NO:73中所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的單克隆抗體，其與CD122的結(jié)合可以被CD122殘基42和/或43替換為丙氨酸和/或殘基65替換為蘇氨酸所阻止，殘基編號如SEQ ID NO: 73中所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的單克隆抗體，其與CD122的結(jié)合可以被CD122殘基65替換為蘇氨酸和/或殘基70替換為賴氨酸和/或殘基133替換為丙氨酸所阻止，殘基編號如SEQID NO:73中所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的單克隆抗體，其特異性結(jié)合包含殘基42的抗原表位，殘基編號如SEQ ID NO:73中所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的單克隆抗體，其特異性結(jié)合包含殘基65的抗原表位，殘基編號如SEQ ID NO:73中所示。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的單克隆抗體，其特異性結(jié)合包含SEQID NO:7中殘基133的⑶122的抗原表位。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的單克隆抗體，其特異性結(jié)合包含SEQID NO:73中殘基42、43、65、70和/或133的CD 122的抗原表位。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的單克隆抗體，其特異性結(jié)合包含SEQID NO:73中殘基42、43和65的⑶122的抗原表位。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的單克隆抗體，其特異性結(jié)合包含SEQID NO:73中殘基65、70和133的CD 122的抗原表位。
11.根據(jù)權(quán)利要求I所述的單克隆抗體，其特異性結(jié)合位于SEQID NO:73序列的纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域I中的⑶122的抗原表位。
12.根據(jù)權(quán)利要求I所述的單克隆抗體，其特異性結(jié)合位于SEQID NO:73序列的纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域I和2中的⑶122的抗原表位。
13.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求所述的單克隆抗體，其與CD122的結(jié)合在檢測上不被SEQID NO:73中殘基39或41替換為丙氨酸時所阻止。
14.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求所述的單克隆抗體，其阻止IL-2與包含⑶122、⑶132和⑶25的受體結(jié)合。
15.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求所述的單克隆抗體，其阻止反式結(jié)合于IL-15Ra的IL-15或它的片段與包含⑶122和⑶132的受體結(jié)合。
16.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求所述的單克隆抗體，其阻止IL-15與包含⑶122、⑶132和IL-15RQ的受體結(jié)合。
17.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求所述的單克隆抗體，其中，當(dāng)所述抗體相對于IL-2或IL-15呈現(xiàn)為不大于100倍摩爾過量時，所述的結(jié)合的抑制至少是抑制30%。
18.根據(jù)權(quán)利要求I所述的單克隆抗體，其與抗體ABC2競爭特異性結(jié)合CD122且其特征在于SEQ ID NO :30的一個成熟的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO :25的一個成熟的重鏈可變區(qū)，或其與抗體ABClOl競爭特異性結(jié)合⑶122且其特征在于SEQ ID NO 40的一個成熟的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO :35的一個成熟的重鏈可變區(qū)。
19.根據(jù)權(quán)利要求I所述的單克隆抗體，其結(jié)合于與ABC2或ABClOl相同的CD122上的抗原表位。
20.根據(jù)權(quán)利要求I所述的單克隆抗體，其包含三個輕鏈⑶Rs和三個重鏈⑶Rs，其中每個CDR至少有90%的序列與源自ABC2(SEQ ID NOS :27-29輕鏈和22-24重鏈)或ABClOl(SEQ ID NOS:37-39輕鏈和32-34重鏈)的一個相應(yīng)CDR相同。
21.根據(jù)權(quán)利要求I所述的單克隆抗體，其包含ABC2或ABClOl的三個輕鏈⑶Rs和三個重鏈⑶Rs。
22.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求所述的單克隆抗體，其為嵌合的、人源化的、飾面的或人的。
23.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求所述的單克隆抗體，其具有人IgGlK同種型。
24.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求所述的單克隆抗體，其是完整的抗體。
25.根據(jù)權(quán)利要求1-23中任一項所述的單克隆抗體，其是單鏈抗體、Fab或Fab’2片段。
26.一種特異結(jié)合CD122的人源化的或嵌合的ABC2抗體，其中ABC2是小鼠抗體且該ABC2抗體特征在于SEQ ID NO :30的一個成熟的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO :25的一個成熟的重鏈可變區(qū)。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的人源化抗體，其包含一條含有ABC2輕鏈(SEQID N0:30)三個CDRs的人源化的輕鏈，及一條含有ABC2重鏈(SEQ ID NO:25)三個CDRs的人源化的重鏈。
28.根據(jù)權(quán)利要求26所述的人源化抗體，其包含一個與SEQID NO:42至少90%相同的人源化成熟輕鏈可變區(qū)，及一個與SEQ ID NO. 41至少90%氨基酸序列相同的人源化重鏈可變區(qū)。
29.根據(jù)權(quán)利要求26所述的人源化抗體，其所提供的位點H28、H48、H49、H68、H93和L71，該位點通過Kabat編號，分別被殘基T、I、A、I、A和Y占據(jù)。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的人源化抗體，其進一步包括位點H42，該通過Kabat編號的位點被G占據(jù)。
31.根據(jù)權(quán)利要求26所述的人源化抗體，其中所述的輕鏈CDRs是SEQID N0S. 27-29，所述的重鏈 CDRs 是 SEQ ID NOS :22-24ο
32.一種特異結(jié)合⑶122的人源化的或嵌合的ABClOl抗體，其中ABClOl的特征在于SEQ ID NO 40的一個成熟的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 35的一個成熟的重鏈可變區(qū)。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的人源化抗體，其包含一條含有SEQIDN0:40三個⑶Rs的人源化的輕鏈，及一條含有SEQ ID NO: 35三個⑶Rs的人源化的重鏈。
34.根據(jù)權(quán)利要求32所述的人源化抗體，其包含一個與SEQID N0:44至少90%相同的人源化成熟輕鏈可變區(qū)，及一個與SEQ ID NO. 43至少90%氨基酸序列相同的人源化重鏈可變區(qū)。
35.根據(jù)權(quán)利要求32所述的人源化抗體，其所提供的位點H27、H30、H48、H66、H67、H71和L49，該位點通過Kabat編號，分別被殘基Y、T、M、Q、I、R和K占據(jù)。
36.根據(jù)權(quán)利要求32所述的人源化抗體，其中所述的輕鏈⑶Rs是SEQID N0S. 37-39且所述的重鏈CDRs是SEQ ID NOS. 32-34。
37.一種含有以上任一項權(quán)利要求定義的抗體和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。
38.一種在患者體內(nèi)抑制不希望的免疫應(yīng)答的方法，包括給患者施用以上任一項權(quán)利要求的抗體的有效方案。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述患者有自身免疫疾病。
40.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述疾病是多發(fā)性硬化癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、糖尿病、牛皮癬、腹腔疾病或葡萄膜炎。
41.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述患者有哮喘或過敏。
42.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述患者有移植物抗宿主疾病。
43.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述患者有宿主抗移植物疾病。
44.一種在患者體內(nèi)治療腫瘤的方法，包括給患者施用以上任一項權(quán)利要求的抗體的有效方案。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述腫瘤表達可檢測到的CD122。
46.一個SEQ ID NO :73中的不超過100個連續(xù)殘基的分離片段，包括43、65和133殘基中的一個或多個。
47.根據(jù)權(quán)利要求所述的分離的片段，其包含SEQID NO:73的殘基43和65。
48.根據(jù)權(quán)利要求所述的分離的片段，其包含SEQID N0:73的殘基65和133。
49.根據(jù)權(quán)利要求所述的分離的片段，其包含SEQID N0:73中的10個或更少的連續(xù)殘基。
50.根據(jù)權(quán)利要求所述的分離的片段，其連接到一個載體，該載體可幫助誘發(fā)應(yīng)對所述片段的抗體的產(chǎn)生，并且/或者該載體作為一個組合物的組件與佐劑一起以幫助誘發(fā)應(yīng)對所述片段的抗體的產(chǎn)生。
全文摘要
本發(fā)明提供了異性結(jié)合CD122的單克隆抗體，而CD122是IL-2和IL-15受體的一個組成部分。通過抑制這些細胞因子與它們的受體結(jié)合，所述的單克隆抗體具有實質(zhì)上抑制IL-2和IL-15介導(dǎo)的功能的能力。所述的單克隆抗體可被用于抑制不希望發(fā)生的免疫應(yīng)答或治療腫瘤，以及其他。
文檔編號A61P35/00GK102939305SQ201180018102
公開日2013年2月20日 申請日期2011年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月8日
發(fā)明者J.·云·曹, 鶴下直哉, 尼古拉斯·F.·蘭多爾菲, 尚卡爾·庫馬爾 申請人:Jn生物科學(xué)有限責(zé)任公司