專利名稱：用雞胚源細(xì)胞系繁殖傳染性法氏囊病毒制備滅活疫苗和聯(lián)苗的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及獸用生物物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用雞胚源細(xì)胞系繁殖傳染性法氏囊病毒制備滅活疫苗和聯(lián)苗的方法。
背景技術(shù)：
傳染性法氏囊病毒Qnfectious Bursal Disease Virus, IBDV)屬雙股 RNA 病毒科，雙股RNA病毒屬，是一種主要侵害3 12周齡的雛雞與青年雞的高度接觸性傳染病，該病原主要破壞雞的中樞免疫器官一法氏囊，造成機(jī)體的免疫抑制，導(dǎo)致感染雛雞死亡和對(duì) (其他)致病因子的感染性增加、對(duì)(其他)疫苗的免疫應(yīng)答能力下降，給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重的危害。目前，該病主要通過(guò)疫苗接種來(lái)防控。除給雛雞使用活疫苗免疫外，通常還給種雞注射滅活疫苗使雛雞獲得高的母源抗體，以保護(hù)其在生命早期不感染傳染性法氏囊病病我國(guó)目前傳染性法氏囊病滅活疫苗及其聯(lián)苗的生產(chǎn)主要采用傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶原代細(xì)胞培養(yǎng)病毒液。轉(zhuǎn)瓶原代細(xì)胞(成纖維細(xì)胞)培養(yǎng)法是培養(yǎng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)于玻璃培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)壁上，技術(shù)成熟穩(wěn)定，但培養(yǎng)病毒滴度不高，通常在10_6_° 6_5，且批間差異大，制苗時(shí)需加大濃縮倍數(shù)、增加生產(chǎn)成本。另外生產(chǎn)時(shí)要用大量雞胚，不僅勞動(dòng)強(qiáng)度大，而且仍存在外源病毒污染的安全隱患。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種用雞胚源細(xì)胞系生產(chǎn)法氏囊病毒液制備滅活疫苗及其聯(lián)苗的方法，其生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單且穩(wěn)定、易操作，病毒含量高、批間差異小，質(zhì)量易控，可顯箸提高疫苗產(chǎn)量和質(zhì)量，更可為疫苗行業(yè)利用懸浮培養(yǎng)技術(shù)的革新奠定基礎(chǔ)，生產(chǎn)出的傳染性法氏囊病滅活疫苗與聯(lián)苗安全性好、免疫效力高，對(duì)傳染性法氏囊強(qiáng)毒攻擊具有完全的免疫保護(hù)作用。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是用雞胚源細(xì)胞系繁殖傳染性法氏囊病毒制備疫苗的方法，包括如下步驟(1)制苗用細(xì)胞的傳代與培養(yǎng)取雞胚源性的DF-I細(xì)胞系經(jīng)EDTA-胰酶細(xì)胞分散液消化傳代，以細(xì)胞生長(zhǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，形成良好單層時(shí)，用于繼續(xù)傳代或接種病毒；(2)細(xì)胞毒種的繁殖取生產(chǎn)用傳染性法氏囊病毒HQ株CGMCC NO. 4935毒種，按維持液體積量的接種于已長(zhǎng)成良好單層的雞胚傳代細(xì)胞中，置37 38°C繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞病變率達(dá)75%以上時(shí)收獲細(xì)胞液；(3)制苗用毒液的繁殖取步驟(1)中已形成良好單層的上述細(xì)胞系培養(yǎng)瓶，棄去細(xì)胞生長(zhǎng)液，接種含法氏囊細(xì)胞適應(yīng)毒HQ株的維持液，置37 38°C繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)75%以上時(shí)收獲毒液，-15°C以下保存；(4)制苗用毒液的濃縮與滅活將上步所得毒液濃縮至規(guī)定的毒價(jià)后，加入10%甲醛溶液，隨加隨搖，直至溶液中的甲醛終濃度為0. 1%，置37°C滅活16小時(shí)，得傳染性法氏囊病水相；(5)配比、乳化與分裝按規(guī)定的配比取傳染性法氏囊病水相和油相混配乳化后定量分裝，加蓋密封即成。在所述步驟中，將上步所得毒液濃縮至病毒含量彡4X 107 0TCID50/0. Iml ；再于所述步驟( 中，取油相3份，傳染性法氏囊病水相1份進(jìn)行乳化后制成傳染性法氏囊病滅活單疫苗。在所述步驟(4)中，將上步所得毒液濃縮至病毒含量彡8X 107_°TCID5(1/0. Iml后制成傳染性法氏囊病水相；同時(shí)按下述步驟制備雞新城疫水相將雞新城疫病毒接種于10 日齡SPF雞胚尿囊腔，每胚0. 1ml，收獲60 死胚與活胚的雞胚液，將檢驗(yàn)無(wú)菌、對(duì)
雞紅細(xì)胞懸液凝集價(jià)彡1 640的雞胚液混合，濃縮至病毒含量彡2X108_°EID5Q/0. lml、 紅細(xì)胞凝集價(jià) 1觀0，滅活后即成；再于所述步驟(5)中，分別取雞新城疫水相和傳染性法氏囊病水相1份，再各自與油相3份混合制成雞新城疫、傳染性法氏囊病兩種單疫苗， 再將該兩種單疫苗等體積充分混合即制成雞新城疫、傳染性法氏囊病二聯(lián)滅活疫苗。在所述步驟中，將上步所得毒液濃縮至病毒含量彡12X 107 0TCID50/0. Iml 后制成傳染性法氏囊病水相；同時(shí)按下述步驟制備雞新城疫水相將雞新城疫病毒接種于10日齡SPF雞胚尿囊腔，每胚0. Iml，收獲60 邪h死胚與邪h活胚的雞胚液，將檢驗(yàn)無(wú)菌、對(duì)雞紅細(xì)胞懸液凝集價(jià)> 1 640的雞胚液混合后，再濃縮至病毒含量彡3X108_°EID5(l/0. lml、紅細(xì)胞凝集價(jià)彡1 3X640，滅活后即成；并以下述步驟制備傳染性支氣管炎水相將傳染性支氣管炎病毒接種10日齡SPF雞胚，培養(yǎng)收獲毒液后將含毒雞胚液濃縮至病毒含量> 3X 106 0EID50/0. 1ml，滅活后即成；再于所述步驟(5)中，分別取雞新城疫水相、傳染性法氏囊病水相和傳染性支氣管炎水相1份，再各自與油相3份混合制成雞新城疫、傳染性法氏囊病、傳染性支氣管炎三種單疫苗，再將該三種單疫苗等體積充分混合即制成雞新城疫、傳染性支氣管炎、傳染性法氏囊病三聯(lián)滅活疫苗。在所述步驟中，將上步所得毒液濃縮至病毒含量彡16X 107 0TCID50/0. Iml后制成傳染性法氏囊病水相；同時(shí)按下述步驟制備雞新城疫水相將雞新城疫病毒接種于10 日齡SPF雞胚尿囊腔，每胚0. 1ml，收獲60 死胚與活胚的雞胚液，將檢驗(yàn)無(wú)菌、對(duì)
雞紅細(xì)胞懸液凝集價(jià)彡1 640的雞胚液混合，濃縮至病毒含量彡4X108_°EID5Q/0. lml、 紅細(xì)胞凝集價(jià) 4X640，滅活后即成；并以下述步驟制備傳染性支氣管炎水相將傳染性支氣管炎病毒接種10日齡SPF雞胚，培養(yǎng)收獲毒液后將含毒雞胚液濃縮至病毒含量 ^ 4X 106 0EID50/0. 1ml，滅活后即成；且以下述步驟制備減蛋綜合征水相減蛋綜合征病毒接種10 11日齡易感鴨胚，每胚0. 1ml，收獲72 120h死胚和120h活胚的鴨胚液，將檢驗(yàn)無(wú)菌、對(duì)雞紅細(xì)胞懸液凝集價(jià)> 1 10240的鴨胚液混合后進(jìn)行濃縮，濃縮至紅細(xì)胞凝集價(jià) 4X10M0，滅活后即成；再于所述步驟(5)中，分別取雞新城疫水相、傳染性支氣管炎水相、減蛋綜合征水相和傳染性法氏囊病水相各1份，再各自與油相3份混合制成雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征水相和傳染性法氏囊病四種單疫苗，再將該四種單疫苗等體積充分混合即制成雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征、傳染性法氏囊病四聯(lián)滅活疫苗。所述減蛋綜合征病毒為Z16株，其保藏編號(hào)為CGMCC NO. 4934。
所述傳染性支氣管炎病毒為M41株。所述雞新城疫病毒為L(zhǎng)a Sota株。所述細(xì)胞生長(zhǎng)液含含90% DMEM/F12 OHBCO 12500)、10%胎牛血清、90 110U/ml 抗菌素，其PH 7. 2 7. 3、DO (溶氧)體積百分含量30% 60%。所述維持液含98% DMEM/F12、2%胎牛血清、90 100U/ml抗菌素，其pH 1.2 7. 3, DO 30% 50% (溶氧)。本發(fā)明具有積極有益的效果(1)用雞胚源傳代細(xì)胞系替代雞胚成纖維細(xì)胞或雞胚繁殖傳染性法氏囊病毒制備滅活疫苗可避免用雞胚和原代細(xì)胞生產(chǎn)的生物安全隱患，通過(guò)原材料和培養(yǎng)條件的嚴(yán)格控制，保證生產(chǎn)出來(lái)的疫苗純粹，確保疫苗的安全性。(2)采用本發(fā)明培養(yǎng)的法氏囊病毒液病毒含量可提高8 10倍，用高滴度的抗原制造的傳染性法氏囊病滅活疫苗可大大提高疫苗的免疫效力，經(jīng)免疫攻毒試驗(yàn)結(jié)果顯示， 對(duì)雞傳染性法氏囊病強(qiáng)毒的攻擊能100%保護(hù)。(3)用細(xì)胞系生產(chǎn)傳染性法氏囊病毒液各批間質(zhì)量差異小，提高了疫苗質(zhì)量，又克服了疫苗大量生產(chǎn)受制于雞胚的供應(yīng)，節(jié)省了生產(chǎn)成本。另外還具有生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、 易操作、產(chǎn)量大、成本低等特點(diǎn)，更為疫苗行業(yè)利用懸浮培養(yǎng)技術(shù)的革新奠定基礎(chǔ)，因而有很好的經(jīng)濟(jì)效益和應(yīng)用前景。本發(fā)明所述傳染性法氏囊病毒infectious Bursal Disease Virus，IBDV)HQ株， 已于2011年6月13日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其簡(jiǎn)稱為 CGMCCJia 北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，該傳染性法氏囊病毒的保藏編號(hào)為CGMCC NO. 4935。本發(fā)明所述產(chǎn)蛋下降綜合征病毒Z16株，已于2011年6月13日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其簡(jiǎn)稱為CGMCCJia 北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1 號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，該傳染性法氏囊病毒的保藏編號(hào)為CGMCC NO. 4934。


圖1為本發(fā)明方法的工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1傳染性法氏囊病毒HQ株的分離、培育、鑒定過(guò)程上世紀(jì)90年代初期，國(guó)際上流行的傳染性法氏囊超強(qiáng)毒傳入中國(guó)，引起未免疫的雛雞大批發(fā)病和死亡，死亡率高達(dá)40 60%。發(fā)明人于1992年6月在鄭州郊區(qū)的一個(gè)發(fā)病雞場(chǎng)中收取雞亡雞只的法氏囊用于病毒分離。HQ株囊毒是從暴發(fā)傳染性法氏囊病的雞群中分離的超強(qiáng)毒株，HQ株細(xì)胞毒是自然囊毒經(jīng)雞胚囊源細(xì)胞、雞胚腎細(xì)胞、雞胚成纖維細(xì)胞多次傳代、訓(xùn)化而成的，經(jīng)過(guò)培育、訓(xùn)化后細(xì)胞毒致病性減弱，對(duì)細(xì)胞的適應(yīng)性大大增強(qiáng)，在成纖維細(xì)胞上的毒價(jià)，TCID50 ( 10_6 70. Iml ；在DF-1細(xì)胞上的毒價(jià)，TCID50 ( 10_7 °/0. Iml ； HQ株細(xì)胞毒經(jīng)克隆純化和外源病檢測(cè)后，于2000年初委托中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所作毒價(jià)檢驗(yàn)，結(jié)論認(rèn)為符合《雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征、傳染性法氏囊病四聯(lián)滅活疫苗試行規(guī)程》的規(guī)定(報(bào)告編號(hào)2000S004)。HQ株具有良好的免疫原性，是一株優(yōu)秀的制苗毒株。
實(shí)施例2減蛋綜合征病毒Z16株的分離、培育、鑒定過(guò)程上世九十年代初期，國(guó)外早在76年就暴發(fā)的減蛋綜合征(EDS_76)病傳入中國(guó)，引起產(chǎn)蛋雞大批發(fā)病。該病無(wú)明顯的臨床癥狀，但產(chǎn)蛋明顯下降，白殼、軟殼、畸型蛋大大增多。發(fā)明人于1993年5月在鄭州郊區(qū)某養(yǎng)雞場(chǎng)從發(fā)病雞的輸卵管內(nèi)取樣，在12日齡鴨胚上連續(xù)盲傳4 5代，鴨胚出現(xiàn)有規(guī)律的死亡，且胚液出現(xiàn)血凝效價(jià)。隨傳代次數(shù)增多，血凝價(jià)逐步上升至最大值，HA效價(jià)可達(dá)2 8萬(wàn)以上。經(jīng)有限稀釋法克隆、純化后于是1999 年11月22日送山東斯帕法斯?jié)蠈?shí)驗(yàn)室進(jìn)行外源病毒檢測(cè)、于2000年初送中國(guó)獸藥監(jiān)察所進(jìn)行種毒標(biāo)準(zhǔn)毒價(jià)鑒定(報(bào)告編號(hào)2000S004)，檢測(cè)結(jié)果均符合減蛋綜合征病毒種毒要求，隨后建立生產(chǎn)種子批，用于疫苗生產(chǎn)。實(shí)施例3 —種傳染性法氏囊病滅活單疫苗的制備方法，包括如下步驟(1)制苗用細(xì)胞的傳代與培養(yǎng)選用雞胚源性傳代細(xì)胞系DF-1，經(jīng)EDTA-胰酶細(xì)胞分散液消化傳代，以細(xì)胞生長(zhǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，形成良好單層時(shí)，用于繼續(xù)傳代或接種病毒；細(xì)胞生長(zhǎng)液的配方是DMEM/F12(GIBC0 12500)含10%優(yōu)級(jí)胎牛血清(武漢三利)，加適量的抗菌素(100U/ml)，pH調(diào)整為7. 0 7. 2 ；(2)細(xì)胞毒種的繁殖取生產(chǎn)用毒種，按維持液量的接種已長(zhǎng)成良好單層的雞胚傳代細(xì)胞系，置37°C下繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞病變率達(dá)75%以上時(shí)收獲細(xì)胞液為生產(chǎn)種毒；(3)制苗用毒液的繁殖取已形成良好單層的上述細(xì)胞系培養(yǎng)瓶，棄去細(xì)胞生長(zhǎng)液，接種含1 %法氏囊細(xì)胞適應(yīng)毒的維持液，置37 38°C繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)75%以上時(shí)收獲毒液，_15°C以下保存，所用維持液的配方是DMEM/F12，含2%優(yōu)級(jí)胎牛血清(武漢三利)、加適量的抗菌素(100U/ml)，pH調(diào)整為7. 0 7. 2 ；試驗(yàn)表明，雞胚源DF-I細(xì)胞對(duì)HQ毒株非常敏感，將轉(zhuǎn)瓶成纖維細(xì)胞培養(yǎng)病毒液改成轉(zhuǎn)瓶DF-I細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)病毒液，其毒價(jià)可提高1個(gè)滴度，即10倍。(4)制苗毒液的檢驗(yàn)按《中華人民共和國(guó)獸藥典》檢驗(yàn)應(yīng)無(wú)細(xì)菌、霉菌、支原體生長(zhǎng)，細(xì)胞毒液每0. Iml病毒含量應(yīng)> IO7 0TCID50 ；(5)制苗用毒液的濃縮與滅活制備傳染性法氏囊病滅活單疫苗時(shí)將病毒液濃縮至原體積量的1/4(病毒含量彡4X107_°TCID5Q/0. 1ml)；滅活時(shí)甲醛的終濃度為0. 1%,37°C 下滅活16小時(shí)。(6)滅活檢驗(yàn)取滅活后的細(xì)胞液，按5%接毒量接種已長(zhǎng)成良好的單層雞胚成纖維細(xì)胞，觀察96小時(shí)，應(yīng)不出現(xiàn)細(xì)胞病變。將細(xì)胞液傳代培養(yǎng)1次，觀察96小時(shí)，若不出現(xiàn)細(xì)胞病變，認(rèn)為滅活完全。(7)傳染性法氏囊病滅活疫苗制備滅活傳染性法氏囊病病毒液后，取油相3份， 傳染性法氏囊病水相1份進(jìn)行乳化后制成傳染性法氏囊病滅活單疫苗。實(shí)施例4 一種新、法二聯(lián)滅活疫苗的制備方法，其傳染性法氏囊病水相的制備步驟與實(shí)施例3基本相同，不同之處在于將所得制苗用毒液濃縮至原體積量的1/8(病毒含量彡8X 107 0TCID50/0. 1ml)，同時(shí)按下述步驟制備雞新城疫水相將雞新城疫病毒La Sota 株(購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)接種于10日齡SPF雞胚尿囊腔，每胚0. lml，收獲60 96h死胚與活胚的雞胚液，將檢驗(yàn)無(wú)菌、對(duì)1 %雞紅細(xì)胞懸液凝集價(jià)> 1 640的雞胚液混合，濃縮至原體積量的1/2 1/3(病毒含量> 2X IO8 tlEID5tlA). lml、紅細(xì)胞凝集價(jià) ^ 1 1280)，滅活后即成；再于所述步驟(7)中，分別取雞新城疫水相和傳染性法氏囊病水相1份，再各自與油相3份混合制成雞新城疫、傳染性法氏囊病兩種單疫苗，再將該兩種單疫苗等體積充分混合即制成雞新城疫、傳染性法氏囊病二聯(lián)滅活疫苗。實(shí)施例5 —種新、支、法三聯(lián)滅活疫苗的制備方法，其傳染性法氏囊病水相的制備步驟與實(shí)施例3基本相同，不同之處在于將所得制苗用毒液濃縮至原體積量的1/12(病毒含量> 12X 107 0TCID50/0. 1ml)，同時(shí)按下述步驟制備雞新城疫水相將雞新城疫病毒La Sota株(購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)接種于10日齡SPF雞胚尿囊腔，每胚0. 1ml，收獲60
死胚與活胚的雞胚液，將檢驗(yàn)無(wú)菌、對(duì)雞紅細(xì)胞懸液凝集價(jià)> 1 640的雞胚液混合，濃縮至原體積量的1/3 1/4.5(病毒含量彡3X 108 0EID50/0. 1ml、紅細(xì)胞凝集價(jià) ^ 1 3X640)，滅活后即成；并以下述步驟制備傳染性支氣管炎水相將傳染性支氣管炎病毒M41株(購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)接種10日齡SPF雞胚，培養(yǎng)收獲毒液后將含毒雞胚液濃縮至原體積量的1/3 1/4. 5 (病毒含量彡3X 106 0EID50/0. 1ml)，滅活后即成；再于所述步驟(7)中，分別取雞新城疫水相、傳染性法氏囊病水相和傳染性支氣管炎水相1份， 再各自與油相3份混合制成雞新城疫、傳染性法氏囊病、傳染性支氣管炎三種單疫苗，再將該三種單疫苗等體積充分混合即制成雞新城疫、傳染性支氣管炎、傳染性法氏囊病三聯(lián)滅活疫苗。實(shí)施例6—種新、支、減、法四聯(lián)滅活疫苗的制備方法，其傳染性法氏囊病水相的制備步驟與實(shí)施例3基本相同，不同之處在于將所得制苗用毒液濃縮至原體積量的1/16(病毒含量彡16X 107 0TCID50/0. 1ml)，同時(shí)按下述步驟制備雞新城疫水相將雞新城疫病毒La Sota株(購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)接種于10日齡SPF雞胚尿囊腔，每胚0. Iml,收獲60 死胚與活胚的雞胚液，將檢驗(yàn)無(wú)菌、對(duì)1 %雞紅細(xì)胞懸液凝集價(jià) 640的雞胚液混合，再濃縮至原體積量的1/4 1/6(病毒含量彡4X 108 0EID50/0. 1ml)，滅活后即成；并以下述步驟制備傳染性支氣管炎水相將傳染性支氣管炎病毒M41株(購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)接種10日齡SPF雞胚，培養(yǎng)收獲毒液后將含毒雞胚液濃縮至原體積量的1/4 1/6(病毒含量彡4X 106 0EID50/0. 1ml)，滅活后即成；且以下述步驟制備減蛋綜合征水相減蛋綜合征病毒Z16株(CGMCC NO. 4934)接種 10 11日齡易感鴨胚，每胚0. 1ml，收獲72 120h死胚和120h活胚的鴨胚液，將檢驗(yàn)無(wú)菌、對(duì)雞紅細(xì)胞懸液凝集價(jià)> 1 10240的鴨胚液混合后進(jìn)行濃縮，濃縮至原體積量的1/4 1/6(紅細(xì)胞凝集價(jià)彡1 4X10M0)，滅活后即成；再于所述步驟(7)中，分別取雞新城疫水相、傳染性支氣管炎水相、減蛋綜合征水相和傳染性法氏囊病水相各1份，再各自與油相3份混合制成雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征水相和傳染性法氏囊病四種單疫苗，再將該四種單疫苗等體積充分混合即制成雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征、傳染性法氏囊病四聯(lián)滅活疫苗。實(shí)施例7成品檢驗(yàn)按照《中華人民共和國(guó)獸藥典》、“雞新城疫、傳染性法氏囊病二聯(lián)滅活疫苗制造及檢驗(yàn)試行規(guī)程”、“雞新城疫、傳染性支氣管炎、傳染性法氏囊病三聯(lián)滅活疫苗制造及檢驗(yàn)試行規(guī)程”、“雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征、傳染性法氏囊病四聯(lián)滅活疫苗制造及檢驗(yàn)試行規(guī)程”中成品檢驗(yàn)規(guī)定。其中雞傳染性法氏囊病部分的效力檢驗(yàn)用21 觀日齡 SPF雞20只，各肌肉或皮下注射疫苗0. 5ml, 30日后，連同條件相同的對(duì)照雞20只，分別采血、分離血清，測(cè)定中和抗體，免疫雞幾何平均效價(jià)應(yīng)> 1 5000 ；對(duì)照雞幾何平均效價(jià)應(yīng)彡1 8 ；或經(jīng)口接種雞傳染性法氏囊病病毒BC6-85株強(qiáng)毒，每只0. 2ml (含2X IO4BID)， 72小時(shí)后全部剖殺，檢查法氏囊病病變。對(duì)照組應(yīng)至少有16只雞發(fā)病，免疫組應(yīng)全部保護(hù)。(1)按照實(shí)施例4中的方法制成的1001、1002、1003三批雞新城疫、傳染性法氏囊病二聯(lián)滅活疫苗法氏囊病部分效力檢驗(yàn)用觀日齡SPF雞各20只，分別肌肉注射上述二聯(lián)苗，每只0. 5ml ；另用20只SPF雞肌肉注射用原代成纖維細(xì)胞制備的二聯(lián)苗作比較試驗(yàn)，30 日后，連同條件相同的對(duì)照雞20只，分別采血，用成纖維細(xì)胞和DF-I細(xì)胞測(cè)定中和抗體，免疫雞幾何平均效價(jià)均> 1 5000 ；對(duì)照雞幾何平均效價(jià)應(yīng)< 1 8。同時(shí)經(jīng)口接種雞傳染性法氏囊病BC6-85株強(qiáng)毒，每只0. 2ml (含2 X IO4BID)，72小時(shí)后全部剖殺，檢查法氏囊病病變。對(duì)照組雞全部發(fā)病，免疫組雞全部保護(hù)。表明這三批雞新城疫、傳染性法氏囊病二聯(lián)滅活苗均符合“試行規(guī)程”中“雞傳染性法氏囊部分”效力檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的要求。詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表 1。表1 二聯(lián)滅活油苗(La Sota+HQ株)IBD效力試驗(yàn)
疫苗批號(hào)效檢免疫劑量雞數(shù)中和抗(GMT)攻毒保護(hù)判定CEF細(xì)胞DF-1細(xì)胞(P/C)1001IBD0. 5 ml/只20只215·4215·810/10合格1002IBD0. 5 ml/只20只2150215·410/10合格1003IBD0. 5 ml/只20只廣215·210/10合格原代細(xì)胞苗IBD0.5 ml/只20只212.5212·69/10對(duì)照組IBD-20只^230^2300/10表1中結(jié)果顯示，1001 1003三批雞新城疫苗、傳染性法氏囊病二聯(lián)疫苗的中和抗體水平為214 8 215 8，明顯地高于規(guī)程要求的1 500(K212 3)，也高于用原代成纖維細(xì)胞生產(chǎn)的法氏囊毒液制備的二聯(lián)苗O12 6)；對(duì)強(qiáng)毒的攻擊免疫組100%保護(hù)，對(duì)照組100%發(fā)病，具有完全的保護(hù)力。(2)新-法二聯(lián)、新-支-法三聯(lián)、新-支-減-法四聯(lián)滅活疫苗傳染性法氏囊病部分最小免疫量測(cè)定分別按上述實(shí)施例4、5、6中的方法和要求，分別制備上述含傳染性法氏囊病的二聯(lián)、三聯(lián)、四聯(lián)疫苗。每批用不含抗原的生理鹽水制備的油乳劑稀釋成1/2、1/4、1/8、1/16 羽份，分別免疫28日齡SPF雞各10只，肌注0. 5ml/只，另設(shè)對(duì)照組雞10只，不做任何免疫。免疫后30天采血，測(cè)定各組傳染性法氏囊病的中和抗體和瓊擴(kuò)抗體水平，并用雞傳染性法氏囊病病毒強(qiáng)毒BC6-85株，經(jīng)口接種，每只0. aiil (含2 X IO4BID)，72小時(shí)后剖殺所有雞，檢查傳染性法氏囊病病變。按照IBD效力檢驗(yàn)的判定標(biāo)準(zhǔn)，中和抗體幾何平均效價(jià)應(yīng)彡1 5000，對(duì)照雞幾何平均效價(jià)應(yīng)彡1 8 ；攻毒后對(duì)照組應(yīng)至少有16只雞有病變，免疫組應(yīng)全部保護(hù)。確定能使IBD效力檢驗(yàn)合格的最小免疫劑量，結(jié)果見(jiàn)表2。表2雞傳染性法氏囊病細(xì)胞系滅活聯(lián)苗的最小免疫量測(cè)定
權(quán)利要求
1.一種用雞胚源細(xì)胞系繁殖傳染性法氏囊病毒制備滅活疫苗的方法，包括如下步驟(1)制苗用細(xì)胞的傳代與培養(yǎng)取雞胚源性的DF-I細(xì)胞系經(jīng)EDTA-胰酶細(xì)胞分散液消化傳代，以細(xì)胞生長(zhǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，形成良好單層時(shí)，用于繼續(xù)傳代或接種病毒；(2)細(xì)胞毒種的繁殖取生產(chǎn)用傳染性法氏囊病毒毒種，按維持液體積量的接種于已長(zhǎng)成單層的雞胚傳代細(xì)胞中，置37 38°C下繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞病變率達(dá)75%以上時(shí)收獲細(xì)胞液；(3)制苗用毒液的繁殖取步驟(1)中已形成良好單層的上述細(xì)胞系培養(yǎng)瓶，棄去細(xì)胞生長(zhǎng)液，接種含法氏囊細(xì)胞適應(yīng)毒HQ株(TCID5tl彡10_7_°)的維持液，置37 38°C繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)75%以上時(shí)收獲毒液，-15°C以下保存；(4)制苗用毒液的濃縮與滅活將上步所得毒液濃縮至病毒含量彡4X 107 0TCID50/0. Iml后，加入10%甲醛溶液，隨加隨搖，直至溶液中的甲醛終濃度為 0. 1%，置37°C滅活16小時(shí)，得傳染性法氏囊病水相；(5)配比、乳化與分裝取疫苗用油相3份，傳染性法氏囊水相1份混合乳化后制成傳染性法氏囊病滅活單疫苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用雞胚源細(xì)胞系繁殖傳染性法氏囊病毒制備滅活疫苗的方法，其特征在于，所述傳染性法氏囊病毒為HQ株，其保藏編號(hào)為CGMCCN0. 4935。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用雞胚源細(xì)胞系繁殖傳染性法氏囊病毒制備滅活疫苗的方法，其特征在于，所述細(xì)胞生長(zhǎng)液含90 % DMEM/F12、10 %胎牛血清、100U/ml抗菌素，其pH 7. 2 7. 3、DO體積百分含量30% 60%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用雞胚源細(xì)胞系繁殖傳染性法氏囊病毒制備滅活疫苗的方法，其特征在于，所述維持液含98% DMEM/F12、2%胎牛血清、100U/ml抗菌素，其pH 7. 2 7. 3, DO 3% 50%。
5.一種用雞胚源細(xì)胞系繁殖傳染性法氏囊病毒制備雞新城疫、傳染性法氏囊病二聯(lián)疫苗的方法，包括如下步驟(1)、(2)、(3)步驟同權(quán)利要求1、2、3或4所述；(4)將上步所得毒液濃縮至病毒含量彡8X107 0TCID50/0. Iml后滅活制成傳染性法氏囊病水相；(5)同時(shí)按下述步驟制備雞新城疫水相將雞新城疫病毒接種于10日齡SPF雞胚尿囊腔，每胚0. 1ml，收獲60 后死胚與后活胚的雞胚液，將檢驗(yàn)無(wú)菌、對(duì)1 %雞紅細(xì)胞懸液凝集價(jià) 640的雞胚液混合，濃縮至病毒含量>2X108_°EID5Q/0. lml、紅細(xì)胞凝集價(jià)彡1 1沘0，滅活后即成；(6)分別取雞新城疫水相和傳染性法氏囊病水相1份，再各自與疫苗用油相3份混合制成雞新城疫、傳染性法氏囊病兩種單疫苗，再將該兩種單疫苗等體積充分混合即制成雞新城疫、傳染性法氏囊病二聯(lián)滅活疫苗。
6.一種用雞胚源細(xì)胞系繁殖傳染性法氏囊病毒制備雞新城疫、傳染性支氣管炎、傳染性法氏囊病三聯(lián)滅活疫苗的方法，包括如下步驟(1)、(2)、(3)步驟同權(quán)利要求1、2、3或4所述；(4)將上步所得毒液濃縮至病毒含量> 12X 107 0TCID50/0. Iml后滅活制成傳染性法氏囊病水相；(5)同時(shí)按下述步驟制備雞新城疫水相將雞新城疫病毒接種于10日齡SPF雞胚尿囊腔，每胚0. 1ml，收獲60 死胚與活胚的雞胚液，將檢驗(yàn)無(wú)菌、對(duì)1 %雞紅細(xì)胞懸液凝集價(jià) 640的雞胚液混合后，再濃縮至病毒含量>3X108_°EID5Q/0. lml、紅細(xì)胞凝集價(jià)彡1 3 X 640，滅活后即成；(6)并以下述步驟制備傳染性支氣管炎水相將傳染性支氣管炎病毒接種10日齡SPF 雞胚，培養(yǎng)收獲毒液后將含毒雞胚液濃縮至病毒含量> 3X IO6 tlEID5tlA). 1ml，滅活后即成；(7)分別取雞新城疫水相、傳染性法氏囊病水相和傳染性支氣管炎水相1份，再各自與油相3份混合制成雞新城疫、傳染性法氏囊病、傳染性支氣管炎三種單疫苗，再將該三種單疫苗等體積充分混合即制成雞新城疫、傳染性支氣管炎、傳染性法氏囊病三聯(lián)滅活疫苗。
7.一種用雞胚源細(xì)胞系繁殖傳染性法氏囊病毒制備雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征、傳染性法氏囊病四聯(lián)滅活疫苗的方法，包括如下步驟(1)、(2)、(3)步驟同權(quán)利要求1、2、3或4所述；(4)將上步所得毒液濃縮至病毒含量>16X 107 0TCID50/0. Iml后滅活制成傳染性法氏囊病水相；(5)制備雞新城疫水相將雞新城疫病毒接種于10日齡SPF雞胚尿囊腔，每胚 0. Iml,收獲60 死胚與活胚的雞胚液，將檢驗(yàn)無(wú)菌、對(duì)雞紅細(xì)胞懸液凝集價(jià)彡1 640的雞胚液混合，濃縮至病毒含量彡4X108_°EID5Q/0. lml、紅細(xì)胞凝集價(jià)彡1 4X640，滅活后即成；(6)制備傳染性支氣管炎水相將傳染性支氣管炎病毒接種10日齡SPF雞胚，培養(yǎng)收獲毒液后將含毒雞胚液濃縮至病毒含量彡4X 106 0EID50/0. 1ml，滅活后即成；(7)制備減蛋綜合征水相減蛋綜合征病毒接種10 11日齡易感鴨胚，每胚0.Iml, 收獲72 120h死胚和120h活胚的鴨胚液，將檢驗(yàn)無(wú)菌、對(duì)雞紅細(xì)胞懸液凝集價(jià)彡1 10240的鴨胚液混合后進(jìn)行濃縮，濃縮至紅細(xì)胞凝集價(jià)彡1 4X10M0，滅活后即成；(8)分別取雞新城疫水相、傳染性支氣管炎水相、減蛋綜合征水相和傳染性法氏囊病水相各1份，再各自與疫苗用油相3份混合制成雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征水相和傳染性法氏囊病四種單疫苗，再將該四種單疫苗等體積充分混合即制成雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征、傳染性法氏囊病四聯(lián)滅活疫苗。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用雞胚源細(xì)胞系繁殖傳染性法氏囊病毒制備雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征、傳染性法氏囊病四聯(lián)滅活疫苗的方法，其特征在于，所述減蛋綜合征病毒為Z16株，其保藏編號(hào)為CGMCC NO. 4934。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用雞胚源細(xì)胞系繁殖傳染性法氏囊病毒制備雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征、傳染性法氏囊病四聯(lián)滅活疫苗的方法，其特征在于，所述傳染性支氣管炎病毒為M41株。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用雞胚源細(xì)胞系繁殖傳染性法氏囊病毒制備雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征、傳染性法氏囊病四聯(lián)滅活疫苗的方法，其特征在于，所述雞新城疫病毒為L(zhǎng)a Sota株。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用雞胚源細(xì)胞系繁殖IBDV制備疫苗的方法。其主要包括①制苗用細(xì)胞DF-1的傳代與培養(yǎng)；②繁殖IBDV HQ株細(xì)胞毒種；③繁殖制苗用病毒液；④制苗用毒液的濃縮、滅活；⑤制備新-法、新-支-法、新-支-減-法聯(lián)苗其它病毒液的制備與濃縮；⑥滅活聯(lián)苗的配比、乳化與分裝。本發(fā)明生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、易操作；消除了常規(guī)疫苗生產(chǎn)中存在的生物安全隱患，克服了疫苗大量生產(chǎn)受制于雞胚的供應(yīng)，成本下降，批間差異降低，病毒毒價(jià)和疫苗質(zhì)量提高，為疫苗行業(yè)利用懸浮培養(yǎng)技術(shù)大規(guī)模培養(yǎng)病毒液的革新奠定了基礎(chǔ)；生產(chǎn)出的傳染性法氏囊病滅活疫苗與聯(lián)苗安全性好、免疫效力高，對(duì)IBDV強(qiáng)毒攻擊具有完全的免疫保護(hù)作用。
文檔編號(hào)A61K39/12GK102258777SQ20111018051
公開(kāi)日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2011年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月30日
發(fā)明者劉紅英, 姚惠霞, 常洪濤, 楊霞, 王川慶, 王新衛(wèi), 王永生, 王澤霖, 王雷, 趙軍, 陳陸 申請(qǐng)人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病研究所