專利名稱：高穩(wěn)定性vpac2型受體特異激動劑mhdbay及其制備方法與應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種高穩(wěn)定性VPAC2型受體特異激動劑 MHDBAY及其制備方法，與其用于制備治療VPAC2型受體相關(guān)疾病的藥物，如促進葡萄糖依 賴的胰島素分泌，提高機體對高濃度血糖的應急能力，有效降低血糖濃度，保護胰腺β細 胞功能和增加β細胞數(shù)量及調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能等作用。
背景技術(shù)：
垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽(PACAP)是1990年被發(fā)現(xiàn)由腦垂體分泌的具有重要生 物學功能的神經(jīng)多肽，是促胰液素/高血糖素/VIP家族中的新成員。PACAP有兩種存在形 式PACAP38，由38個氨基酸組成；PACAP27，由PACAP38氮端的27個氨基酸組成。PACAP通 過激活其特異的G蛋白偶聯(lián)受體，提高靶細胞cAMP等第二信使的濃度，從而發(fā)揮廣泛而重 要的生物學功能。PACAP有三類G蛋白偶聯(lián)受體PAC1、VPAC1和VPAC2 ；三類受體在生物體 中分布不同，所起的作用也不相同。其中VPAC2型受體分布于胰島等組織，與能量代謝密切 相關(guān)，從臨床觀點看，作為VPAC2型受體特異激動劑的特定PACAP衍生物可有效地降低血液 葡萄糖水平，保護β-細胞功能及阻止疾病發(fā)展的潛力，且無低血糖癥風險，可用于糖尿病 的任何病期，作為具有廣泛作用的神經(jīng)多肽，對于二期和三期糖尿病患者具有優(yōu)于其他藥 物的綜合治療作用，為公認的治療II型糖尿病的新型藥物。PACAP與VPAC2受體作用主要與腺苷酸環(huán)化酶(AC)藕聯(lián)通過cAMP信號傳導通 路，激活AC，催化ATP轉(zhuǎn)化為cAMP，cAMP隨之激活其依賴性蛋白激酶A (PKA)，PKA可使細胞 內(nèi)多種蛋白質(zhì)磷酸化，產(chǎn)生生理效應，尤其是在促進相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄有重要作用。PACAP通過 VPAC2受體介導的生物學功能主要有神經(jīng)遞質(zhì)/調(diào)質(zhì)、促進激素分泌，調(diào)節(jié)內(nèi)分泌平衡；調(diào) 節(jié)性腺功能和生殖細胞的產(chǎn)生；調(diào)節(jié)能量代謝平衡等。研究表明，VPAC2型受體特異激動劑可有效促進葡萄糖依賴的胰島素分泌，提高機 體對高濃度血糖的應急能力有效降低血糖濃度，保護胰腺β細胞功能和增加β細胞數(shù)量。 但PACAP及其許多衍生物，如BAY等，在體內(nèi)很快被二肽基肽酶IV(DPPIV)降解，其體內(nèi)穩(wěn) 定性較差；而且由于自身的代謝和腎的濾過作用，許多藥物肽在生物體內(nèi)被迅速清除。因 此，延長某些肽類等分子藥物的半衰期是現(xiàn)在許多新型分子藥物研發(fā)的目標和難點，也是 其臨床應用急待解決的問題。因此，研發(fā)作為VPAC2型受體特異激動劑的高穩(wěn)定性PACAP 衍生多肽，具有重要的藥用價值。目前已報道的VPAC2型受體特異激動劑，如多肽BAY55-9837、多肽Ro25_1553 等，在水溶液或體液環(huán)境中的穩(wěn)定性有待提高，而且，由于自身的代謝和腎的濾過作用，在 生物體內(nèi)被迅速清除效應有待改善。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，提供一種具有更高穩(wěn)定性和更高生物活性的高穩(wěn)定性VPAC2型受體特異激動劑MHDBAY。本發(fā)明的另一目的在于提供所述高穩(wěn)定性VPAC2型受體特異激動劑MHDBAY的 制備方法。該制備方法根據(jù)PACAP衍生多肽MHDBAY的氨基酸序列及大腸桿菌密碼子的 偏好性，設(shè)計MHDBAY在原核表達系統(tǒng)的基因序列，采用基因工程技術(shù)，結(jié)合蛋白內(nèi)含肽 (intein)的可誘導剪切功能實現(xiàn)目的多肽MHDBAY的高效制備；該制備方法生產(chǎn)效率高，生 產(chǎn)成本低。本發(fā)明的再一目的在于提供所述高穩(wěn)定性VPAC2型受體特異激動劑MHDBAY的應用。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)一種高穩(wěn)定性VPAC2型受體特異激動劑 MHDBAY，其氨基酸序列如下所示MWQRPSSWIEGRFPHSDAVFTDQYTRLRKQLAAKKYLQSLKQKRY 其組成為甲硫氨酸(M)-高親和力的人血清白蛋白(HSA)結(jié)合七肽WQRPSSW-凝 血因子)(a酶識別序列IEGR- 二肽基肽酶DPPIV識別序列FP-活性治療多肽MBAY (其氨基 酸序列為HSDAVFTDQYTRLRKQLAAKKYLQSLKQKRY，特異作用于 VPAC2 受體)所述高穩(wěn)定性VPAC2型受體特異激動劑MHDBAY的編碼核苷酸序列為ATG TGG CAG CGC CCG AGC AGC TGG ATT GM GGT CGC TTT CCG CAT AGC GATGCG GTG TTT ACC GAT CAG TAT ACC CGT CTG CGT AAA CAG CTG GCG GCG AAA AMTAT CTG CAG AGC ATT AAA CAG AAA CGT TAT所述高穩(wěn)定性VPAC2型受體特異激動劑MHDBAY的制備方法，包括以下步驟(1)設(shè)計并合成MHDBAY基因采用3條引物兩步法合成MHDBAY基因引物Fl:5' -GGT GGT CAT ATG TGG CAG CGC CCG AGC AGC TGG ATT GAA GGT CGC TTT CCGCAT AGC GAT-3'；引物F2:5' -CGC CAG CTG TTT ACG CAG ACG GGT ATA CTG ATC GGT AAA CAC CGC ATC GCTATG CGG AAA-3'；引物F3:5' -CCA CCA TGC TCT TCC GCA ATA ACG TTT CTG TTT A AT GCT CTG CAG ATA TTTTTT CGC CGC CAG CTG TTT-3，其中，GGTGGT 或 CCA CCA 為保護堿基，CATATG 為 NdeI 酶切位點，TGC TCTTCC GCA 為SapI酶切位點；首先將引物Fl和引物F2進行鏈延伸反應，然后以其產(chǎn)物為DNA模板，以Fl和F3 為引物，PCR反應制得MHDBAY基因；(2)構(gòu)建重組載體 pKY-MHDBAY 用Ndel酶和Sapl酶分別對質(zhì)粒pKYB和步驟(1)制得的MHDBAY基因進行雙酶切， 再將雙酶切后的MHDBAY基因和雙酶切后的質(zhì)粒pKYB連接，得到重組載體pKY-MHDBAY ；(3)制備表達工程菌 pKY-MHDBAY/ER2566 用重組載體pKY-MHDBAY轉(zhuǎn)化表達宿主菌大腸桿菌Ecoli Strain ER2566，得到表達工程菌 pKY-MHDBAY/ER2566 ；(4)表達和純化①誘導表達工程菌pKY-MHDBAY/ER2566表達由目的多肽、蛋白內(nèi)含肽和幾丁質(zhì)結(jié) 合域(Chitin binding domain，CBD)組成的“三元”融合蛋白；②得到的“三元”融合蛋白用幾丁質(zhì)柱進行純化，“三元”融合蛋白吸附于幾丁質(zhì)柱 中，然后含有硫醇的溶液過柱并充滿幾丁質(zhì)柱環(huán)境中，反應。硫醇的作用是誘導蛋白內(nèi)含肽 的N端切割，釋放目的多肽C端硫酯；接著洗脫幾丁質(zhì)柱，得到目的多肽C端硫酯，透析目的 多肽C端硫酯，從而產(chǎn)生穩(wěn)定的水解產(chǎn)物；③利用高效液相色譜技術(shù)純化目的多肽，得到高穩(wěn)定性VPAC2型受體特異激動劑 MHDBAY。步驟(1)中所述鏈延伸反應的條件優(yōu)選為94°C，10min;降至58°C 5min; 72 °C IOmin ；步驟(1)中所述PCR反應的條件優(yōu)選為反應條件為95°C 5min ；95°C lmin, 55°C lmin，72°C lmin, 30 個循環(huán)；72°C延伸 IOmin ；步驟(4)②中所述含有硫醇的溶液的組成如下20mM Tris_HCI，0. 5M NaCl,lmM EDTA，50mM3 -巰基乙醇，pH 8.0;步驟(4)②中所述反應的條件優(yōu)選為16°C反應M小時；步驟⑷②中所述洗脫幾丁質(zhì)柱的溶液的組成優(yōu)選如下20mM Tris-HCl, 500mM NaCI，ImM EDTA,pH 8. 0 ；步驟(4)③中所述利用高效液相色譜技術(shù)純化目的多肽MHDBAY的步驟如下A、流動相A為在體積百分比10%乙腈(CNCH3,溶質(zhì)為純水)中添加三氟乙酸(TFA) 得到，TFA的終濃度為體積百分比0. 1% ；流動相B為100%乙腈(CNCH3)中添加三氟乙酸 (TFA)，TFA的終濃度為體積百分比0. 1% ；流速lmL/min，20min線性梯度洗脫；B、線性梯度洗脫中流動相B由0 60% (ν/ν)，收集目的多肽洗脫峰，光吸收檢測 波長為218nm ；并進行質(zhì)譜鑒定。 所述高穩(wěn)定性VPAC2型受體特異激動劑MHDBAY應用于制備治療如下疾病的藥物 糖尿病及其并發(fā)癥，高血糖癥，高血壓，血栓癥，肥胖癥、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心臟及 腎衰竭。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果(1)本發(fā)明所制備的高穩(wěn)定性VPAC2型受體特異激動劑MHDBAY，是PACAP衍生多 肽，與野生型PACAP相比，在其N端多了一個甲硫氨酸，并具有特殊的氨基酸序列，即在C端 通過巰酯鍵結(jié)合硫醇，成為多肽硫酯，多肽硫酯可以水解產(chǎn)生天然的羧基端，也可特異水解 成為硫代羧酸。(2)該VPAC2型受體特異激動劑MHDBAY的氨基酸序列不同于其他與PACAP同源或 非同源的VPAC2型受體特異激動劑，與BAY55-9837的區(qū)別點在于首先，重組多肽MHDBAY 的N端有一個高親和力的人血清白蛋白(HSA)結(jié)合七肽WQRPSSW及凝血因子酶識別 序列IEGR和DPPIV識別序列FP ；其次，突變原BAY55-9837的第九位氨基酸天冬酰胺(N) 為谷氨酰胺⑴)，突變原BAY55-9837的第十七位氨基酸纈氨酸(V)為亮氨酸(L)，突變原 BAY55-9837的第二十八位氨基酸天冬酰胺(N)為谷氨酰胺(Q)。
這些區(qū)別使得MHDBAY具有更高的穩(wěn)定性和對VPAC2型受體的特異激活活性。進 入血液后，MHDBAY與人血清白蛋白結(jié)合形成HSA-MHDBAY復合物(MW :67. 03kDa.)，隨血液循 環(huán)，這既可防止由于分子量小(MHDBAY分子量5M4. 2Da.)而被腎臟快速清除；又由于復合 物中含有凝血因子fe酶和DPPIV識別序列，可被兩種酶有序酶解，最后釋放出已進行關(guān)鍵 氨基酸突變的活性治療多肽MBAY (HSDAVFTDQYTRLRKQLAAKKYLQ SLKQKRY)，與VPAC2受體特 異結(jié)合，從而發(fā)揮治療II型糖尿病的功效。( 本發(fā)明所制備的高穩(wěn)定性VPAC2型受體特異激動劑MHDBAY在治療糖尿病及其 并發(fā)癥，高血糖癥，高血壓，血栓癥，肥胖癥、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心臟及腎衰竭疾病 中有顯著的療效。(4)利用本發(fā)明所述的制備方法得到的重組多肽MHDBAY的穩(wěn)定性比化學合成 MHDBAY多肽提高約8倍，比化學合成BAY55-9837多肽的穩(wěn)定性提高約25倍。本發(fā)明的表 達方法效率高、成本低，應用前景廣闊。


圖1為含所選7-mer肽的噬菌體與人血清白蛋白的親和作用曲線。圖2為重組多肽MHDBAY的制備示意圖。圖3為MHDBAY基因合成及重組表達質(zhì)粒pKY_MHDBAY構(gòu)建示意圖；圖中MCS_多克隆位點；CBD-幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域；intein-內(nèi)含肽。圖4為SDS-PAGE檢測融合蛋白htein-CBD_MHDBAY表達的鑒定圖；其中，泳道1 是IPTG誘導后菌體破碎上清液；泳道2是IPTG誘導前菌體破碎上清液。圖5為制備的重組多肽MHDBAY的飛行質(zhì)譜鑒定圖。圖6為重組多肽MHDBAY與BAY55-9837的穩(wěn)定性比較與檢測結(jié)果圖。圖7為重組多肽MHDBAY/BAY55-9837和[125I]PACAP38對VPAC2受體的競爭性結(jié) 合檢測結(jié)果圖。圖8為重組多肽MHDBAY與BAY55-9837促進CH0-VPAC2細胞cAMP生成的活性測
定結(jié)果圖。圖9為重組多肽MHDBAY和BAY55-9837對ICR小鼠的急性糖耐量試驗的檢測結(jié)果圖。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限 于此。實施例1人血清白蛋白親和結(jié)合7-mer肽的淘選利用New England Biolabs, Inc公司的隨機七肽噬菌體展示文庫(Ph. D. _7噬菌 體展示肽庫)篩選人血清白蛋白高親和7-mer肽。Ph.D.-7噬菌體展示肽庫是將隨機七肽融合到M13噬菌體次要衣殼蛋白 (PiII)上，是一個組合文庫，本文庫包含的隨機七肽序列數(shù)在10以上，本文庫的滴度為 2X1013pfu/mLo
用固定靶分子直接包被平板法進行四輪淘選。第一輪淘選(1)將人血清白蛋白(Sigma-Aldrich公司)溶于0. IM的NaHCO3溶液(ρΗ8· 6)， 配制濃度為100μ g/mL的人血清白蛋白溶液(pH 8. 6)；(2)在單個滅菌聚苯乙烯培養(yǎng)皿平板(60X 15mm,Coring hcorporated公司)中 加入1. 5mL上述人血清白蛋白溶液溶液，反復旋轉(zhuǎn)直到表面完全濕潤，在增濕容器中4°C輕 微震蕩，孵育過夜，平板可在此容器中4°C貯存?zhèn)溆茫?3)用ImL的TBST緩沖液(TBS緩沖液中含0. 1% [ν/ν]的吐溫-20, pH 7. 5)稀 釋2Χ1011的噬菌體(即IOyL的原始文庫)，然后加到已包被和封閉好的平板上，室溫溫 和搖動50min ；(4)傾倒除去未結(jié)合噬菌體并拍甩除去殘余溶液，用上述TBST緩沖液洗板10次； 將人血清白蛋白溶于TBS緩沖液(pH 7. 5)中，配制濃度為100 μ g/mL的溶液，用此溶液ImL 將結(jié)合的噬菌體競爭性洗脫下來，洗脫時間為40min ；(5)取少量洗脫的噬菌體按照試劑盒說明書方法進行滴度測定，其余洗脫的噬菌 體按照試劑盒說明書方法進行擴增并測定滴度；第二輪淘選按照第一輪淘選方法，取包被好的聚苯乙烯培養(yǎng)皿平板，封閉后加入第一輪淘選 擴增后的噬菌體，加入噬菌體量為2 X IO11Pfu,進行第二輪淘選，方法與第一輪淘選相同；第三輪淘選按照第一輪淘選方法，取包被好的聚苯乙烯培養(yǎng)皿平板，封閉后加入第二輪淘選 擴增后的噬菌體，加入噬菌體量為2 X IO11Pfu,進行第三輪淘選，方法與第一輪淘選略有改 動在清洗步驟中將TBST緩沖液中吐溫-20的濃度增至0. 3% [ν/ν]；第四輪淘選按照第一輪淘選方法，取包被好的聚苯乙烯培養(yǎng)皿平板，封閉后加入第三輪淘選 擴增后的噬菌體，加入噬菌體量為2Χ IO11Pfu,進行第四輪淘選，方法與第一輪淘選有部分 改動在清洗步驟中將TBST緩沖液中吐溫-20的濃度增至0. 3% [ν/ν]；包被平板時所用 人血清白蛋白溶液的濃度降低為10 μ g/mL;噬菌體與平板的結(jié)合時間由前三輪篩選時的 50min縮短為20min，洗脫時間由前三輪篩選時的40min增加為60min。在第四輪淘選出的噬菌體中隨機選擇10個噬菌斑進行DNA測序，測序引物 為-96gIII 測序引物(其 DNA 序列為5，-CCC TCA TAG TTA GCG TAACG-3，)，根據(jù) DNA 測 序結(jié)果推演為氨基酸序列，實驗結(jié)果表明，與人血清白蛋白親和結(jié)合7-mer肽的氨基酸序 列為WQRPSSW。實施例2人血清白蛋白親與所淘選的7-mer肽的親和力測定利用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)方法檢測淘選得到的7-mer肽與人血清白蛋白的 親和力，具體步驟如下對要鑒定的含有與人血清白蛋白親和結(jié)合7-mer肽(其氨基酸序列為WQRPSSW) 的噬菌斑克隆進行純培養(yǎng)并測定滴度。將過夜培養(yǎng)的大腸桿菌ER2738(New England Biolabs公司)按1 100的體積比例稀釋于20mLLuria_Bertani (broth)培養(yǎng)基(LB)中，于每管ER2738培養(yǎng)液中加入5 μ L噬菌體上清，37°C通氣培養(yǎng)4.證。上述培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入離心管中，10，OOOrpm離心lOmin，上清移入新鮮離心管，再離 心，取體積百分比80%上清于新鮮離心管中，加1/6體積的PEG-8000/NaCl (20 % [w/v] PEG-8000,2. 5M NaCl)，4°C沉淀過夜后，10, OOOrpm離心沉淀15min，棄上清，沉淀重懸于ImL TBS緩沖液中，懸液轉(zhuǎn)入微量離心管，4°C離心5min，上清轉(zhuǎn)入新鮮微量離心管，加1/6體積 的PEG-8000/NaCl再沉淀，冰上作用30min，4°C離心lOmin，棄上清；沉淀重懸于50 μ L TBS 緩沖液中，測定噬菌體滴度，4°C貯存。將人血清白蛋白(Sigma-Aldrich公司)溶于0. IM的NaHCO3溶液(pH 8. 6)，配制 濃度為100 μ g/mL的人血清白蛋白溶液(pH 8. 6)，用此溶液包被ELISA板的一排空，每空加 入200 μ L，作為陽性實驗組；用另一 ELISA板連續(xù)四倍稀釋噬菌體，由第12孔加入IO12個 病毒子，進行4倍系列稀釋至第1孔為2. 4 X IO5個病毒子；這兩個多孔板均用[w/v]酶 水解干酪素封閉。用多通道移液器將稀釋好的噬菌體加入包被有人血清白蛋白的板中，室溫震蕩作 用2h ；用TBST緩沖液(TBS緩沖液中含0. 3% [ν/ν]的吐溫-20，pH 7. 5)洗板6次。在封阻液中以1 5，000的比例稀釋HRP標記的抗-Μ13抗體 (Pharmacia#27-9411-01)。每孔加入200 μ L稀釋抗體，室溫震蕩作用Ih,用TBST緩 沖液(TBS緩沖液中含0. 3 % [ν/ν]的吐溫-20，pH 7. 5)洗板6次，然后加入ABTS/ H2O2 (Sigma#A1888)底物溶液200 μ L，室溫作用40min，用酶標儀記錄405nm處的吸光值，實 驗重復三次，取其平均值；對照實驗組，不加入噬菌體，其他同陽性實驗組，以測定底物背景 吸光值。經(jīng)統(tǒng)計學處理，表1為陽性實驗組和空白對照組在405nm處各空的吸光值；圖1顯 示了含有親和結(jié)合7-mer肽(其氨基酸序列為WQRPSSW)的噬菌體與與人血清白蛋白的親 和力曲線，實驗結(jié)果顯示，所淘選到的7-mer肽與人血清白蛋白具有較高的親和力。表1利用酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)檢測所選7-mer肽與人血清白蛋白的親和作用
\噬菌體
\ 數(shù)量 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
樣品\
OD405nm\
陽性實驗組0.1120.1530.1900.2530.2810.3270.3950.6091.1601.5111.8921.930空白對照組0.0510.0480.0520.0520.0500.0490.0480.0460.0490.0480.0500.046注1表中數(shù)字1，2，3......12表示4倍系列稀釋后依次升高的噬菌體數(shù)目.如1
表示 2. 4X105，12 表示 IO12.2實驗重復3次.表中數(shù)值為3次的平均值.實施例3 重組VPAC2型受體特異激動劑MHDBAY的制備 高穩(wěn)定性VPAC2型受體特異激動劑MHDBAY的制備過程如圖2所示，具體步驟如 下
(1) MHDBAY編碼序列的獲得按照大腸桿菌的密碼偏好性設(shè)計編碼MHDBAY的cDNA，設(shè)計3條引物，采用兩步法獲得該序列(如圖2所示)引物Fl:5' -GGT GGT CAT ATG TGG CAG CGC CCG AGC AGC TGG ATT GAA GGT CGC TTT CCGCAT AGC GAT-3'；引物F2:5' -CGC CAG CTG TTT ACG CAG ACG GGT ATA CTG ATC GGT AAA CAC CGC ATC GCTATG CGG AAA-3'；引物F3:5' -CCA CCA TGC TCT TCC GCA ATA ACG TTT CTG TTT A AT GCT CTG CAG ATA TTTTTT CGC CGC CAG CTG TTT-3，其中，GGTGGT 或 CCA CCA 為保護堿基,CATATG 為 NdeI 酶切位點，TGC TCTTCC GCA 為SapI酶切位點；①鏈延伸反應反應體系為引物FK250yM/L)2y L，弓丨物 F2 Q50 μ M/L) 2 μ L， 10 X iTaKaRaBuffer (含有 4mmol/L MgCl2) 2 μ L, dNTP 2 μ L, H2O 11. 5 μ L，TaKaRa Taq 酶 0. 5μ L ；反應條件為94°C，IOmin；降至 58°C 5min ；72°C IOmin ；得到延伸反應液。②PCR 反應反應體系為以延伸反應液為DNA模板，引物Fl (25 μ M/L) 2 μ L，F(xiàn)3 (25 μ M/ L) 2 μ L，延伸反應液 1· 5 μ L，dNTP 2 μ L，10XTaKaRa Ex Buffer 2 μ L, TaKaRa Taq 酶 0. 5μ L, H2O 10μ L ；反應條件為94°C 5min ；94 °C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 30s，30 個循環(huán)；72 °C 延伸 IOmin ；得到長度為162bp的PCR產(chǎn)物(2)構(gòu)建重組載體pKY-MHDBAY，如圖3所示用NdeI和SapI進行酶切步驟(1)得到的PCR產(chǎn)物，利用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進 行純化(根據(jù)說明書進行操作)。純化后的PCR產(chǎn)物先進行LguI (SapI的同功酶，F(xiàn)ermatas 產(chǎn)品)單酶切，酶切條件為在IXTango buffer反應體系中，1 μ g PCR產(chǎn)物加入15unit LguI (3 μ L), 37°C酶切4h ；LguI單酶切完成后，加入適量體積的10 X Tango buffer,使得 反應體系成為 2 X Tango buffer 體系，加入 20unit NdeI (2 μ L, !^ermatas 產(chǎn)品)，37°C酶 切4h ；質(zhì)粒pKYB(New England Biolabs(NEB)公司)的雙酶切=LguI (SapI 的同功酶)和 NdeI的雙酶切條件同上。將雙酶切后的MHDBAY基因和雙酶切后的質(zhì)粒pKYB連接，連接體系和連接時間、大 腸桿菌DH5ci (購自大連寶生物公司)感受態(tài)細胞的制作、轉(zhuǎn)化以及篩選(卡那霉素)，根據(jù) 《分子克隆》進行操作。將MHDBAY基因克隆到質(zhì)粒pKYB的NdeI和SapI位點間，得到重組載體 pKY-MHDBAY。(3)表達和純化①將重組質(zhì)粒pKY-MHDBAY 轉(zhuǎn)化表達宿主菌 E. coli Strain ER2566 (NewEngland Biolabs (NEB)公司)，得到表達工程菌pKY_MHDBAY/ER2566 ；挑取單克隆于5mL含50 μ g/mL 卡那霉素的Luria-Bertani (broth)培養(yǎng)基(簡稱LB培養(yǎng)基)，搖菌培養(yǎng)過夜，再擴大，以體 積比為1 100的比例接于IL含50mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基，37°C搖菌至OD6tltl為0. 6， 加入異丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG))至終濃度0. 6mmol/L，37°C誘導表達6h。8000rpm 離心 20min 收集菌體，將菌體重懸于60mL Buffer A溶液(20mM Tris-HCl, 500mM NaCI, ImM EDTA, pH 8.0)中，然后用低溫超高壓連續(xù)流細胞破碎儀進行破碎，破碎條件為=BufferA溶 液稀釋菌體的濃度為18% (m/v)，破碎壓力為1700bar，制冷溫度為3°C。破碎產(chǎn)物在4°C，IOOOOrpm離心30min，收集上清，該上清稱為破碎上清。SDS-PAGE 檢測融合蛋白Intein-CBD-MHDBAY的表達，鑒定結(jié)果如圖4所示。取25mL幾丁質(zhì)珠(NEB公司產(chǎn)品#S6651L)裝填4. 5X20cm層析柱，以10倍柱體 積的BufferA溶液洗柱；破碎上清以0. 5mL/min的流速上注；用10倍柱體積的Buffer A溶 液以2mL/min過柱，以洗去雜蛋白或未親和結(jié)合的融合蛋白，用80mL Buffer B溶液(20mM Tris-HCI,0. 5M NaCl，ImM EDTA，50mM β -巰基乙醇，pH 8.0)自然過柱，使β-巰基乙醇均 勻分布并浸泡柱內(nèi)填料，然后封閉進、出口端，上述反應體系在16°C反應Mh，以誘導蛋白 內(nèi)含肽的N端切割，釋放目的多肽C端硫酯。用Buffer A溶液洗脫并用潔凈的燒杯收集 目的多肽溶液C端硫酯，4°C透析過夜除去β -巰基乙醇并使目的多肽C端硫酯水解，再經(jīng) 高效液相色譜(HPLC)純化、制備得到純度為質(zhì)量百分比95%以上的VPAC2型受體特異激 動劑MHDBAY，目的多肽的制備條件為流動相A[在體積百分比10%乙腈(CNCH3，溶質(zhì)為純 水)中添加三氟乙酸(TFA)得到，TFA的終濃度為體積百分比0. 1% ]，流動相Β[100%乙腈 (CNCH3)中添加三氟乙酸(TFA)，TFA的終濃度為體積百分比0. 1% ]，流速lmL/min, 20min 線性梯度洗脫，線性梯度洗脫中流動相B由0 60% (ν/ν)，收集目的多肽洗脫峰，光吸收 檢測波長為218nm。目的多肽MHDBAY的純度通過分析性HPLC測定(條件同目的多肽的制 備條件)。制備的高穩(wěn)定性VPAC2型受體特異激動劑MHDBAY利用質(zhì)譜技術(shù)鑒定(如圖5所 示)，質(zhì)譜檢測分子量為5M4. 2kDa.，與其理論值相符合。實施例4重組肽MHDBAY (即實施例3制備的MHDBAY)的體外穩(wěn)定性測定 重組肽MHDBAY、化學合成MHDBAY (與重組肽MHDBAY相比，其N端無甲硫氨酸)和 BAY55-9837 (Tocris Bioscience 公司產(chǎn)品 #2711)以終濃度 lmg/ml 分別溶解在 2OmM 磷 酸鈉緩沖液(PH 8.0，含150mM氯化鈉)，37°C水浴鍋中孵育，在不同的時間點取樣，利用液 相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MQ檢測多肽在水溶液環(huán)境中隨時間的存留量，以確定重組 肽MHDBAY在體外水溶液環(huán)境中的穩(wěn)定性，結(jié)果如圖6所示孵育1周時，BAY55-9837消 減33. 7%，孵育2周時，BAY55-9837消減73. 9%，孵育3周和4周時，BAY55-9837分別消 減86. 5%和95. 9% ；化學合成MHDBAY多肽在孵育2周時，消減23. 2%，孵育4周時，消減 48. 0% ；而重組肽MHDBAY在孵育2周時，僅消減2. 1 %，孵育4周時，僅消減6. 7%。實驗結(jié) 果統(tǒng)計學處理表明，重組肽MHDBAY的體外穩(wěn)定性比BAY55-9837提高約25倍，比化學合成 MHDBAY多肽提高約8倍。
實施例5重組肽MHDBAY對VPAC2受體的競爭性結(jié)合活性測定用200 μ L PBS (ΡΗ7. 4)溶解重組肽 MHDBAY 至終濃度分別為 10 μ Μ、1 μ M、0. 1 μ Μ、 0. 01 μ Μ、0. 001 μ Μ、0· 0001 μ Μ、0· 00001 μ M置冰上冷卻20min,保持樣品在冰上，然后加入 IOunit凝血因子)(a酶/ (每毫克重組肽MHDBAY)和Ing人源二肽基肽酶(DPPIV) / (1 μ M重 組肽MHDBAY)，37°C水浴中反應Mh，以釋放活性多肽MBAY(作用于VPAC2受體)。然后加 入 Rivaroxaban (Toronto Research Chemicals，Inc 公司產(chǎn)品 #2711L28828775)禾Π DPP-IV inhibitor (Linco, St. Charles, M0)均至終濃度為50 μ M以終止酶切反應。VPAC2-CH0細胞Qnvitrogen公司)接種至12孔板上培養(yǎng)，實驗前2h，用0. 5mL無 血清Ham’ s F-12培養(yǎng)基洗滌細胞兩次。然后，細胞用含2% (mg/ml)牛血清白蛋白(BSA) 和IOmM葡萄糖的Ham，s F-12培養(yǎng)液4°C培養(yǎng)過夜，培養(yǎng)液中加入0. InM[125I]PACAP38和 待測多肽(即為BAY55-9837或不同濃度組重組肽MHDBAY的雙酶切反應液)，并逐步提高 待測多肽濃度(10_nM I(TM)。培養(yǎng)完畢后，棄掉上清液，用冰冷PBS (0. 01Μ，ρΗ值為7. 4) 洗細胞3次，細胞在室溫下用0. 5mL 0. 5M NaOH和0. 1 % (mg/ml) SDS混合lOmin，然后用 Y計數(shù)法測定細胞裂解物放射量，計算重組肽MHDBAY或BAY55-9837的半抑制量(IC50， half-maximal inhibitory concentration),每組實驗重復 3 次。實驗結(jié)果如圖7，BAY55-9837對VPAC2受體的半抑制量IC50為68. 3 士8. InM ；重 組肽MHDBAY釋放多肽MBAY的對VPAC2受體的半抑制量IC50為49. 8士7. 5nM ；結(jié)果表明， 重組肽MHDBAY對VPAC2受體的競爭性結(jié)合活性高于VPAC2受體特異激動劑BAY55-9837。實施例6重組肽MHDBAY釋放多肽MBAY促進VPAC2-CH0細胞cAMP生成的活性測定取對數(shù)生長期的VPAC2-CH0細胞，PBS (0. 01M，pH值為7. 4)洗2次，調(diào)整細胞懸液 濃度為ι χ lOVmL,分別加入相同濃度的多肽MBAY或BAY55-9837 (Tocris Bioscience公司 產(chǎn)品#2711)，調(diào)節(jié)多肽的濃度至KT11M 10_6M，37°C溫育20min。再將分別被多肽MBAY和 BAY55-9837作用過的各100 μ L細胞懸浮液與200 μ L 0. 2Μ HCl溶液，室溫放置20min，tip 頭吹打溶解細胞并混勻，1500g離心lOmin，吸取上清按Cyclic AMP Enzyme Immunoassay Kit說明測定cAMP的量。實驗結(jié)果如圖8，BAY55-9837對VPAC2受體的半激活濃度EC50 (half-maximal stimulatory concentration)為 1. 10士0. 23nM ；多肽 MBAY 對 VPAC2 受體的半激活濃度 EC50為0. 70 士 0. 15nM ；結(jié)果表明，多肽MBAY對VPAC2受體的選擇性激活活性明顯高于 BAY55-9837o實施例7重組多肽MHDBAY對正常ICR小鼠口服葡萄糖耐量影響的檢測正常雄性ICR小鼠(購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證編號 SCXK[京]2002-0003)按體重均分為4組，正常對照組、BAY55-9837組(0. 5mg/kg)、重組 肽MHDBAY組(0. 5mg/kg)。動物禁食過夜(1 )，取空腹血(Omin)后，靜脈注射給藥，正常 對照組靜脈注射生理鹽水，分別于給藥后15min灌胃給予葡萄糖溶液Og/kg)，并在給糖后 30min、60min及120min時取血測定血糖值。實驗結(jié)果如圖9所示重組肽MHDBAY給藥15min后，可顯著降低正常小鼠葡萄糖負荷后30min、60min及120min血糖水平(ρ < 0. 05)，曲線下面積顯著降低；ΒΑΥ55-9837 也可降低正常小鼠葡萄糖負荷后30min血糖，但不能降低正常小鼠葡萄糖負荷后60min及 120min血糖水平。實驗結(jié)果表明，重組肽MHDBAY可明顯降低葡萄糖依賴的血糖水平，效果 明顯優(yōu)于BATO5-9837。 上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種高穩(wěn)定性VPAC2型受體特異激動劑MHDBAY，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高穩(wěn)定性VPAC2型受體特異激動劑MHDBAY，其特征在于其編 碼核苷酸序列如SEQ ID :N0. 2所示。
3.權(quán)利要求1所述高穩(wěn)定性VPAC2型受體特異激動劑MHDBAY的制備方法，其特征在于 包括以下步驟(1)設(shè)計并合成MHDBAY基因采用3條引物兩步法合成MHDBAY基因引物Fl 5' -GGT GGT CAT ATG TGG CAG CGC CCG AGC AGC TGG ATT GAA GGT CGC TTT CCGCAT AGC GAT-3'；引物F2 5' -CGC CAG CTG TTT ACG CAG ACG GGT ATA CTG ATC GGT AAA CAC CGC ATC GCTATG CGG AAA-3'；引物F3 5，-CCA CCA TGC TCT TCC GCA ATA ACG TTT CTG TTT A AT GCT CTG CAG ATA TTTTTT CGC CGC CAG CTG TTT-3'其中，GGT GGT或CCA CCA為保護堿基，CATATG為NdeI酶切位點，TGC TCTTCC GCA為 SapI酶切位點；首先將引物Fl和引物F2進行鏈延伸反應，然后以其產(chǎn)物為DNA模板，以Fl和F3為引 物，PCR反應制得MHDBAY基因；(2)構(gòu)建重組載體pKY-MHDBAY用Ndel酶和Sapl酶分別對質(zhì)粒pKYB和步驟(1)制得的MHDBAY基因進行雙酶切，再 將雙酶切后的MHDBAY基因和雙酶切后的質(zhì)粒pKYB連接，得到重組載體pKY-MHDBAY ；(3)制備表達工程菌pKY-MHDBAY/ER2566用重組載體pKY-MHDBAY轉(zhuǎn)化表達表達大腸桿菌(Escherichia coli) ER2566，得到表 達工程菌 pKY-MHDBAY/ER2566 ；(4)表達和純化①誘導表達工程菌PKY-MHDBAY/ER2566表達由目的多肽、蛋白內(nèi)含肽和幾丁質(zhì)結(jié)合域 組成的“三元”融合蛋白；②得到的“三元”融合蛋白用幾丁質(zhì)柱進行純化，“三元”融合蛋白吸附于幾丁質(zhì)柱中， 然后含有硫醇的溶液過柱并充滿幾丁質(zhì)柱環(huán)境中，誘導蛋白內(nèi)含肽的N端切割反應；接著 洗脫幾丁質(zhì)柱，得到目的多肽C端硫酯；透析目的多肽C端硫酯，得到穩(wěn)定的水解產(chǎn)物；③利用高效液相色譜技術(shù)純化目的多肽，得到高穩(wěn)定性VPAC2型受體特異激動劑 MHDBAY。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于步驟(1)中所述鏈延伸反應的條件 為 94°C，IOmin ；降至 58°C 5min ；72°C IOmin0
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于步驟⑴中所述PCR反應的條件為 反應條件為95°C 5min ；95°C lmin，55°C lmin，72°C lmin，30 個循環(huán)；72°C延伸 lOmin。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于步驟(4)②中所述含有硫醇的溶液的組成如下20mM Tris-HCI,0. 5M NaCl, ImM EDTA, 50πιΜβ-巰基乙醇，pH 8.0 ；步驟(4)②中所述反應的條件為16°C反應M小時；步驟⑷②中所述洗脫幾丁質(zhì)柱的溶液的組成如下20mM Tris-HCl,500mMNaCI,lmM EDTA, pH 8· 0。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于步驟(4)③中所述利用高效液相色譜技術(shù)純化目的多肽的步驟如下Α、流動相A為在體積百分比10%乙腈中添加三氟乙酸得到，TFA的終濃度為體積百分 比0. ；流動相B為100%乙腈中添加三氟乙酸，TFA的終濃度為體積百分比0. 1% ；流速 lmL/min, 20min線性梯度洗脫；B、線性梯度洗脫中流動相B由體積百分比0 60%，收集目的多肽洗脫峰，光吸收檢測 波長為218nm。
8.權(quán)利要求1所述的高穩(wěn)定性VPAC2型受體特異激動劑MHDBAY應用于制備治療如下 疾病的藥物糖尿病及其并發(fā)癥、高血糖癥、高血壓、血栓癥、肥胖癥、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng) 疾病、心臟衰竭或腎衰竭。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高穩(wěn)定性重組VPAC2型受體特異激動劑MHDBAY及其制備方法與應用。該重組激動劑MHDBAY與現(xiàn)有VPAC2型受體特異激動劑相比，在血液中具有更高的穩(wěn)定性和生理活性，通過關(guān)鍵氨基酸突變，顯著提高了其對VPAC2型受體的特異激活活性。該重組激動劑MHDBAY的體外穩(wěn)定性比BAY55-9837提高約25倍，比化學合成MHDBAY多肽提高約8倍。通過實驗證明，該重組激動劑MHDBAY對VPAC2型受體的選擇性激活活性明顯高于BAY55-9837。該重組激動劑MHDBAY可應用于制備具有如下功能的藥物治療糖尿病及其并發(fā)癥，治療高血糖癥，治療高血壓，治療血栓癥，治療肥胖癥、心血管疾病等。
文檔編號A61P9/12GK102060921SQ20101056605
公開日2011年5月18日 申請日期2010年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月30日
發(fā)明者洪岸, 馬義 申請人:暨南大學