專利名稱：含有莽草酸及其衍生物的藥物制劑及其在制備抗血栓形成和鎮(zhèn)痛作用藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以莽草酸及其衍生物為活性成分的藥物制劑。本發(fā)明還涉及莽草酸及其衍生物的藥物新用途，具體講是莽草酸以及莽草酸三乙酰衍生物(SA-2)在制備具有抗血栓形成和鎮(zhèn)痛作用藥物中的應(yīng)用，屬于藥物領(lǐng)域。
莽草酸(Shikmic acid，SA-1)，為中草藥木蘭科八角屬多種植物果實中含有的藥效成分，其來源由八角科多蕊紅茴香Illicium henrvivar.multistamineum的果實及八角屬其它植物的成熟果實經(jīng)甲醇等溶劑提取，精制而成。其分子式為C7H10O5，分子量為174.15。近年來，對血栓形成機制的研究及抗血栓藥物的開發(fā)深受各國醫(yī)藥界的關(guān)注，并已有部分有效化合物處于臨床和臨床前研究階段?？寡ㄋ幬锔鶕?jù)其作用機理分為三類抗凝藥物、抗血小板藥物和溶栓藥物?？鼓幬镏?，除了天然和重組人類抗凝血酶-III外，還有凝血酶的直接抑制劑水蛭素、阿加曲班以及中藥花椒、丹參、赤芍的粗提物；抗血小板藥物目前取得不少新的進展，有抑制花生四烯酸代謝的藥物鉤藤堿、毛冬青甲素、芍藥酚，抑制血小板激活因子的粉防已堿，銀杏內(nèi)脂B和海風(fēng)藤酮，也發(fā)現(xiàn)有些中藥或成分通過提高血小板內(nèi)cAMP水平，降低血小板內(nèi)Ca2+濃度從而抑制血小板聚集。隨著血栓性疾病病理機制及體內(nèi)纖溶機制的進一步闡明，抗栓和溶栓藥物的研究越來越多，該類藥物在急性心肌梗塞的溶栓治療中占有重要的地位。已發(fā)現(xiàn)中藥蒲黃的水溶液具有不依賴纖溶酶系的直接促纖溶作用。大蒜可明顯降低血漿纖維蛋白原，并可直接激活纖溶酶，使分解纖維蛋白產(chǎn)生的片斷顯著增多，赤芍和蚯蚓水提物也均可在不同環(huán)節(jié)產(chǎn)生溶栓作用?？傊?，抗血栓藥物的研究開發(fā)工作十分活躍，對藥物作用機理的研究已深入到分子和受體水平。盡管目前的工作取得不少成績，但存在問題也較多，主要問題是中藥的研究制劑純度不夠，粗制劑中雜質(zhì)多，對藥效、作用機理及臨床給藥途徑帶來很大的局限性。因此，純的單體藥物是今后開發(fā)的主要方向。目前國內(nèi)外對于莽草酸的研究僅局限于藥理作用的研究，尚未見有關(guān)莽草酸藥物制劑的報道。對莽草酸及其衍生物的藥理研究多集中在細胞毒及抗生方面，未見有關(guān)對血液系統(tǒng)作用的研究。另外，也未見關(guān)于莽草酸在鎮(zhèn)痛等其他藥理作用方面的報道。
本發(fā)明目的是提供一個具有良好的抗血栓形成及溶栓作用，且具有鎮(zhèn)痛作用的藥物制劑，該藥物以莽草酸(SA-1)及其衍生物三乙酰莽草酸(SA-2)為活性成分，該活性成分為資源豐富、容易提取、結(jié)構(gòu)簡單、易于人工合成的新型藥物單體，且不良反應(yīng)小。
本發(fā)明的另一個目的是提供莽草酸(SA-1)及其衍生物在制備抗血栓形成和鎮(zhèn)痛作用藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明藥物的藥效成分莽草酸及其衍生物的來源之一是由下述方法提取取八角屬植物的成熟果皮，粉碎，以甲醇為溶劑提取，濃縮，放置，過濾沉淀，石油醚處理，甲醇反復(fù)結(jié)晶即得莽草酸。
取莽草酸，加入醋酐，再滴加濃硫酸，放置，將反應(yīng)物加到冰水中搖拌，放置，上層水層以氯仿萃取，以此氯仿再溶解處理下層反應(yīng)物，水洗氯仿，減壓回收氯仿，即得莽草酸三乙?；铩?br> 本發(fā)明藥物含有有效量的莽草酸及其衍生物，所說的莽草酸衍生物優(yōu)選三乙酰莽草酸。
本發(fā)明藥物含有1％-99％重量份的莽草酸及其衍生物，所說的莽草酸衍生物優(yōu)選三乙酰莽草酸。
本發(fā)明藥物優(yōu)選含有10％-80％重量份的莽草酸及其衍生物，所說的莽草酸衍生物優(yōu)選三乙酰莽草酸。
本發(fā)明藥物更優(yōu)選含有20％-60％重量份的莽草酸及其衍生物，所說的莽草酸衍生物優(yōu)選三乙酰莽草酸。
本發(fā)明藥物最佳含有25％重量份的莽草酸及其衍生物，所說的莽草酸衍生物優(yōu)選三乙酰莽草酸。
本發(fā)明藥物除含有有效量的莽草酸及其衍生物之外，還含有藥劑學(xué)領(lǐng)域中常用的藥物賦形劑，例如，溶劑、填充劑、調(diào)味劑、崩解劑、粘合劑、潤滑劑、潤濕劑、色素、增溶劑、稀釋劑、增稠劑等。
根據(jù)常規(guī)的制劑技術(shù)，本發(fā)明藥物可以制備成任何一種適合于臨床使用的藥物制劑，例如，丸劑、片劑、散劑、注射劑、口服液、膠囊劑、混懸劑、膏劑、顆粒劑、粉針劑、咀嚼劑等。
本發(fā)明藥物片劑的制備方法如下組分莽草酸25克糖粉 22克淀粉 43克10％淀粉漿適量硬脂酸鎂0.5克制成1000片制法將莽草酸、糖粉分別粉碎、過篩、混合均勻，加淀粉漿攪勻、加入淀粉漿的量以達到適合于制粒的程度為宜，用16目尼龍篩制粒，60℃干燥，加硬脂酸鎂混勻，壓片，每片含莽草酸25毫克。
本發(fā)明藥物注射劑的制備方法如下組分莽草酸25克氯化鈉9克注射用水加至1000毫升制法取注射用水800毫升，加入氯化鈉攪拌溶解，再加入莽草酸使之溶解，再加水至足量，攪拌，過濾，灌封，100℃流通蒸汽30分鐘滅菌，即得。
本發(fā)明藥物與現(xiàn)有抗血栓藥進行比較，具有良好的抗血栓形成及溶栓作用，且具有鎮(zhèn)痛、解熱、抗炎等作用。并且其活性成分藥物單體資源豐富、容易提取、結(jié)構(gòu)簡單、易于人工合或。莽草酸(SA-1)及其衍生物三乙酰莽草酸(SA-2)經(jīng)藥理實驗證明具有良好抗血栓形成作用，其三乙?；苌飫t可加強其作用，并又具有溶栓作用，是一種療效好且不良反應(yīng)小的治療血栓性疾病的新型藥物。
實驗例1莽草酸抗血栓形成作用實驗研究1.莽草酸對大鼠動、靜脈旁路血栓的影響實驗材料(1)動物Wistar種雄性大鼠體重250g～350g中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所繁育場提供，合格證編號為(京動字)第9201R018號。(2)受試藥莽草酸純品由本北京中醫(yī)藥大學(xué)藥化研究室郭亞健教授提供，干燥器內(nèi)保存。使用時用生理鹽水新鮮配制，用1NNaOH溶液調(diào)pH＝7，供靜脈注射用。(3)儀器LIBRORAEG-220型電子天平，日本SHMADEE公司產(chǎn)品。方法與結(jié)果取大鼠隨機分為9組，即對照組、莽草酸400mg/kg組、100mg/kg組、50mg/kg組、25mg/kg組，肝素140μ/只，川芎嗪50mg/kg組、25mg/kg組。腹腔注射戊巴比妥鈉50mg/kg麻醉，仰位固定，頸部手術(shù)分離右頸總動脈及左頸外靜脈。取三段聚乙烯管(兩段分別長10cm，內(nèi)徑1mm，中段長8cm，內(nèi)徑2mm)，在中段中放入一根長5cm的號絲線(預(yù)先稱重)、再連接兩段細管。從一端注入肝素生理鹽水溶液(50μ/ml)，充滿管腔，管的一端插入左頸外靜脈，另一端插入右頸總動脈。手術(shù)完成后立即由股靜脈注射藥物(給藥組)和生理鹽水(對照組)，開放血流，15分鐘后中斷血流，迅速取出絲線稱重，總重量減去線線重即為血栓重量，在60℃烤箱中烘1小時后稱重，減去絲線重即為血栓干重。按下列公式計算抑制率。
對照組血栓干(濕)重-給藥組血栓干(濕)重抑制率對照組血栓干(濕)重×100g表1莽草酸對大鼠動靜脈旁路血栓的影響組別 劑量動物數(shù) 血栓濕重抑制率血栓干重抑制率(mg/kg)(n) (mg) (mg) (mg) (％)對照組-1125.9±12.2 6.7±3.7 -莽草酸 400 109.1±4.0**65 2.8±1.5 58.2莽草酸 200 105.9±27***77 1.6±1.2 76.1莽草酸 100 106.2±3.8***76 1.8±1.2 73.1莽草酸 501012.5±8.1**52 2.4±1.8 64.2莽草酸 25108.6±3.3**67 1.8±1.3 73.1川芎嗪 501110.9±4.9***58 2.4±1.8 64.2川芎嗪 25128.6±2.3***67 1.8±1.1 73.1肝素 140μ/只 102.2±1.0***92 0.3±0.3 95.5**和***與對照組比較P＜0.01和P＜0.001表1結(jié)果顯示，靜脈注射莽草酸400mg/kg～25mg/kg，具有對抗動-靜脈環(huán)路血栓形成作用，作用強度與川芎嗪類似。但未見明顯而規(guī)律的量效關(guān)系。2.莽草酸對大鼠頸總動脈血栓形成的影響實驗材料(1)動物Wistar種雄性大鼠體重250g～350g，由中國醫(yī)學(xué)院實驗動物實驗所繁育場提供，合格證編號為(京動字)第9209-R018號。(2)受試藥莽草酸純品由本校藥化教研室郭亞健教授提供，干燥器保存。使用時間生理鹽水新鮮配制，用1N NaOH溶液調(diào)pH＝7，供靜注。(3)儀器BT87-3型實驗性體內(nèi)血栓形成測定儀，包頭醫(yī)學(xué)院研制。方法與結(jié)果大鼠隨機分成5組，腹腔注射巴比妥鈉50mg/kg麻醉。仰位固定于手術(shù)臺上，切開頸部皮膚，分離右側(cè)頸總動脈3cm，將BT877-3型實驗性血栓形成測定儀的刺激電極安放在動脈近心端，溫度傳感電極安放在遠心端，兩電極間距2.5cm。將電極固定于手術(shù)臺架上、手術(shù)完成后給藥組分別于股靜脈注射莽草酸溶液400mg/kg、200mg/kg、100mg/kg，肝素組給1％肝素溶液0.1ml/只，以照組給等容量生理鹽水。給藥后開動血栓形成儀開關(guān)，給予1.5mν直流電刺激7分鐘，以損傷內(nèi)皮細胞、10分鐘后溫度指示針調(diào)零、隨著腔內(nèi)血栓的形成，動脈遠心端溫度突降，儀器報警，顯示動脈阻塞時間OT(occlusion time)，結(jié)果見表2表2莽草酸靜脈給藥對大鼠頸總動脈血栓形成的影響組別 劑量動物教 血栓形成時間(mg/kg) (只) OT(X±SD)對照組等容量 10 966.1±125.9莽草酸組400 101432.2±147.2***莽草酸組200 101260.6±190.3***莽草酸組100 101362.8±127.9***肝素組140U/只101598.8±271.2***注***與對照組比較P＜0.001
結(jié)果表明和對照組相比，莽草酸400mg/kg組、200mg/kg組、100mg/kg組都顯著延長了血栓形成時間(P＜0.001，P＜0.001，P＜0.001)，作用和肝素組相似者，二者相比組間無顯著差異。3.莽草酸對大鼠下腔靜脈血栓的影響(1)動物Wistar種雄性大鼠，體重300～350g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所繁育場提供，合格證編號為(京動字)第9209-R018號。(2)受試藥和其他藥品莽草酸純品由本校藥化研究室郭亞健教授提供，使用時用生理鹽水新鮮配制，用1N NaOH溶液調(diào)pH＝7，供靜注用，用1％ CMC(羧甲基纖維素鈉)混懸后供灌胃用；肝素每mg效價為140U，批號930412，中國醫(yī)藥公司北京采購供應(yīng)站產(chǎn)品。(3)儀器DF206電熱鼓風(fēng)干燥箱，北京京通儀器廠產(chǎn)品。方法與結(jié)果①靜脈注射給藥對大鼠結(jié)扎下腔靜脈血栓形成[1]作用。
取大鼠隨機分成5組，腹腔注射戊巴比妥鈉溶液50mg/kg麻醉。仰位固定，開腹分離下腔靜脈。由股靜脈注射給藥，莽草酸組分別給莽草酸溶液400mg/kg、200mg/kg、100mg/kg，肝素組給0.1％肝素0.1ml/只，對照組給等容量生理鹽水。給藥后在下腔靜脈右腎靜脈分支處下方結(jié)扎下腔靜脈、用一根5號絲線將腔靜脈扎緊?？p合腹壁，6小時后重新開腹，在扎線處下方2cm處夾閉血管，剖開管腔，取出血栓，稱濕重，然后在60℃烤箱中烤1小時后稱干重，結(jié)果見表3。
表3莽草酸靜注對大鼠結(jié)扎下腔靜脈血栓形成的影響組別 劑量 動物數(shù) 血栓濕重(X±SD)血栓干重(X±SD)(mg/kg) (只)(mg)(mg)對照組 等容量 8 3.02±8.0 10.0±3.9莽草酸組 400 8 33.9±22.0 11.1±7.0莽草酸組 200 8 10.6±6.6***2.6±1.7***莽草酸組 100 8 19.4±9.7*5.6±2.8*肝素組 140U/只 8 1.8±1.2*0±0.5*注***P＜0.001*P＜0.05
結(jié)果表明與對照組相比，莽草酸200mg/kg組顯著的降低了血栓干濕重(P＜0.001)，莽草酸100mg/kg組作用明顯(P＜0.05)。莽草酸400mg/kg組作用不明顯。②口服連續(xù)給藥對大鼠結(jié)扎下腔靜脈血栓形成的影響取大鼠隨機分為4組，莽草酸組每天灌胃一次莽草酸1％CMC溶液400mg/kg、200mg/kg；阿斯匹林組灌胃阿斯匹林1％cmc溶液30mg/kg。對照組給等容量1％CMC。連續(xù)給藥3天，末次給藥60分鐘手術(shù)。觀察結(jié)扎下腔靜脈血栓形成的影響、方法見本模型靜脈給藥部分，結(jié)果見表4。表4 口服莽草酸對大鼠結(jié)扎下腔靜脈血栓形成的影響(連續(xù)給藥)組別 劑量動物數(shù) 血栓濕重 血栓干重(mg/kg)(只) (mg) (mg)對照組 100520.4±20.57.4±7.8阿斯匹林組30645.7±40.015.1±12.7莽草酸組 40049.5±6.2**2.8±1.7**莽草酸組 200532.0±22.818.0±19.8注**P＜0.05結(jié)果表明莽草酸連續(xù)口服400mg/kg組有抑制結(jié)扎下腔靜脈血栓形成作用(P＜0.05)，莽草酸口服200mg/kg組及阿斯匹林組作用不明顯。4.莽草酸對小鼠肺栓塞模型的影響實驗材料(1)動物昆明種雄性小鼠體重25～30g，由北京醫(yī)科大學(xué)實驗動物供應(yīng)部提供，合格證編號(京動字)第8806M038。(2)藥品受試藥莽草酸純品由本校藥化研究室郭亞健教授提供，使用時用生理鹽水新鮮配制，用1N NaOH溶液pH＝7，供靜永主射用。ADP凝血酶為Sigma公司產(chǎn)品；鹽酸腎上腺素為市售。方法與結(jié)果取雄性小鼠50只，體重25～30g隨機分成5組。新鮮配凝血混合液、將凝血酶5mg溶入5ml生理鹽水中；將ADP1.74mg溶入2.5ml生理鹽水中；再取0.1％腎上腺素0.125ml。將三種溶液混合。取小鼠分別于尾靜脈注射給藥，莽草酸組給莽草酸溶液200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg。對照組給等容量生理鹽水。給上述藥物1分鐘后在每只小鼠尾靜脈再注射凝血酶混合液0.1ml/10g。記錄小鼠死亡時間，死亡數(shù)，計算死亡率，結(jié)果見表5。
表5莽草酸靜脈給藥對凝血酶誘發(fā)小鼠急性肺栓塞的影響組別 劑量 動物數(shù) 死亡數(shù) 死亡率 死亡時間(X±SD)(mg/kg) (只)(只)(％) (S)對照組 等容量10 10 100 299.8±116.42莽草酸組 10 10 9 90 313.0±238.08莽草酸組 50 10 5 50 623.1±361.93 △莽草酸組 100 10 8 80 377.1±319.31莽草酸組 200 10 4 40 663.9±313.32△△注經(jīng)卡方檢驗有意義△，△△和對照組相比P＜0.01結(jié)果顯示對照組小鼠引起肺栓塞，死亡率為100％，靜注莽草酸200mg/kg組和50mg/kg組顯著降低了死亡率。二者死亡率分別為40％、50％并且明顯的延長死亡時間(P＜0.01，P＜0.05)。莽草酸100mg/lg，10mg/kg組作用不明顯。5.莽草酸對凝血時間的影響實驗材料(1)動物昆明種雄性小鼠，體重25～30g，由北京醫(yī)科大學(xué)實驗動物供應(yīng)部提供，合格證編號(京動字)第8806M038。(2)藥品受試藥莽草酸純品由本校藥化研究室郭亞健教授提供、使用時用0.2N NaOH調(diào)pH后加適量生理鹽水新鮮配制。方法與結(jié)果1.莽草酸肌注對小鼠凝血時間的影響(玻片法)取雄性小鼠48只，隨機分成4組，給藥組分別注射肌肉注射莽草酸溶液200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg、對照組給等容量生理鹽水。30分鐘后，用于術(shù)在距小鼠尾尖1cm處迅速剪斷，擠一滴血在干凈的載玻片上，血滴直徑約5mm，并立即用秒表計時。2分鐘后每隔30秒用清潔大頭針自血滴邊緣向里輕輕撥動一次，觀察有無血絲生成，有血絲挑起時即為凝血時間。結(jié)果見表6，
表6莽草酸肌肉注射對小鼠凝血時間的影響(玻片法)組別 劑量動物數(shù) 凝血時間(mg/kg)(只) (X±SD)對照組等容量12 255±60.7莽草酸組200 12 257±71.0莽草酸組100 12 385±62.4***莽草酸組50 12 360±15.3***注***P＜0.001結(jié)果顯示和對照組相比，莽草酸肌注100mg/kg組、50mg/kg組顯著延長凝血時間(P＜0.001，P＜0.001)。200mg/kg組作用不明顯。2.莽草酸肌注對小鼠凝血時間的影響(毛細管法)取雄性小鼠80只，體重25～30g、隨機分為4組，給藥組分別肌注莽草酸溶液100mg/kg、50mg/kg，川芎嗪組肌注川芎溶液100mg/kg。對照組給等量生理鹽水。30分鐘后取一根毛細玻管(長10cm，內(nèi)徑1mm)，插入小鼠內(nèi)眥球后靜脈叢，深4～5mm自血液注滿管腔后開始計時，取出毛血玻管，水平放置、2分鐘后每隔30秒折斷毛細管兩端0.5cm，并緩慢拉開，觀察是否有凝血絲出現(xiàn)，有凝血絲出現(xiàn)時即為凝血時間。結(jié)果見表7。
表7莽草酸肌肉注射對小鼠凝血時間的影響(毛細玻管法)組別 劑量動物數(shù)凝血時間(mg/kg) (只) (X±SD)對照組等容量 20199.5±38.04莽草酸組 1000 20244.5±46.98**莽草酸組 50 20240.0±38.93**川芎嗪組100 20247.5±51.39**注**P＜0.01結(jié)果表明和對照組相比，莽草酸100mg/kg組延長凝血時間作用顯著(P＜0.01，p＜0.001)，作用和川芎嗪相似，二者相比組間無顯著差異。3.莽草酸對凝血時間的影響量效關(guān)系觀察實驗材料(1)動物昆明種小鼠，體重18～22g，由北京醫(yī)科大學(xué)實驗動物供應(yīng)部提供，合格證編號(京動字)第8806M038。(2)受試藥莽草酸純品由本校藥化教研室郭亞健教授提供，每日注射前現(xiàn)配現(xiàn)用，溶液用0.5N NaOH調(diào)pH至6.5～7.0。方法與結(jié)果小鼠80只，按體重隨機分為4組莽草酸8mg/kg、40mg/kg、200mg/kg(劑量比為1∶5∶25)和正常對照組，給藥組每日腹腔注射給藥一次，對照組給予等容量的生理鹽水，連續(xù)18天，分別于給藥第4天、第8天、第11天、第15天和第18天時，用毛細管從小鼠眼球靜脈叢取血，每隔15秒折斷毛細管一次，檢查有無血液凝固出現(xiàn)，記錄取血至凝血時間，并進行組間統(tǒng)計。結(jié)果見表8。
表8莽草酸對小鼠凝血時間量效關(guān)系觀察組別 劑量 凝血時間(S，X±SD)(mg/kg)給藥4天 8天 11天 15天 18天對照組 - 98.8±15.1 101.2±40.5 92.6±37.4 103.1±85 103.1±19.9莽草酸 8 113.5±26.4 90.2±31.4 75.1±27.4 79.2±25.5 80.0±27.0莽草酸40 158.3±19.3 121.5±34.1 144.9±46.2 161.6±21.1279.5±84.0莽草酸 200 177.0±76.1 126.8±32.8 104.9±27.2 139.4±33.4216.3±42.0表8結(jié)果表明，莽草酸8mg/kg，對凝血時間無明顯影響。40mg/kg從給藥4天至第18天，均使小鼠凝血時間延長，作用相對穩(wěn)定，未發(fā)現(xiàn)隨用藥天數(shù)增加而作用增強的明顯趨勢，200mg/kg劑量組作用并不強于40mg/kg，因而未見明顯量效關(guān)系，該結(jié)果有待進一步重復(fù)論證。小結(jié)莽草酸有抗血栓形成作用，在劑量25mg/kg～400mg/kg的劑量范圍內(nèi)靜脈注射，可減輕大鼠動、靜脈環(huán)路血栓的濕重、干重、抑制率在52％～77％之間，也抑制靜脈血栓形成，減輕結(jié)扎下腔靜脈所形成的血栓的干重和濕重。莽草酸50mg/kg～200mg/kg靜注可對抗凝血酶、ADP和腎上腺素混合液所致的急性小鼠肺栓塞、降低死亡率、延長死亡時間。莽草酸50mg/kg、100mg/kg和200mg/kg肌注可使小鼠凝血時間延長，但未見明顯量效關(guān)系。實驗例2 莽草酸鎮(zhèn)痛作用實驗研究1.莽草酸鎮(zhèn)痛作用觀察(1)小鼠熱板法實驗材料I.動物昆明種小鼠雌性體重18～22g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所繁育場提供，合格證號(京動字)M139290號。II.受試藥莽草酸由本校藥化教研室郭亞健教授提供，使用用生理鹽水配制，并用0.5N NaOH調(diào)pH至7.0，供肌注用；延胡索乙素注射液，廣西飲州地區(qū)制藥廠生產(chǎn)，批號9401001。III.儀器熱板法測痛閾裝置(小型三用水箱，北京西城區(qū)醫(yī)療器械廠；鉛盒、秒表、溫度計)。方法和結(jié)果A.將小鼠置于55°I0.5°恒溫水浴熱板上，記錄添后足的潛伏期為痛閾反應(yīng)時間，大于30″的棄去不用、取痛閾合格小鼠60只，稱重后隨機分為5組，生理鹽水對照組，莽草酸50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg組，陽性對照藥延胡索乙素15mg/kg組，給藥途徑采用肌肉注射，容量為0.1ml/20g，并于給藥前、給藥后60’、120’、180’、240’、360’痛閾時間，與對照組進行組間t檢驗，與給藥前比較有否顯著性差異，結(jié)果見表9。
表9莽草酸對小鼠熱板法致痛的影響組別 劑量動物數(shù) 給藥前 痛閾時間(X±SD)(mg/kg) (只) 給藥后60’ 120’ 180’240’ 360’生理鹽水 200 12 16.60±2.12 15.79±4.78 20.10±6.00 21.61±8.2220.27±5.57 20.25±5.47莽草酸 200 12 17.27±5.14 33.98±18.26**39.47±20.04**31.72±13.98*43.8±32.52*29.82±12.70*莽草酸 100 12 20.18±4.39 21.65±8.34*35.33±23.29*20.12±5.0540.96±28.68*26.80±11.09莽草酸 50 12 16.25±3.85 23.25±5.64**27.32±9.11△△△ 28.50±16.54△ 24.73±6.13△△△ 21.02±10.12延胡索乙素 15 12 18.46±3.88 31.38±11.30***36.97±14.13 34.48±21.15 34.10±19.14 30.12±16.12***，**和*與對照組比較P＜0.001，P＜0.01和P＜0.05△△△，△△和△與給藥前比較P＜0.001，P＜0.01和P＜0.05B.取葡萄閾合格小鼠60只，分組及給藥方法同A，于給藥后15’、30’、60’、120’和180’測小鼠痛閾時間，統(tǒng)計給藥組與對照組之間，給藥后與給藥前有否顯著差異。結(jié)果見表10。
表10莽草酸對小鼠熱板法致痛的影響組別 劑量 動物數(shù) 給藥前 痛閾時間(X±SD)(mg/kg)(只) 給藥后15’ 30’60’120’ 180’生理鹽水 200 12 16.58±4.2713.70±3.63 15.56±5.49 15.66±5.9217.00±7.18 16.88±7.37莽草酸 200 11 14.47±2.8317.07±6.33 13.87±3.53 20.13±740△ 19.82±4.21△△△*29.73±17.61*莽草酸 100 12 16.577±3.99 17.31±752 17.25±5.90 21.81±5.20△*26.27±10.5219.37±5.84莽草酸 50 12 15.40±2.8318.89±7.13 18.10±6.25 25.68±9.17△△**29.51±14.52△△**29.68±12.64△△△**延胡索乙素 60 12 19.14±3.8040.55±16.56***43.82±15.88***46.3±16.99***34.81±19.51*32.70±18.74*備注***，**和*與生埋鹽水比較P＜0.001，P＜0.01和P＜0.05△△△，△△和△與給藥前比較P＜0.001，P＜0.01和P＜0.05熱板法實驗證明，莽草酸50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg均有鎮(zhèn)痛作用，作用明顯時間為1h，司持續(xù)4～6h。作用起效時間慢于延胡索乙素，但持續(xù)時間明顯長于延胡索乙素。C.口服給藥莽草酸對小鼠熱板法的作用取小鼠70只，隨機分為7組(見表11)灌胃給予不同劑量的莽草酸式阿斯匹林給藥后1h、2h、3h、4h時測痛閾，結(jié)果見表11。
表11莽草酸對小鼠熱板法致痛的影響(X±SD)藥物 動物 給藥前小鼠 給藥后不同時間小鼠痛(S)及劑量 數(shù)痛閾(S)1h2h 3h 4h對照組 10 12.3±2.113.9±7.6 14.8±7.3 20.5±7.9 15.5±9.5莽草酸0.6g/kg組 10 15.0±2.841.4±17.1△△**23.9±7.7△△*20.6±9.1△△ 17.1±5.0莽草酸0.4g/kg組 10 14.6±3.319.4±7.3 18.7±7.4 31.6±9.5**22.3±9.5△莽草酸0.2g/kg組 10 12.6±3.915.2±4.2 20.2±8.4△△ 24.7±11.9△△ 27.8±9.3△△莽草酸0.1g/kg組 10 16.1±2.916.3±4.4 14.7±4.1 18.6±5.2 21.8±8.3阿司匹林0.4g/kg組 10 11.0±2.814.0±4.4 20.1±10.9△14.5±5.2 20.0±10.1△阿司匹林0.2g/kg組 10 16.1±3.720.5±4.8△*18.9±3.0**26.0±11.1 28.7±7.7△△**注與對照組相比*P＜0.05，**P＜0.01與給藥前相比△P＜0.05△△P＜0.01結(jié)果表明莽草酸口服0.6g/kg、0.4g/kg、0.2g/kg有一定鎮(zhèn)痛作用，從劑量看作用所需劑量比肌注要大。(2)小鼠醋酸扭體法實驗材料I.動物昆明種小鼠雌雄各半，體重18～22g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所繁育場提供，合格證號(京動字)N139290號。II.藥品莽草酸純品由本校藥化教研室郭亞健教授提供，現(xiàn)用現(xiàn)配，溶于生理鹽水中，用0.5N NaOH調(diào)pH＝7，作為肌注用；冰醋酸為分析純，北京化工廠產(chǎn)品；延胡索乙素注射液，廣西柳州地區(qū)制藥廠生產(chǎn)，批號9401001。實驗結(jié)果a.取小鼠100只、雌雄各半，稱重后隨機分為5組；生理鹽水組、莽草酸200g/kg、100g/kg、80g/kg組，延胡乙素15mg/kg。各組按劑量肌注給藥，1h后腹腔注射0.6％醋酸溶液0.1mg/10g，記錄0’～10’、10’-20’時間內(nèi)小鼠扭體次數(shù)，并進行組間顯著性比較，結(jié)果見表12。
表12結(jié)果表明，肌注莽草酸200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg均能減少小鼠扭體次數(shù)，其中200mg/kg和50mg/kg劑量作用非常顯著，延胡索乙素15mg/kg也有類似作用。b.取小鼠86只，雌雄各半，按表12分組，并灌胃給藥，其余方法同實驗a.結(jié)果見表13表13結(jié)果表明，小鼠口服給予莽草酸0.6mg/kg、0.4mg/kg、0.2mg/kg和0.1mg/kg對醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)有明顯對抗作用，說明鎮(zhèn)痛作用較強，與阿斯匹林0.2mg/kg，氯唑沙宗片0.2g/kg的作用相似。
表12莽草酸對小鼠醋酸致痛的影響組別劑量動物數(shù) 相體次數(shù)(X±SD)mg/kg(只) 0’～10’ 10’～20’生理鹽水 200 1928.57±13.8632.78±10.80莽草酸 200 2016.10±8.35**21.25±10.72**莽草酸 100 2124.00±11.9027.19±12.37莽草酸50 1918.52±7.13**21.94±10.54**延胡索乙素15 1915.21±12.0015.21±11.67***備注，和與生理鹽水比較P＜0.001，P＜0.01和P＜0.605
表13莽草酸對醋酸致小鼠扭體的影響(X±SD)藥物 動物 扭體反應(yīng)給醋酸后不同時間小鼠扭體次數(shù)及劑量 數(shù) 潛伏期 0～10min 10～20min對照組 18 298.3±143.7 19.9±13.5 28.7±9.6莽草酸0.6/kg組10 586.0±310.2 7.2±8.19.0±7.1莽草酸0.4g/kg組 10 394.3±92.8*5.9±3.6**9.7±3.9**莽草酸0.2g/kg組 10 584.9±385.9*6.9±9.0*9.0±9.1**莽草酸0.1g/kg組 10 671.2±391.4**3.9±8.7*7.5±7.4**阿司匹林片0.1g/kg組 10 338.6±98.1 5.6±2.8**10.3±.3**氯唑沙宗片0.2g/kg組 18 369.7±172.9 7.4±6.0**12.1±2.3**注與對照組相比*P＜0.05，**P＜0.01(3)大鼠光輻射熱甩尾法實驗材料I.動物Wistar種，雄性，體重150～220g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所繁育場提供，合格證編號為(京動字)第9209-R018號。II.受試藥莽草酸由本校藥化教研室郭亞健教授提供，用生理鹽水配制，并用0.5N NaOH調(diào)pH至70，供肌注，延胡索乙素注射液，廣西飲州地區(qū)制藥廠生產(chǎn)，批號9401001。III.儀器熱輻射測定痛閾裝置，由本校儀器維修室自制，本教研室監(jiān)制。實驗方法a.取雄性大鼠50只，隨機分為5組，每只大鼠在其尾部外1/3處先以75％酒精擦去皮脂，抹上炭索墨水，以18V穩(wěn)壓電流下的鹵燈通過聚焦后照射在大鼠尾部涂黑處，記錄甩尾潛伏期，小于30＂為合格，測其基礎(chǔ)閾值后，各組小鼠分別肌肉注射生理鹽水、莽草酸200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg延胡索乙素15mg/kg。分別于給藥后30’、60’、120’和180’測定大鼠甩尾潛伏期，并進行組間比較。結(jié)果見表14。b.取雄性大鼠60只，隨機分為6組(見表15)口服給藥各劑量外，給藥后1h、2h、3h、5h時測定痛閾反應(yīng)，方法同實驗a結(jié)果見表15。
表14莽草酸對大鼠光輻射致痛的影響組別 劑量 動物數(shù) 給藥前 痛閾時間(X±SD)(mg/kg) (只) 給藥后30’60’ 120’180’生理鹽水 200 10 6.81±2.44 3.40±0.983.88±1.5 23.63±1.972.57±0.58莽草酸 200 10 7.49±3.08 8.99±5.02**10.49±4.2 39.26±6.44*8.28±4.70**莽草酸 100 10 6.82±1.89 4.89±2.037.9±4.10 6.27±4.00 4.50±1.62**莽草酸 50 10 6.69±2.19 8.11±3.00***7.28±3.09**8.69±4.89**5.92±4.32*延胡索乙素 15 10 6.67±3.21 6.69±8.60***15.29±6.20***5.51±2.25 3.70±2.65備注***，**和*與生理鹽水比較P＜0.001，P＜0.01和P＜0.05表14結(jié)果表明生理鹽水對照組大鼠多次輻射致痛后，對痛反應(yīng)敏感，甩尾時間在2.57秒～3.88秒之間，肌注莽草酸200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg，均有鎮(zhèn)痛作用，與同時間生理鹽水組比較有顯著性差異(P＜0.05、P＜0.01和P＜0.001)。作用強度弱于延胡索乙素，但持續(xù)時間長。
表15莽草酸對大鼠輻射刺激甩尾反應(yīng)的影響(X±SD)藥物 動物 給藥前小鼠 給藥后不同時間小鼠痛(S)及劑量數(shù) 痛閾(S) 1h2h 3h 4h對照組10 7.6±24 62±3.7 5.6±26 7.8±4.4 9.1±6.8莽草酸0.4g/kg組 10 8.5±3.015.4±5.0△△**15.6±5.1△△**10.0±4.6 7.7±5.1莽草酸0.2g/kg組 10 7.5±2.913 5±5.0△△**8.2±5.8 10.7±6.2 8.8±6.8莽草酸0.1g/kg組 10 7.2±3.68.5±4.1 7.7±4.6 8.7±4. 6 5.9±4.9阿司匹林0.4g/kg組 10 7.5±2.812.6±5.6△△**13.4±5.2△△**12.9±5.3△ 5.5±2.1阿司四林02g/kg組 18 6.4±3.419.0±3.3△**15.3±5.1△△**12.3±6.3△*8.3±6.6注與對照組相比*P＜0.05，**P＜0.01與給藥前相比△P＜0.05△△P＜0.01表15結(jié)果證明莽草酸口服給藥0.4mg/kg、0.2mg/kg、0.1mg/kg均可使痛閾反應(yīng)時間延長，其中0.4mg/kg和0.2mg/kg劑量組與對照組比較，具有顯著性差異。作用與阿斯匹林，氯唑沙宗片相似，組間無顯著性差異。小結(jié)小鼠熱板法、小鼠醋酸扭體法、大鼠輻射熱致痛法證明，莽草酸50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg肌肉注射和口服給藥具有明顯鎮(zhèn)痛作用，作用時間可維持6小時以上，作用強度與阿斯匹林、氯唑沙宗片相似，注射給藥作用弱于胡索乙素，但作用時間長于延胡索乙素。2.莽草酸鎮(zhèn)痛特點研究實驗材料I.動物Wistar種雄性大鼠，體重180～220g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所繁育場提供，合格證編號為(京動字)第9209-R018號；昆明種雄性小鼠，體重18～22g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院研究所繁育場提供，合格證號(京動字)M139290號。II.藥品受試藥莽草酸由本校藥化教研室郭亞健教授提供，用生理鹽水配制，0.5N NaOH調(diào)pH至7.0供肌注用；戊巴比妥鈉，中國醫(yī)藥公司北京采購站進口分裝；醋酸潑尼松片天津力生制藥廠產(chǎn)品，批號940806；啤酒酵母北京啤酒廠生產(chǎn)；安痛定大同市惠達制藥廠產(chǎn)品，批號921229。III.儀器MK-ANIMEX小鼠自主活動儀，日本產(chǎn)。方法與結(jié)果(1)莽草酸與戊巴比妥鈉的協(xié)同試驗；取雄性小鼠40只，隨機分成4組(見表16)，各組按劑量肌肉注射，5’后腹腔注射戊巴比妥鈉30mg/kg，以翻正反射消失與重現(xiàn)之間的時間為睡眠時間，觀察組間有否差異性。見表16。
表16莽草酸對戊巴比妥鈉催眠的影響組別劑量 動物數(shù) 翻正反射消失數(shù)睡眠時間(X+S)mg/kg (只) (只) (分)生理鹽水+戊 20010 733.43+18.04莽草酸+戊20010 841.75±28.27莽草酸+戊10010 826.63±11.07莽草酸+戊50 10 745.43±3.68
上述結(jié)果表明，莽草酸對戊巴比妥鈉的催眼作用無明顯的協(xié)同或拮抗作用。(2)莽草酸對小鼠自主活動的影響取小鼠110只，雌雄各半、隨機分為5組、分別肌注生理鹽水，莽草酸200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg延胡索乙素15mg/kg，于給藥后60’、180’、360’小鼠自主活動儀中觀察6’內(nèi)小鼠自主活動情況，結(jié)果見表17表17莽草酸對小鼠自主活動的影響組別劑量 動物數(shù) 自主活動次數(shù)(6’)(X+S)(mg/kg) (只) 1h 3h 6h生理鹽水 200 22741.50±144.60559.36±167.09592.00±119.07莽草酸 200 22743.36±126 89551.00±173.47529.32±160.87莽草酸 100 22786.41±58.75 594.23±130.47586.91±78.40莽草酸50 22733.73±54.66 581.86±145.26524.95±169.85延胡索乙素15 22618.00±151.52528.23±117.83586.91±103.84上述結(jié)果表明，肌注莽草酸200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg與生理鹽水組比較，小鼠自主活動次數(shù)無明顯差異，而給延胡索乙素組在60’時能明顯地減少小鼠活動，且數(shù)值與生理鹽水組比較存在顯著性差異，180’時恢復(fù)正常，說明肌注莽草酸對中樞無抑制或興奮作用。(3)莽草酸解熱作用觀察——對啤酵母法致發(fā)熱大鼠的影響取雄性大小50只，按體重，隨機分5組，測過正常測溫后背部皮下注射10％啤酒酵母的生理鹽水混懸液，5h后測肛溫，升高1℃左右，肌注生理鹽水，莽草酸200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg及腹腔注射陽性對照藥安痛定0.15mg/100g，于給藥后1h、2h、3h、5h測肛溫，統(tǒng)計組間顯著性差異，結(jié)果見表18。
表18莽草酸對啤酒酵母致大鼠體溫升高的影響組別 劑量 動物數(shù) 基礎(chǔ) 給藥后體溫(X+S)(mg/kg) (只) 體溫 給藥前1h 2h 3h 5h生理鹽水 200 1037.10±0.61 38.32±0.61 39.28±0.24 38.31±0.5238.07±0.48 37.34±0.62莽草酸 200 1037.23±0.59 38.40±0.67 38.26±1.02**37.56±0.67*37.47±0.41 37.1±0.71莽草酸 100 1037.02±0.63 38.44±0.52 37.22±1.01***37.83±0.6237.40±0.43 36.88±0.69莽草酸 50 1037.16±0.73 38.17±0.63 37.95±0.96***37.58±0.78*37.92±0.54 37.16±0.59安痛定 105 1037.10±0.61 38.72±0.63 36.45±0.85***36.71±0.83***37.02±0.61 37.10±0.69備注***，**和*與生理鹽水組比較P＜0.001，P＜0.001和P＜0.05
上述結(jié)果表明，肌注莽草酸的三個劑量組在1h、2h、3h均能明顯地降低啤酒酵母所致的大鼠體溫升高，其中陽性對照安定給藥1h作用明顯，2h、3h時體溫持續(xù)回升，而給藥組的體溫則繼續(xù)下降，說明肌注莽草酸對啤酒酵母所致的大鼠發(fā)熱有解熱作用。(4)莽草酸抗炎作用觀察——對角叉菜膠致大鼠足腫脹的影響取雄性大鼠50只，體重180～2200g，隨機分為5組，肌注生理鹽水，莽草酸200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg，口服給陽性對照藥強的松的CMC-Na混懸液40mg/kg，1h后左后足部皮下注射1％角叉菜膠0.01mg/kg，測定給角叉菜膠后60’、180’、300’、360’大鼠足趾部周長，計算腫脹度，統(tǒng)計結(jié)果表19。
表19莽草酸對角菜膠大鼠足腫脹的影響組別 劑量給藥動物數(shù) 足腫脹度(X±S)mg/Kg方式 (只) 1h 3h 5h6h生理鹽水 200 肌注 10 0.355±0.1160.671±0.1600.0945±0.239 0.855±0.202莽草酸200 肌注 10 0.180±0.063**0.565±0.1180.770±0.230.855±0.176莽草酸100 肌注 10 0.280±0.1490.778±0.2390.785±0.207 0.85±0.211莽草酸50 肌注 10 0.165±0.136**0.565±0.164*0.705±0.248*0.85±0.169強的松40 口服 10 0.165±0.120**0.300±0.150***0.595±0286**0.575±0.278**備注***，**和*與生理鹽水組比較P＜0.001、P＜0.01、P＜0.05表18結(jié)果表明，肌注莽草酸200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg對角叉菜膠所致大鼠急性炎性足腫脹有對一定抗作用，在給藥1h時200mg/kg、50mg/kg作用較顯著。小結(jié)莽草酸鎮(zhèn)痛作用特點研究結(jié)果說明，在鎮(zhèn)痛的劑量范圍內(nèi)，無中樞抑制作用，有一定解熱作用和抗炎作用。
實施例1莽草酸25克糖粉 22克淀粉 43克10％淀粉漿適量硬脂酸鎂0.5克制成1000片將莽草酸、糖粉分別粉碎、過篩、混合均勻，加淀粉漿攪勻，加入淀粉漿的量以達到適合于制粒的程度為宜，用16目尼龍篩制粒，60℃干燥，加硬脂酸鎂混勻，壓片，每片含莽草酸25毫克。
實施例2莽草酸25克氯化鈉9克注射用水加至1000毫升取注射用水800毫升，加入氯化鈉攪拌溶解，再加入莽草酸使之溶解，再加水至足量，攪拌，過濾，灌封，100℃流通蒸汽30分鐘滅菌，即得。
權(quán)利要求
1.一種抗血栓和鎮(zhèn)痛藥物，其特征在于該藥物含有1％-99％重量份的莽草酸及其衍生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所說的抗血栓和鎮(zhèn)痛藥物，其特征在于該藥物含有10％-80％重量份的莽草酸及其衍生物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所說的抗血栓和鎮(zhèn)痛藥物，其特征在于該藥物含有20％-60％重量份的莽草酸及其衍生物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所說的抗血栓和鎮(zhèn)痛藥物，其特征在于該藥物含有25％重量份的莽草酸及其衍生物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-5中的任一權(quán)利要求所說的抗血栓和鎮(zhèn)痛藥物，其特征在于所述的莽草酸衍生物是三乙酰莽草酸。
6.莽草酸及其衍生物在制備具有抗血栓形成作用的藥物中的應(yīng)用。
7.莽草酸及其衍生物在制備具有鎮(zhèn)痛作用的藥物中的應(yīng)用。
8.根據(jù)根據(jù)權(quán)利要求6或7所說的莽草酸及其衍生物的應(yīng)用，其特征在于所述的莽草酸衍生物是三乙酰莽草酸。
9.三乙酰莽草酸在制備對抗血栓形成和鎮(zhèn)痛作用具有加強作用的藥物中的應(yīng)用。
10.三乙酰莽草酸在制備具有溶解血栓作用的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及以莽草酸及其衍生物為活性成分的藥物制劑。本發(fā)明還涉及莽草酸及其衍生物的藥物新用途，具體講是莽草酸以及莽草酸三乙酰衍生物(SA-2)在制備具有抗血栓形成和鎮(zhèn)痛作用藥物中的應(yīng)用。
文檔編號A61P7/02GK1163104SQ9710044
公開日1997年10月29日 申請日期1997年2月3日 優(yōu)先權(quán)日1997年2月3日
發(fā)明者牛建昭, 孫建寧, 郭亞健, 徐秋萍, 楊春澍 申請人:北京中醫(yī)藥大學(xué)