專利名稱：一種多價(jià)免疫刺激納米制劑及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種多價(jià)免疫刺激納米制劑及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
CpG DNA是ー類具有免疫激活功能的以未甲基化的CpG基序?yàn)楹诵牡腄NA序列，它包括含CpG基序的人工合成的寡聚脫氧核苷酸(oligodeoxynucleotides,此時(shí)簡(jiǎn)稱為CpG0DN)和自然界中細(xì)菌、病毒、無(wú)脊椎動(dòng)物等低等生物的基因組DNA。其中，CpG基序(CpGmotifs)是指ー類以非甲基化的胞嘧啶和鳥(niǎo)嘌呤核苷酸為核心的寡聚脫氧核糖核苷酸。CpG DNA是首先在卡介苗(BCG)提取液中發(fā)現(xiàn)的，它可以刺激多種免疫細(xì)胞的活化或増殖，產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，具有強(qiáng)烈的免疫激活功能。CpGDNA在細(xì)菌、病毒基因組中的出現(xiàn)頻率遠(yuǎn)高于在脊椎動(dòng)物中的出現(xiàn)頻率，相應(yīng)地，脊椎動(dòng)物的80%胞嘧啶的第五位碳原子是甲基化的。這種顯著的差異使脊椎動(dòng)物可以識(shí)別入侵的細(xì)菌及病毒，CpG基序成為人等哺乳動(dòng)物免疫刺激信號(hào)的基礎(chǔ)。人工合成的含有CpG基序的DNA序列(CpG 0DN)可以完全模仿細(xì)菌DNA的刺激性作用，具有激活多種免疫細(xì)胞，誘生多種細(xì)胞因子的作用，尤其可用于調(diào)節(jié)例如免疫應(yīng)答向Thl型轉(zhuǎn)換等免疫學(xué)效應(yīng)。另外，CpG ODN可作為具有治療性作用的DNA，在抗感染免疫、癌癥治療、過(guò)敏性疾病以及免疫佐劑等領(lǐng)域具有巨大的潛在應(yīng)用前景。但是,未經(jīng)過(guò)修飾的CpG ODN易降解、攝取率低、需要高劑量重復(fù)給藥,極大地限制了它在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用?，F(xiàn)有的應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)的CpG ODN主要是DNA骨架經(jīng)過(guò)硫代修飾的硫代磷酸酯骨架，簡(jiǎn)稱為S-CpG ODN0研究表明，通過(guò)硫代方法修飾的CpG ODN藥物存在明顯的毒副作用，重復(fù)注射高劑量硫代CpG ODN會(huì)引發(fā)機(jī)體急性毒性，引起劑量依賴性脾腫大、導(dǎo)致腎損傷并造成其它與過(guò)度激活免疫相關(guān)的毒性表現(xiàn)甚至死亡。在此基礎(chǔ)上，申請(qǐng)人利用巰基修飾CpG 0DN,從而將CpG ODN偶聯(lián)到納米金粒子表面，穩(wěn)定地形成自組裝納米結(jié)構(gòu)載體，此時(shí)，該自組裝結(jié)構(gòu)又被稱為CpG ODN-SH-納米金復(fù)合物。該CpG ODN-SH-納米金復(fù)合物具有很低的細(xì)胞毒性并在細(xì)胞內(nèi)具有很好的穩(wěn)定性，另外，該CpG ODN-SH-納米金復(fù)合物還具有良好的生物相容性和高效載運(yùn)特性。該工作已發(fā)表在暑名期干1J Angew. Chem.1nt. Ecl.上(Polyvalent Immunostimulatory Nanoagentswitn Self-Assembled CpG Oligonucleotide-Conjugated Gold Nanoparticles. MinWei, Nan Chen，Jiang Li，Min Yin, Le Liang, Yao He, Haiyun Song, Chunhai Fan, and QingHuang, Angew. Chem.1nt. Ed2012，51，5 :1202-1206)。但是，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)，對(duì) CpG ODN 進(jìn)行巰 基修飾需要耗費(fèi)大量的成本，而且，所形成的CpG ODN-SH-納米金復(fù)合物在低劑量下的免疫刺激效果非常有限
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中的未經(jīng)修飾的CpG ODN易降解、攝取率低和需要高劑量重復(fù)給藥，而修飾的CpG ODN具有各種副作用以及低劑量下免疫刺激效果低等問(wèn)題。本發(fā)明提供一種多價(jià)免疫刺激納米制劑的制備方法，包括(I)提供納米金水溶液；(2)利用多聚腺苷酸修飾CpG ODN的3’端得到CpG ODN-polyA ;以及(3)將所述CpGODN-polyA組裝到所述納米金上形成所述多價(jià)免疫刺激納米制劑。該制備方法簡(jiǎn)便快速、原料易得、成本較低且可重復(fù)性高。在所述步驟(I)中，通過(guò)檸檬酸三鈉水溶液還原氯金酸得到所述納米金水溶液。 該還原方法操作簡(jiǎn)便，エ藝成熟。雖然在實(shí)施例中僅給出了 15nm的納米金水溶液的制備步驟，但是通過(guò)調(diào)節(jié)反應(yīng)的條件，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)實(shí)際得到各種粒徑的納米金。所述步驟(3)進(jìn)ー步包括(3.1)將所述納米金水溶液和所述CpG ODN-polyA混合均勻并震蕩反應(yīng)；(3. 2)分批加入磷酸鹽緩沖液，分離得到所述多價(jià)免疫刺激納米制劑。磷酸鹽緩沖液采用分批加入的原因是可以防止由于鹽濃度的驟然增高而導(dǎo)致的納米金的聚集，從而使得CpG ODN-polyA更為有效地結(jié)合到納米金表面。在所述步驟(3.1)之前，步驟(3)進(jìn)ー步包括濃縮所述納米金水溶液。實(shí)驗(yàn)證明，高濃度的納米金水溶液更有利于組裝到所述CpG ODN-polyA表面。通過(guò)上述濃縮步驟,所述納米金與所述CpG ODN-polyA的終濃度優(yōu)選比值為IOnM 3 u M。應(yīng)該理解，雖然實(shí)施例中僅給出了該具體的比例值，但是，其他終濃度比例的納米金和CpG ODN-polyA同樣能夠發(fā)生結(jié)合，只要CpG ODN序列上存在多聚腺苷酸polyA即可。在所述步驟(3. 2)中，所述分離操作包括利用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗滌和重懸。該具體的分離操作主要用于洗滌除去沒(méi)有組裝到納米金表面的CpG ODN-polyA，消除其它干擾因素。所述CpG ODN-polyA 的序列選自 SEQ ID NO.1、SEQ ID NO. 2 或 SEQ ID NO. 3。所述CpG ODN-polyA在其5’端進(jìn)行FAM標(biāo)記或Cy5標(biāo)記。本發(fā)明提供ー種上述制備方法所獲得的多價(jià)免疫刺激納米制劑，所述多價(jià)免疫刺激納米制劑為polyA tailed CpG ODN-納米金復(fù)合物。該polyA tailed CpG ODN-納米金復(fù)合物的免疫刺激活性及材料穩(wěn)定性與傳統(tǒng)的巰基修飾的CpG-納米金復(fù)合物相當(dāng)，但價(jià)格更為低廉。本發(fā)明還提供ー種上述多價(jià)免疫刺激納米制劑在免疫刺激上的應(yīng)用。所述polyA tailed CpG 0DN-納米金復(fù)合物的濃度為5_25nM。通過(guò)透射電子顯微鏡TEM觀察polyA tailed CpG ODN-納米金復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞后在細(xì)胞內(nèi)的位置，以及通過(guò)氯喹抑制其受體TLR-9確定復(fù)合物的細(xì)胞通路。結(jié)果表明，本發(fā)明的多價(jià)免疫刺激納米制劑進(jìn)入細(xì)胞后主要位于內(nèi)吞小體內(nèi)，且該多價(jià)免疫刺激納米制劑與傳統(tǒng)CpG DNA細(xì)胞通路一致，均是通過(guò)其受體TLR-9起作用的。本發(fā)明提供的polyAtailed CpG ODN-納米金復(fù)合物分別刺激RAW264. 7細(xì)胞8h、24h，取細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行細(xì)胞因子TNF-a (8h)、IL-6/IL-12 (24h)的ELISA檢測(cè)。結(jié)果表明，本發(fā)明的多價(jià)免疫刺激納米制劑可以顯著提高細(xì)胞水平的免疫刺激活性，活性的提高在低濃度時(shí)尤為明顯。通過(guò)將本發(fā)明提供的polyA tailed CpG ODN-納米金復(fù)合物通過(guò)尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)，3h后取血清進(jìn)行ELISA檢測(cè)。結(jié)果表明，與傳統(tǒng)未經(jīng)修飾的CpG DNA相比，本發(fā)明的多價(jià)免疫刺激納米制劑可以提高CpG的體內(nèi)免疫刺激活性。
總之，本發(fā)明提供的多價(jià)免疫刺激納米制劑與傳統(tǒng)的CpG ODN相比，具有很高的穩(wěn)定性，對(duì)細(xì)胞活力沒(méi)有影響，細(xì)胞攝取率高，給藥劑量低，免疫刺激活性好，在低劑量時(shí)效果尤為關(guān)出。


圖1A是通過(guò)透射電子顯微鏡TEM表征所獲得的納米金的照片；圖1B是通過(guò)透射電子顯微鏡TEM表征所獲得的根據(jù)本發(fā)明的納米金復(fù)合物的照片;圖2是通過(guò)熒光分光光度計(jì)所獲得的CpG ODN濃度的數(shù)據(jù)分析圖，其中，橫坐標(biāo)CpG-SH 表示 CpG ODN -SH ;CpG_A5 表示 CpG 0DN-polyA5 ；CpG-A 10 表示 CpG ODN-polyA 10 ；CpG-A 15表示CpG ODN-polyA 15 ;縱坐標(biāo)表示姆個(gè)納米金粒子表面的CpG ODN的條數(shù)；圖3A是通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射粒子分析儀所獲得的CpG ODN-SH與納米金組裝形成的復(fù)合物對(duì)應(yīng)的譜圖；圖3B是通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射粒子分析儀所獲得的CpG 0DN-polyA5與納米金組裝形成的復(fù)合物對(duì)應(yīng)的譜圖；圖3C是通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射粒子分析儀所獲得的CpG ODN-poIyA 10與納米金組裝形成的復(fù)合物對(duì)應(yīng)的譜圖；圖3D是通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射粒子分析儀所獲得的CpG ODN-poIyA15與納米金組裝形成的復(fù)合物對(duì)應(yīng)的譜圖；圖4是通過(guò)噻唑藍(lán)(MTT)細(xì)胞活力檢測(cè)方法所獲得的polyA tailed CpG ODN-納米金復(fù)合物細(xì)胞活力的數(shù)據(jù)分析圖，其中，CpG-A5-AuNPs表示polyA5tailed CpG ODN-納米金復(fù)合物；CpG-A15_AuNPs表示polyA15tailed CpG ODN-納米金復(fù)合物；橫坐標(biāo)表示復(fù)合物的濃度；縱坐標(biāo)表示細(xì)胞活力；圖5是通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)所獲得的納米金復(fù)合物的細(xì)胞攝取圖，其中，空白對(duì)照組表示的是序列為 Cy5-CpG-poly A5，其序列為 SEQ ID NO. 9 Cy5-TCCATGACGTTCCTGACGTTTTTTTAAAAA ；Cy5-CpG-A5-AuNPs 表示 Cy5 修飾的 polyA5tailed CpG ODN-納米金復(fù)合物；圖6A是細(xì)胞攝取Cy5-ssCpG ODN的細(xì)胞亮場(chǎng)視野圖；圖6B是細(xì)胞攝取Cy5-CpG-A5-AuNPs的細(xì)胞亮場(chǎng)視野圖；圖6C是細(xì)胞攝取Cy5-ssCpG ODN的細(xì)胞熒光圖片，單鏈ODN由于難以進(jìn)入細(xì)胞，所以沒(méi)有觀察到熒光；圖6D是細(xì)胞攝取Cy5-CpG-A5_AuNPs的細(xì)胞的熒光圖片，可見(jiàn)Cy5-CpG-A5_AuNPs大量攝??；圖7A表示polyA15tailed CpG ODN-納米金復(fù)合物與硫代CpG在不同溶度下的TNF-a細(xì)胞因子分泌水平對(duì)比，其中，S-CpG表示硫代CpG 0DN,其指的是CpG 0DN1826對(duì)應(yīng)的硫代磷酸酯骨架；CpG-A15-AuNPs表示polyA15tailed CpG ODN-納米金復(fù)合物；圖7B表不polyA15tailed CpG 0DN-納米金復(fù)合物、CpG 0DN-SH-納米金復(fù)合物、硫代CpG在不同溶度下的TNF-a細(xì)胞因子分泌水平對(duì)比，其中，S-CpG ODN表示CpG 0DN1826對(duì)應(yīng)的硫代磷酸酯骨架；CpG-SH-AuNPs表示CpG ODN-SH-納米金復(fù)合物；CpG-A15_AuNPs表7]\ polyA15tailed CpG 0DN-納米金復(fù)合物；
圖7C表不polyA5tailed CpG ODN-納米金復(fù)合物、polyAlOtailed CpG ODN-納米金復(fù)合物、polyA15tailed CpG ODN-納米金復(fù)合物在不同溶度下的IL-6細(xì)胞因子分泌水平對(duì)比，其中，CpG-A5-AuNPs 表示 polyA5tailed CpG ODN-納米金復(fù)合物；CpG_A10_AuNPs表不 polyAlOtailed CpG ODN-納米金復(fù)合物；CpG_A15_AuNPs 表不 polyA15tailed CpGODN-納米金復(fù)合物；圖7D表不polyA5tailed CpG ODN-納米金復(fù)合物、polyAlOtailed CpG 0DN-納米金復(fù)合物、polyA15tailed CpG ODN-納米金復(fù)合物在不同溶度下的IL-12細(xì)胞因子分泌水平對(duì)比，其中，CpG-A5-AuNPs 表示 polyA5tailed CpG ODN-納米金復(fù)合物；CpG_A10_AuNPs表不 polyAlOtailed CpG 0DN-納米金復(fù)合物；CpG_A15_AuNPs 表不 polyA15tailed CpGODN-納米金復(fù)合物；圖8A表示磷酸緩沖液、納米金、指3’端修飾有5個(gè)腺苷酸的非CpG 0DN、單鏈CpG 0DN、polyA5tailed CpG ODN-納米金復(fù)合物、CpG 0DN-SH-納米金復(fù)合 物、硫代CpGODN的IL-12細(xì)胞因子分泌水平對(duì)比，其中，PBS表示磷酸緩沖液；AuNPs表示納米金；Non-CpG-A5-Au表示3’端修飾有5個(gè)腺苷酸的非CpG ODN ；ssCpG ODN表示單鏈CpG ODN ；CpG_A5_Au 表不 polyA5tailed CpG ODN-納米金復(fù)合物；CpG_SH_Au 表不 CpG ODN-SH-納米金復(fù)合物；S-CpG ODN表示硫代CpG ODN ；圖8B表示磷酸緩沖液、納米金、指3’端修飾有5個(gè)腺苷酸的非CpG 0DN、單鏈CpG 0DN、polyA5tailed CpG ODN-納米金復(fù)合物、CpG 0DN-SH-納米金復(fù)合物、硫代CpGODN的MCP-1細(xì)胞因子分泌水平對(duì)比，其中，PBS表示磷酸緩沖液；AuNPs表示納米金；Non-CpG-A5-AuNPs表示3’端修飾有5個(gè)腺苷酸的非CpG ODN ；ssCpG ODN表示單鏈CpGODN ;CpG-A5-AuNPs 表示 polyA5tailed CpG ODN-納米金復(fù)合物；CpG_ (SH)-AuNPs 表示 CpGODN-SH-納米金復(fù)合物；S-CpG ODN表示硫代CpG ODN0
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖，給出本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并予以詳細(xì)描述，使能更好地理解本發(fā)明的功能、特點(diǎn)。在本文中，CpG DNA是指ー類具有免疫激活功能的以未甲基化的CpG基序?yàn)楹诵牡腄NA序列。CpG ODN是指ー類含CpG基序的人工合成的寡聚脫氧核苷酸。CpG ODN-SH是指3’端修飾有巰基的CpG ODN0CpG ODN-SH-納米金復(fù)合物是指CpG 0DN-SH與納米金組裝形成的復(fù)合物。CpG ODN-polyA是指ー類3’端修飾有多聚腺苷酸的CpG ODN0其中，CpGODN-po I yA5是指3’端修飾有5個(gè)腺苷酸的CpG ODN0 CpG ODN-po IyA 10是指3’端修飾有10個(gè)腺苷酸的CpG ODN0 CpG ODN-poIyA15是指3’端修飾有15個(gè)腺苷酸的CpG ODN0CpG ODN-polyA-納米金復(fù)合物是指CpG ODN-polyA與納米金組裝形成的復(fù)合物，同時(shí)也被稱為polyAtailed CpG ODN-納米金復(fù)合物。其中,polyA5tailed CpG ODN-納米金復(fù)合物是指CpG 0DN-polyA5與納米金組裝形成的復(fù)合物。polyAlOtailed CpG ODN-納米金復(fù)合物是指CpG 0DN-polyA10與納米金組裝形成的復(fù)合物。polyA15tailed CpG ODN-納米金復(fù)合物是指CpG ODN-poIyA15與納米金組裝形成的復(fù)合物。
FAM-CpG ODN是指ー類5’端修飾有熒光基團(tuán)FAM的CpG ODN0FAM-CpG ODN-polyA是指ー類5’端修飾有熒光基團(tuán)FAM，3’端修飾有多聚腺苷酸的CpG ODN0其中，F(xiàn)AM-CpG ODN-po I yA5是指5’端修飾有熒光基團(tuán)FAM，3’端修飾有5個(gè)腺苷酸的CpG ODN0 FAM-CpG ODN-poIyA 10是指5’端修飾有熒光基團(tuán)FAM，3’端修飾有10個(gè)腺苷酸的CpG ODN0 FAM-CpG 0DN_polyA15是指5’端修飾有熒光基團(tuán)FAM，3’端修飾有15個(gè)腺苷酸的CpG ODN。Cy5-CpG ODN-polyA是指ー類5’端修飾有熒光基團(tuán)Cy5，3’端修飾有多聚腺苷酸的CpG ODN0其中，Cy5-CpG ODN-po I yA5是指5’端修飾有熒光基團(tuán)Cy5，3’端修飾有5個(gè)腺苷酸的CpG ODN0 Cy5-CpG ODN-poIyA 10是指5’端修飾有熒光基團(tuán)Cy5，3’端修飾有10個(gè)腺苷酸的CpG ODN0 Cy5-CpG 0DN_polyA15是指5’端修飾有熒光基團(tuán)Cy5，3’端修飾有15個(gè)腺苷酸的CpG ODN。實(shí)施例1納米金的制備 試劑包括氯金酸購(gòu)自阿拉丁公司，分析純的檸檬酸三鈉購(gòu)自國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司。制備過(guò)程包括以下幾個(gè)步驟(I)取1%氯金酸HAuCl4溶液Iml和99ml的Mill1-Q水倒入干凈的蒸餾瓶?jī)?nèi)，制成0. 01%HAuC14工作溶液，加入攪拌子，置于磁力攪拌加熱器上加熱并攪拌；(2)待溶液完全沸騰后，將轉(zhuǎn)速調(diào)至30，并一次性快速加入3. 5ml新鮮配制的10mg/ml檸檬酸三鈉水溶液；(3)保持溶液沸騰且快速攪拌20min，停止加熱，繼續(xù)攪拌，冷卻；(4)老化過(guò)夜,用0. 22 ii m濾膜過(guò)濾,得到粒徑基本均一的15nm的納米金水溶液，
4°C保存。應(yīng)該理解，上述提供的納米金的制備方法是已知的，通過(guò)調(diào)節(jié)反應(yīng)的條件，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)實(shí)際需要調(diào)節(jié)最終的所獲得的納米金的粒徑。同樣，除了上述通過(guò)檸檬酸三鈉還原氯金酸的方法來(lái)獲得納米金之外，其他任何合適的能夠得到納米金的方法均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。實(shí)施例2納米金復(fù)合物的制備及表征試劑包括HPLC純化的CpG ODN合成自Invitrogen公司，分析純的氯化鈉、磷酸氫ニ鈉、磷酸ニ氫鈉購(gòu)自國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司。制備過(guò)程包括以下幾個(gè)步驟(I)取Iml納米金12000rpm4°C離心20min,棄去800 y I上清,沉淀重懸即得濃縮5倍的納米金溶液。(2)取Iml濃縮5倍的納米金于1. 5mL離心管中至終濃度10nM，加入100 u M CpGODN至終濃度3 ii M，輕輕吹打混合均勻，25°C 400rpm震蕩過(guò)夜。其中，該CpG ODN 是 CpG ODN-poIyA5 (其序列為 SEQ ID NO.1 TCCATGACGTTCCTGACGTTTTTTTAAAAA)、CpG ODN-poIyA 10 (其序列為 SEQ ID NO. 2 TCCATGACGTTCCTGACGTTTTTTTAAAAAAAAAA)或 CpG ODN-poIyA15 (其序列為 SEQ ID NO. 3 TCCATGACGTTCCTGACGTTTTT TTAAAAAAAAAAAAAAA)。不難看出，本實(shí)施例所利用的CpG ODN的DNA序列僅是簡(jiǎn)單地在CpG 0DN1826序列的3’端加上一段不同長(zhǎng)度的多聚腺苷酸polyA序列。為了便于后續(xù)的表征，該CpG ODN可以首先進(jìn)行熒光基團(tuán)FAM在其5’端進(jìn)行標(biāo)記，此時(shí)對(duì)應(yīng)的 CpG ODN 為 FAM-CpG ODN-po I yA5、FAM-CpG ODN-po IyA 10, FAM-CpG 0DN_polyA15。(3)緩慢加入IM磷酸鹽緩沖液PBS(1M NaCl/0.1M PB,pH7. 4)使其終濃度為0. 1M，PBS (分5 6次加入，大于30min/次間隔)，25°C 400rpm震蕩24h。(4) 13000rpm，4°C，20min 離心，棄上清，加入 500 U I 的 0.1M PBS，如此反復(fù)洗 3次，加入適量0.1M PBS重懸，4°C保存待用。通過(guò)透射電子顯微鏡TEM表征所獲得的納米金復(fù)合物可知，上述方法成功地將CpG ODN偶聯(lián)到納米金粒子表面從而形成納米金復(fù)合物，該納米金復(fù)合物又被稱為polyA tailed CpG ODN-納米金復(fù)合物 。具體的表征步驟包括將納米金和所形成的納米金復(fù)合物用1%磷鎢酸水溶液(PH7.0)染色，滴于銅網(wǎng)上烘干，然后利用TEM觀察(Jeol, JEM2010, 200KV)。結(jié)果如圖1所示，由于納米金本身是不會(huì)被染色的，裸露的納米金呈現(xiàn)出圖1A所示的視野；相反，由于納米金復(fù)合物表面包裹有DNA (CpG 0DN)，即CpG ODN偶聯(lián)到納米金粒子表面，則納米金復(fù)合物呈現(xiàn)出圖1B所示的染色后的界面。通過(guò)突光分光光度計(jì)可以對(duì)上述獲得的polyA tailed CpG ODN-納米金復(fù)合物進(jìn)行進(jìn)ー步表征。具體表征步驟包括將巰基こ醇加入FAM熒光標(biāo)記的CpG-納米金溶液中至終濃度20mM，震蕩孵育過(guò)夜，離心取上清后，用熒光分光光度計(jì)測(cè)定熒光強(qiáng)度，換算得到DNA的摩爾濃度。結(jié)果如圖2所示,不同polyA長(zhǎng)度的CpG序列(FAM-CpG ODN-po I yA5>FAM-CpG ODN-poIyAlO、FAM-CpG ODN-poIyAl5)及巰基修飾的 CpG 序列(CpG ODN-SH)組裝到納米金的數(shù)量，隨著polyA長(zhǎng)度的增加,姆個(gè)納米金粒子上組裝的CpG序列條數(shù)減少。另外，通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射粒子分析儀(BECKMAN COULTER, America)可以測(cè)定上述獲得的polyA tailed CpG ODN-納米金復(fù)合物的水合半徑及分散度，結(jié)果如圖3A-圖3D所示，其中，圖3A表示的是CpG ODN-SH與納米金組裝形成的復(fù)合物對(duì)應(yīng)的譜圖；圖3B表示的是CpG 0DN-polyA5與納米金組裝形成的復(fù)合物對(duì)應(yīng)的譜圖；圖3(表示的是CpG ODN-poIyA 10與納米金組裝形成的復(fù)合物對(duì)應(yīng)的譜圖；圖3D表示的是CpG 0DN-polyA15與納米金組裝形成的復(fù)合物對(duì)應(yīng)的譜圖；相關(guān)的數(shù)據(jù)歸納為下表1:表I
I平均粒徑大小(ran) I分散系數(shù)^
CpG ODN-SH-納米金復(fù)合物30. 00. 175
polyA5tailed CpG ODN- 納米金復(fù)合物35. 30. 304
polyAlOtailed CpG 0DN-納米金復(fù)合物35.90.292
polyA15tailed CpG 0DN-納米金復(fù)合物37.60.282由此可知，隨著polyA長(zhǎng)度增加，CpG ODN-納米金復(fù)合物的粒徑逐漸増大。而且，所形成的各組復(fù)合物的分散良好，呈單一分布峰。實(shí)施例3細(xì)胞活力及攝取率檢測(cè)
試劑包括Raw264. 7細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，噻唑藍(lán)(MTT)，十二烷基磺酸鈉(SDS)，Hoechst33258 購(gòu)自 Sigma-Aldrich 公司，Cy5 標(biāo)記的熒光修飾 CpGODN 購(gòu)自invitrogen 公 ロJMTT細(xì)胞活力檢測(cè)方法(I)前一日鋪板，24孔板每孔鋪2X105個(gè)細(xì)胞，37°C 5%C02培養(yǎng)過(guò)夜。(2) 500 ill PBS洗一次，將新鮮的含有5_25nM的CpG ODN-polyA-納米金的培養(yǎng)基加入各孔，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)(3)每孔加入50iil5mg/ml的MTT，37度孵育4小時(shí)后，會(huì)有藍(lán)紫色不溶甲瓚生成，此時(shí)每孔加入10%SDS (pH2-3) Iml溶解甲瓚，37度孵育過(guò)夜(4) 12000rpm，20min離心，取200iU上清至96孔板中，0D570nm處測(cè)吸光值(參考波長(zhǎng)633nm)(5)細(xì)胞存活率計(jì)算公式生存率=(實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)X 100%細(xì)胞攝取率檢測(cè)(I) Cy5熒光標(biāo)記的CpG ODN-po I yA5, CpG ODN-po IyA 15與納米金組裝，組裝方法與實(shí)施例2相同，形成polyA5tailed CpG 0DN-納米金復(fù)合物、polyA15tailed CpG 0DN-納米金復(fù)合物。(2)不同濃度polyA5tailed CpG 0DN-納米金復(fù)合物、polyA15tailed CpG 0DN-納米金復(fù)合物(5nM、10nM、25nM)分別加入預(yù)先鋪好的細(xì)胞中，37°C孵育4小時(shí)，分別進(jìn)行流式細(xì)胞儀及激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)。結(jié)果如圖4所示,縱坐標(biāo)表示MTT檢測(cè)polyA tailed CpG ODN-納米金復(fù)合物細(xì)胞活力，由此可以看出所測(cè)濃度(5-25nM)范圍內(nèi)，納米金復(fù)合物對(duì)細(xì)胞活力沒(méi)有影響，表現(xiàn)出良好的生物相容性。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)可以得到納米金復(fù)合物的細(xì)胞攝取圖，結(jié)果如圖5所示，由于單鏈CpG序列(CpG1826，其序列為SEQ ID NO. 4:TCCATGACGITCCTGACGIT)很難進(jìn)入細(xì)胞，所以幾乎沒(méi)有檢測(cè)到熒光；而polyA5tailed CpG ODN-納米金復(fù)合物可以進(jìn)入細(xì)胞，且檢測(cè)到的熒光呈現(xiàn)濃度依賴性變化，即隨著納米金復(fù)合物濃度的増大，熒光強(qiáng)度逐漸增加。另外,通過(guò)激光共聚焦顯微鏡可以檢測(cè)細(xì)胞對(duì)polyA5tailed CpG ODN-納米金復(fù)合物的攝取，結(jié)果如圖6A-圖6D所示，可以直觀從其看到細(xì)胞對(duì)polyA5tailed CpG ODN-納米金復(fù)合物的攝??；相對(duì)應(yīng)的，單鏈Cy5-CpG DNA很難進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有熒光。實(shí)施例4細(xì)胞水平免疫刺激檢測(cè)
試劑包括Raw264. 7細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，ELISA抗體及標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自eBioscience公司。實(shí)驗(yàn)方法如下(I)鋪24孔板，每孔2X105個(gè)Raw264. 7細(xì)胞，37°C過(guò)夜(2)新鮮培養(yǎng)基含有不同濃度的polyA-tailed CpG-納米金復(fù)合物加入各孔,37度孵育 8h (TNF-a ) 0r24h (IL-6, IL-12)(3) 8h、24h取細(xì)胞培養(yǎng)上清，進(jìn)行ELISA檢測(cè)。
結(jié)果如7A-圖7D所示，圖7A為polyA15tailed CpG ODN-納米金復(fù)合物與硫代CpG在不同溶度下的TNF-a分泌水平比較,可以看出，在5nM_25nM范圍內(nèi)，polyA15tailedCpG ODN-納米金復(fù)合物分泌TNF-a多于硫代CpG，且濃度越低，差異越明顯，說(shuō)明CpGODN-polyA-納米金具有低劑量高免疫刺激活性的特點(diǎn)。圖7B-圖7D分別檢測(cè)了不同polyA長(zhǎng)度的納米金復(fù)合物的TNF-a、IL-6、IL-12細(xì)胞因子的分泌，說(shuō)明polyA tailed CpGODN-納米金復(fù)合物具有明顯的免疫刺激活性，并且在CpG濃度相同的情況下，細(xì)胞因子的分泌量polyA15tailed CpG ODN-納米金復(fù)合物〉polyAlOtailed CpG 0DN-納米金復(fù)合物>polyA5tailed CpG 0DN-納米金復(fù)合物。實(shí)施例5動(dòng)物體內(nèi)免疫刺激測(cè)試試劑包括 ICR小鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司；IL_12細(xì)胞因子由上海森雄生物科技實(shí)業(yè)有限公司提供檢測(cè)；CBA試劑盒購(gòu)自BD公司實(shí)驗(yàn)方法如下(1)4-6周大的ICR小鼠飼養(yǎng)在無(wú)菌、恒溫的動(dòng)物房?jī)?nèi)，稱取體重大約20-25g時(shí)用
于實(shí)驗(yàn)。(2)將小鼠隨機(jī)分為7組，每組7只。(2)單鏈CpG DNA或不同修飾/組裝的CpG DNA均溶于PBS中，以PBS作為對(duì)照，通過(guò)尾靜脈注射注入小鼠體內(nèi)，注射劑量為60ii g/kg(0. lml/10g體重).(3)注射3小時(shí)后，將小鼠通過(guò)摘眼球放血的方法，取小鼠全血37°C靜置半小吋，3000rpm離心15分鐘后取血清_80度待測(cè)(4)血清IL-12及MCP-1含量通過(guò)ELISA/CBA試劑盒按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如圖8A和圖8B所示，通過(guò)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，取血清測(cè)得IL-12、MCP_1細(xì)胞因子的含量，說(shuō)明polyA tailed CpG ODN-納米金復(fù)合物在體內(nèi)也具有一定的免疫刺激活性。以上所述的，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非用以限定本發(fā)明的范圍。凡是依據(jù)本發(fā)明申請(qǐng)的權(quán)利要求書(shū)及說(shuō)明書(shū)內(nèi)容所作的簡(jiǎn)單、等效變化與修飾，皆落入本發(fā)明專利的權(quán)利要求保護(hù)范圍。本發(fā)明未詳盡描述的均為常規(guī)技術(shù)內(nèi)容。
權(quán)利要求
1.一種多價(jià)免疫刺激納米制劑的制備方法，其特征在于，包括 (1)提供納米金水溶液； (2)利用多聚腺苷酸修飾CpGODN的3’端得到CpG ODN-polyA ;以及(3)將所述CpGODN-polyA組裝到所述納米金上形成所述多價(jià)免疫刺激納米制劑。
2.如權(quán)利要求1所述的多價(jià)免疫刺激納米制劑的制備方法，其特征在于，在所述步驟(I)中，通過(guò)檸檬酸三鈉水溶液還原氯金酸得到所述納米金水溶液。
3.如權(quán)利要求1所述的多價(jià)免疫刺激納米制劑的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)進(jìn)一步包括 (3.1)將所述納米金水溶液和所述CpG ODN-polyA混合均勻并震蕩反應(yīng)； (3. 2)分批加入磷酸鹽緩沖液，分離得到所述多價(jià)免疫刺激納米制劑。
4.如權(quán)利要求3所述的多價(jià)免疫刺激納米制劑的制備方法，其特征在于，在所述步驟(3.1)之前，步驟(3)進(jìn)一步包括濃縮所述納米金水溶液。
5.如權(quán)利要求3所述的多價(jià)免疫刺激納米制劑的制備方法，其特征在于，在所述步驟(3. 2)中，所述分離操作包括利用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗滌和重懸。
6.如權(quán)利要求1所述的多價(jià)免疫刺激納米制劑的制備方法，其特征在于，所述CpGODN-polyA 的序列選自 SEQ ID NO.1、SEQ ID NO. 2 或 SEQ IDN0. 3。
7.如權(quán)利要求1所述的多價(jià)免疫刺激納米制劑的制備方法，其特征在于，所述CpGODN-polyA在其5’端進(jìn)行FAM標(biāo)記或Cy5標(biāo)記。
8.—種如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的制備方法所獲得的多價(jià)免疫刺激納米制劑，其特征在于，所述多價(jià)免疫刺激納米制劑為polyA tailed CpG ODN-納米金復(fù)合物。
9.一種如權(quán)利要求8所述的多價(jià)免疫刺激納米制劑在免疫刺激上的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求9所述的多價(jià)免疫刺激納米制劑在免疫刺激上的應(yīng)用，其特征在于，所述polyA tailed CpG ODN-納米金復(fù)合物的濃度為5_25nM。
全文摘要
本發(fā)明提供一種多價(jià)免疫刺激納米制劑的制備方法，包括(1)提供納米金水溶液；(2)利用多聚腺苷酸修飾CpG ODN的3’端得到CpGODN-polyA；以及(3)將所述CpG ODN-polyA組裝到所述納米金上形成所述多價(jià)免疫刺激納米制劑。本發(fā)明還提供一種通過(guò)該制備方法得到的多價(jià)免疫刺激納米制劑及其用途。該多價(jià)免疫刺激納米制劑與傳統(tǒng)的CpG ODN相比，具有很高的穩(wěn)定性，對(duì)細(xì)胞活力沒(méi)有影響，細(xì)胞攝取率高，給藥劑量低，免疫刺激活性好，在低劑量時(shí)效果尤為突出。
文檔編號(hào)A61P37/04GK103007294SQ201210586959
公開(kāi)日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月28日
發(fā)明者黃慶, 陳楠, 魏敏, 裴潔, 李凡, 孫艷紅, 李曉明, 樊春海 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所