專利名稱：使用功能性屏障治療和修復(fù)軟骨或骨缺損或損傷的方法及組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及軟骨缺損或損傷及軟骨和骨全方位缺損(full-thicknessdefect)或損傷的治療和修復(fù)。更特別地，本發(fā)明涉及治療軟骨和骨缺損或損傷(本文中可以互換使用)的方法，并涉及軟骨修復(fù)組合物，該組合物包含含有抗血管生成劑的基質(zhì)，其中抗血管生成劑作為“功能性屏障”以防止血管從下面的骨組織長入新的軟骨組織。軟骨修復(fù)組合物也可含有一種或多種增殖劑和轉(zhuǎn)化因子以促進軟骨修復(fù)細胞的增殖和轉(zhuǎn)化以形成新的堅固的軟骨組織。也可用骨修復(fù)組合物治療全方位缺損的骨部分，骨修復(fù)組合物包含含有血管生成因子和骨生成因子的基質(zhì)以刺激血管和骨的形成。本發(fā)明的組合物和方法在治療嚴重骨關(guān)節(jié)炎和其它產(chǎn)生軟骨和骨損傷的疾病和創(chuàng)傷中發(fā)現(xiàn)的全方位損傷中特別有用。使用其它抗組織因子作為功能屏障的本發(fā)明的其它組合物和方法在治療諸如牙周疾病中的其它損傷和缺損時，在需要抑制或延緩某些組織生長的地方有用。
背景技術(shù)：
關(guān)節(jié)是骨架中骨骼聯(lián)接的一般方式之一。正常關(guān)節(jié)聯(lián)接的骨骼的末端由關(guān)節(jié)軟骨組織覆蓋，這可以使骨骼間無摩擦地相互運動[L.Weiss編輯，細胞與組織生物學(xué)(Munchen:Urban和Schwarzenburg,1988)第247頁]。
關(guān)節(jié)軟骨以特定結(jié)構(gòu)組成為特征。它由包埋在胞間物質(zhì)(在文獻中通常稱為“軟骨基質(zhì)”)中的特定細胞(軟骨細胞)構(gòu)成，其中胞間物質(zhì)富含蛋白聚糖(主要為Ⅱ型膠原原纖維)、其它蛋白質(zhì)和水[Buckwalter等，“關(guān)節(jié)軟骨損傷與修復(fù)”，于肌肉骨骼軟組織的損傷和修復(fù)(Park Ridge,I11:American Academy of Orthopaedic Surgeons Symposium,1987)，第465頁]。軟骨組織既不受神經(jīng)支配，也沒有血管或淋巴系統(tǒng)穿過。但是在成年人的成熟關(guān)節(jié)中，在骨組織與軟骨之間形成細窄連續(xù)板塊，此骨板下面的軟骨下骨組織受神經(jīng)支配并有血管形成。在此骨板下，骨組織形成含有骨髓的小梁。在未成熟的關(guān)節(jié)中，關(guān)節(jié)軟骨只襯有原始的骨小梁。關(guān)節(jié)中的半月板組織部分也由軟骨構(gòu)成，其組成與關(guān)節(jié)軟骨相似[Beaupre,A.等，Clin.Orthop.Rel.Res.第72-76頁，(1986)]。
在軟骨表面可識別兩種類型的缺損，即全方位缺損和表面缺損。這兩種缺損的區(qū)別不僅在于對軟骨物理損傷的程度，而且在于每種損傷所能引起的修復(fù)應(yīng)答的性質(zhì)。
關(guān)節(jié)表面的全方位缺損包括對透明軟骨、鈣化軟骨及含血管和骨髓的軟骨下骨組織的損傷。對骨組織的損傷包括骨組織中的裂縫到更大的缺隙。由于骨板含有感覺神經(jīng)末梢，所以全方位損傷會引起劇烈疼痛。這種缺損一般由嚴重創(chuàng)傷引起或者在退化性關(guān)節(jié)疾病，如骨關(guān)節(jié)炎的晚期產(chǎn)生。全方位缺損有時可能導(dǎo)致出血并且誘導(dǎo)來自軟骨下骨組織的修復(fù)反應(yīng)[Buckealter等，“關(guān)節(jié)軟骨組合物、結(jié)構(gòu)、對損傷的反應(yīng)和促進修復(fù)的方法”關(guān)節(jié)軟骨和膝關(guān)節(jié)功能基礎(chǔ)科學(xué)和關(guān)節(jié)鏡檢查(New York:Raven出版社，1990)第19-56頁]。所形成的修復(fù)組織是血管化的纖維性類型軟骨，其生物力學(xué)性能不足，并且不能長期保留[Buckwalter等，(1990)，同上]。
關(guān)節(jié)軟骨組織的表面缺損只限于軟骨組織本身。這種缺損非常麻煩，因為它們不能治愈并且不引起修復(fù)反應(yīng)。
表面缺損可以表現(xiàn)為軟骨表面的裂隙、削起或裂口，或者在受侵襲的組織中具有“螃蟹肉”外觀。它們沒有象全方位缺損中可見的出血(血斑)。表面缺損可能的起因未知，但它們通常由導(dǎo)致軟骨組織磨損的機械錯位引起。機械錯位可能由關(guān)節(jié)創(chuàng)傷例如撕裂的半月板組織移位至關(guān)節(jié)中、半月板切除術(shù)、韌帶撕裂引起關(guān)節(jié)松弛、關(guān)節(jié)排列不齊或骨折引起，或由遺傳性疾病引起。表面缺損還具有退化性關(guān)節(jié)疾病，例如骨關(guān)節(jié)炎早期的特征。由于軟骨組織不受神經(jīng)支配[Ham′S Histology(第9版)(Philadelphia:J.B.Lippincott公司.1987)，第266-272頁]或由于非血管化，所以表面缺損沒有痛苦。盡管沒有痛苦，但是表面缺損無法治愈并且經(jīng)常轉(zhuǎn)為全方位缺損。
一般認為，由于關(guān)節(jié)軟骨缺少血管系統(tǒng)，損傷的軟骨組織得不到足夠的或適當?shù)拇碳ひ砸鹦迯?fù)應(yīng)答[Webber等，“兔半月板纖維軟骨的體內(nèi)修復(fù)能力一種細胞培養(yǎng)模式”，(30th Ann.Orthop.Res.Soc.,Atlanta,1984年2月)；Webber等，J.Orthop.Res.,3，第36-42頁(1985)]?？梢酝评恚Ｇ闆r下軟骨組織中的軟骨細胞不能與足量的通常存在于損傷的血管化組織中的修復(fù)刺激劑如生長因子和血纖維蛋白凝塊接觸。
一種用來將損傷的軟骨組織與修復(fù)刺激素接觸的方法，涉及通過軟骨鉆入或刮至軟骨下的骨組織以引起出血[Buckwalter等，1990.同上]。不幸的是，組織針對這樣的外科手術(shù)創(chuàng)傷的修復(fù)應(yīng)答通常與引起出血的全方位缺損中所觀察到的自然發(fā)生的應(yīng)答相同，都形成生物力學(xué)性能不足并且不能長期保留的纖維性類型軟骨[Buckwalter等，(1990)同上]。
已有各種生長因子得到分離，目前已可供研究和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用[見例如rizzino,A.,Dev.Biol.130，第411-422頁(1988)]。已有報導(dǎo)，這些生長因子中的一些如轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)能在體外促進大鼠胚胎間充質(zhì)細胞中的軟骨特異分子，如Ⅱ型膠原蛋白和軟骨特異的蛋白聚糖的形成[例如Seyedin等，美國國家科學(xué)院院報，82，第2267-2671頁(1985)；Seyedin等，生物化學(xué)雜志，261，第5693-95頁(1986)；Seyedin等，生物化學(xué)雜志，262，第1946-1949頁(1987)]。
而且，已鑒定了一些明顯刺激骨形成的蛋白因子。這些骨生成因子包括骨形態(tài)建成蛋白，成骨素，骨生成蛋白(BOP),TGF-β，和重組的骨誘發(fā)蛋白。
已有無數(shù)患者被診斷為患有骨關(guān)節(jié)炎，即在他們的關(guān)節(jié)軟骨中有退化性缺損或損傷。然而，盡管有各種方法聲稱可以在損傷的軟骨中引起修復(fù)應(yīng)答，但是這些治療方法都沒有得到實際應(yīng)用[Buckwalter等(1990)，同上；Knutson等，J.Bone and Joint Surg.,68-B，第795頁(1986)；Knutson等，J.Bone and Joint Surg.,67-B，第47頁(1985)；Knutson等，Clin.Orthop.,191，第202頁(1984)；Marquet,Clin.Orthop.,146，第102頁(1980)]。而且這些治療方法一般只提供暫時緩解。也有報導(dǎo)，可系統(tǒng)使用“軟骨保護劑”以抑制骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展并緩解疼痛。但是這些保護劑沒有表現(xiàn)出能促進軟骨組織損傷或缺損的修復(fù)。
到目前為止，對患骨關(guān)節(jié)炎病人的治療主要是通過使用止痛藥和消炎藥緩解癥狀。因為沒有治療能引起關(guān)節(jié)軟骨表面缺損的修復(fù)，所以軟骨經(jīng)常磨損到軟骨下的骨板。在疾病的這一階段即嚴重骨關(guān)節(jié)炎階段，持續(xù)疼痛和顯著功能衰退經(jīng)常導(dǎo)致整個關(guān)節(jié)被切除并被金屬和/或塑料的人工關(guān)節(jié)替換。目前每年在膝和髖部進行50萬例包括關(guān)節(jié)切除與人工關(guān)節(jié)移殖的手術(shù)。[見例如Graves,E.J.,“1988 Summary；National HospitalDischarge Survey”,Advanced Data From Vital and Health Statistics,185，第1-12頁，(1990年6月19日)]。
因此需要可靠的治療表面軟骨缺損的軟骨組織和全方位缺損的軟骨和骨組織的方法，全方位缺損例如可見于嚴重關(guān)節(jié)炎病例中。
除了軟骨組織缺損，也有需要改進其它缺損的治療方法。需要改進治療方法的一個領(lǐng)域是牙周組織的修復(fù)和再生。目前，通常使用以膜為基礎(chǔ)的物理屏障來防止不利的分隔空間之間的組織生長，例如在嚴重paradontitis病例中。[見例如，Robet,P.M.和Frank,R.M.,“Peridontal guided tissue regeneration with a new resorbable polyacticacid membrane,”J.Periodonto,65.5，第414-422頁(1994)]。在矯形外科學(xué)的定向的組織再生中也使用物理膜。[見例如，F(xiàn)arso,R.等，“兔的長骨缺損中定向的組織再生”，Acta Orthop,63，第66-69頁(1992)]。然而這些方法不受歡迎，因為這些膜常常不是可生物降解的，所以需要第二次外科手術(shù)介入。另外，可生物降解的物理膜常常與長期持續(xù)的副作用有關(guān)，副作用包括炎癥和慢性異物反應(yīng)，慢性異物反應(yīng)是因為膜的降解產(chǎn)物導(dǎo)致局部慢性炎癥反應(yīng)，以及與此相關(guān)導(dǎo)致周圍組織分化過程的抑制。因此需要改進促進骨組織再生的方法以用于牙周組織和矯形外科修復(fù)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了誘導(dǎo)人和其它動物軟骨或骨損傷修復(fù)的有效治療方法和組合物，從而解決了上面所提到的問題。使用本發(fā)明的方法和組合物也可促進外傷損傷的愈合和骨關(guān)節(jié)炎癥狀的治愈，否則骨關(guān)節(jié)炎將導(dǎo)致有效關(guān)節(jié)功能的喪失，進而可能導(dǎo)致關(guān)節(jié)切除和移殖。
概括地說，本發(fā)明的用于治療表面軟骨缺損或全方位缺損的軟骨部分的方法包括用軟骨修復(fù)基質(zhì)填充缺損的軟骨部分，其中軟骨修復(fù)基質(zhì)含有用于抑制血管向內(nèi)生長的抗血管生成劑如抗侵襲因子、金屬蛋白酶抑制劑或抗血管生成誘導(dǎo)因子的抗體。軟骨修復(fù)基質(zhì)將被摻入動物組織中，并且一般是可生物降解的；它也可以包含增生劑和轉(zhuǎn)化因子。本發(fā)明的軟骨修復(fù)基質(zhì)對于治療全方位缺損和明顯的表面軟骨缺損特別有用，這兩種缺損可能在下面的骨中有裂縫。
在另一實施方案中，本發(fā)明的方法包括加熱處理已出現(xiàn)出血的全方位缺損區(qū)域以產(chǎn)生暫時的組織屏障，然后用軟骨修復(fù)基質(zhì)填充缺損。在此實施方案中，可以從基質(zhì)中省略抗血管生成劑。
在由于大面積骨損傷而必要或需要的情況下，本發(fā)明修復(fù)關(guān)節(jié)中全方位缺損的方法也包括用基質(zhì)填充全方位缺損的骨部分缺損直到骨-軟骨界面，基質(zhì)將被摻入動物組織中，并且一般是可生物降解的。骨修復(fù)基質(zhì)可以包含血管生成因子和骨生成因子。剩下的缺損的軟骨部分用含抗血管生成劑的軟骨修復(fù)基質(zhì)填充到軟骨表面的頂部，其中抗血管生成劑用于抑制血管向內(nèi)生長。軟骨修復(fù)基質(zhì)也可含有增殖劑和轉(zhuǎn)化因子。
使用本發(fā)明的方法治療表面和全方位缺損可以在關(guān)節(jié)鏡檢查、開放式外科手術(shù)或經(jīng)皮膚操作期間實施。根據(jù)本發(fā)明的某些方法，在鑒定全方位缺損之后，可以通過下列步驟治療缺損(1)用包含含有血管生成因子和骨生成因子的基質(zhì)的組合物填充缺損的骨部分，其中血管生成因子和骨生成因子包裝在適當?shù)妮d體系統(tǒng)，例如脂質(zhì)體中；和(2)用包含含有抗血管生成劑和轉(zhuǎn)化因子的基質(zhì)，優(yōu)選地可生物降解的基質(zhì)的組合物填充缺損的軟骨部分，其中抗血管生成劑和轉(zhuǎn)化因子包裝在適當載體系統(tǒng)中。在第二步中，基質(zhì)可以例如通過使用促粘附因子如谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶結(jié)合到全方位缺損的軟骨部分的表面。
用本發(fā)明的方法和組合物也可輔助牙周疾病的治療。例如在治療其中牙周韌帶隱窩和牙頸暴露的疾病如paradontitis時，可以通過用含一種或多種刺激牙周組織形成的因子和一種或多種上皮形成抑制劑的基質(zhì)填充牙周結(jié)締組織間隙來促進牙周結(jié)締組織的再生。
用本發(fā)明的方法和組合物也可促進缺齒后骨的再生。特別地，可以通過用誘導(dǎo)骨生成的可生物降解的基質(zhì)填充缺損區(qū)域來重建上頜骨或下頜骨脊部的骨，其中誘導(dǎo)骨生成的基質(zhì)含有血管生成因子和骨生成因子以及抑制結(jié)締組織細胞遷移和/或增殖和/或分化的抑制劑以促進骨組織的重新生長?？梢栽谘乐芙Y(jié)締組織間隙內(nèi)使用含一種或多種因子的可生物降解的基質(zhì)以刺激牙周組織的形成。
本發(fā)明的方法和組合物也可用來防止例如關(guān)節(jié)移殖后關(guān)節(jié)周的鈣化和骨化，和在患末端骨折的年幼動物和兒童中防止骨長入軟骨生長板。特別地，可以用含抗血管生成因子或抗骨因子的基質(zhì)填充關(guān)節(jié)周結(jié)締組織間隙或軟骨生長間隙以防止鈣化和骨組織的形成。發(fā)明詳述為了能更充分地理解本發(fā)明，下面進行詳細的描述。在描述中使用下列術(shù)語。
血管生成因子——此處所用的是指任何誘導(dǎo)或刺激血管和相關(guān)細胞(如上皮、血管周、間充質(zhì)和平滑肌細胞)及血管相關(guān)基膜形成的肽、多肽、蛋白或其它化合物或組合物。體內(nèi)體外對血管生成因子的檢測方法在本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知[例如Gimbrone,M.A.，等，J.Natl.Cancer Inst.,52，第413-419頁(1974)；Klagsbrum,M.等，癌癥研究，36，第110-113頁(1976)；Cross等，美國國家科學(xué)院院報，80，第2623-2627頁(1983)；Gospodarowicz等，美國國家科學(xué)院院報，73，第4120-4124頁(1976)；Folkman等，美國國家科學(xué)院院報，76，第5217-5221頁(1979)；Zetter,B.R.，自然(倫敦)，285，第41-43頁(1980)；Azizkhan,R.G.等，J.Exp.Med.,152，第931-944頁(1980)]。
抗血管生成劑——此處所用的是指任何具有防止血管從下面骨組織長入軟骨組織生物活性的化合物或組合物，如抗侵襲因子、軟骨衍生的血管生成抑制劑、抗血管抑制素(angiostatin)、金屬蛋白酶抑制劑、抗血管誘發(fā)因子[包括bFGF和上皮細胞血管生成刺激因子(ESAF)]的抗體、蘇拉明(Suramin,GermaninBayer公司，德國)、煙曲霉素、煙曲霉素類似物和AGM-1470[Peacock,D.J.等，細胞免疫學(xué)，160，第178-184頁(1995)]。體內(nèi)體外測定抗血管生成劑的方法在本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知[例如，Moses,M.A.,Clinical & Exptl.Rheumatology,11(Suppl.8)第567-69頁(1993)；Moses,M.A.等，細胞生物學(xué)雜志，119(2)，第475-482頁(1992)；Moses,M.A.等，科學(xué)，248，第1408-1410頁(1990)；Ingber,D.等，自然，348(6)，第555-557(1990)]。
抗組織因子——此處所用的是指任何具有選擇性防止不利的特定組織生長生物活性的化合物或組合物。例如，選擇性抑制上皮形成的抗上皮因子，包括抗上皮抗體、維生素A抑制劑、抗維生素A抗體、抗基膜抗體、表皮生長因子抑制劑、富集纖連蛋白的基質(zhì)、和任何其它抑制上皮細胞增生、生長或分化或上皮形成的因子[見例如，Adams,J.C.和Watt,F.M.,“纖連蛋白抑制人角質(zhì)形成細胞的終末分化”，自然，340，第307-309頁(1989)]；選擇性抑制結(jié)締組織形成的抗結(jié)締組織因子，包括抗結(jié)締組織抗體、抗結(jié)締組織特異生長因子的抗體、抗間充質(zhì)細胞表面蛋白的抗體、和抑制間充質(zhì)細胞增殖的因子；選擇性抑制骨組織形成的抗骨因子，包括抗血管生成因子和抗TGF-β總類的成員的單克隆抗體或多克隆抗體或其組合。
關(guān)節(jié)鏡檢查——此處所用的是指使用關(guān)節(jié)鏡對關(guān)節(jié)進行檢查或進行外科手術(shù)。
骨——此處所用的是指主要包含以羥磷灰石形式沉積的鈣和磷酸的網(wǎng)架、膠原蛋白(主要是Ⅰ型膠原蛋白)和骨細胞如成骨細胞和破骨細胞的鈣化結(jié)締組織。
骨修復(fù)細胞——處此所用的是指當受到適當刺激時，會分化并轉(zhuǎn)化成骨細胞如成骨細胞或骨細胞，繼而形成骨的細胞。骨修復(fù)細胞包括血管周細胞、間充質(zhì)細胞、成纖維細胞、成纖維樣細胞和脫分化的軟骨細胞。
軟骨——此處所用的是指一種結(jié)締組織，該結(jié)締組織含有被胞間物質(zhì)(通常稱作軟骨基質(zhì))包埋的軟骨細胞，其中胞間物質(zhì)包含膠原蛋白(主要是Ⅱ型膠原蛋白和其它較少類型，例如Ⅸ和Ⅺ型的膠原蛋白)的原纖維、各種蛋白聚糖(例如硫酸軟骨素蛋白聚糖、硫酸角質(zhì)素蛋白聚糖和硫酸皮膚素蛋白聚糖)、其它蛋白質(zhì)和水。此處所用的軟骨包括關(guān)節(jié)和半月板軟骨。關(guān)節(jié)軟骨覆蓋關(guān)節(jié)中骨部分的表面并使關(guān)節(jié)在運動時沒有直接的骨-骨接觸，由此防止磨損和破壞相對的骨表面。大部分正常健康的關(guān)節(jié)軟骨也被描述為“玻璃樣的”，即具有獨特的毛玻璃外觀。半月板軟骨常常在受震動和運動的關(guān)節(jié)中發(fā)現(xiàn)。這樣的半月板軟骨定位包括顳下頜關(guān)節(jié)、胸鎖骨關(guān)節(jié)、肩峰鎖骨關(guān)節(jié)、腕關(guān)節(jié)和膝關(guān)節(jié)[Gray′s Anatomy(New York:Bounty Books,1977)]。
軟骨修復(fù)細胞——此處所用的是指當受到適當刺激時，會分化并轉(zhuǎn)化成軟骨細胞的細胞。軟骨修復(fù)細胞包括間充質(zhì)細胞、成纖維細胞、成纖維樣細胞、巨噬細胞和脫分化的軟骨細胞。
細胞粘附促進因子——此處所用的是指任何介導(dǎo)細胞粘附到細胞外物質(zhì)上的化合物或組合物，包括纖連蛋白和其它與四肽一樣小的肽，包括三肽Arg-Gly-Asp[Ruoslathi等，細胞，44，第517-518(1986)]。
趨化劑——此處所用的是指任何能在體外趨化性分析中按標準吸引細胞的化合物或組合物，包括肽、蛋白質(zhì)、糖蛋白和糖胺聚糖鏈[例如wahl等，美國國家科學(xué)院院報，84，第5788-5792(1987)；Postlewaite等，J.Exp.Med.,165，第251-256頁(1987)；Moore等，Int.J.Tiss.Reac.,Ⅺ，第301-307(1989)]。
軟骨細胞——此處所用的是指能夠合成軟骨組織成分例如Ⅱ型軟骨原纖維和纖維以及蛋白聚糖的細胞。
成纖維細胞生長因子(FGF)——從天然、合成或重組來源獲得的FGF多肽家族的任何成員[Gimenez-Gallego等，Biochem.Biophys.Res.Commun.,135，第541-548頁(1986)；Thomas等人，Trends Biochem.Sci.,11，第81-84頁(1986)]或其衍生物，它們在體外能夠刺激各種細胞包括主要的成纖維細胞、軟骨細胞、血管和角膜上皮細胞、成骨細胞、成肌細胞、平滑肌和神經(jīng)膠質(zhì)細胞[Thomas等，1986，同上]的DNA合成和細胞分裂[對于測定法可參見例如Gimenez-Gallego等，1986，同上；Canalis等，J.Clin.Invest.,81，第1572-1577頁(1988)]。根據(jù)等電點(PI)可將FGF分成酸性FGF(aFGF)或堿性FGF(bFGF)。
基質(zhì)——此處所用的是指具有足夠大孔徑或空隙使細胞能聚集于該基質(zhì)中的多孔復(fù)合固體或半固體材料。術(shù)語基質(zhì)包括基質(zhì)形成材料，即能夠在軟骨或骨的缺損部位中形成基質(zhì)的材料?；|(zhì)形成材料可能需要添加聚合劑以形成基質(zhì)，比如向含有纖維蛋白原的溶液中加入凝血酶，以形成纖維蛋白基質(zhì)。其它基質(zhì)材料包括膠原蛋白、膠原蛋白和纖維蛋白的組合、瓊脂糖(例如Sepharose)和白明膠。在治療骨缺損時也可單獨使用或與其它基質(zhì)材料結(jié)合使用形成固體基質(zhì)的磷酸鈣如磷酸三鈣、羥磷灰石或其它鈣鹽。
膜——此處所用的是指任何可以放在全方位缺損的骨缺損部分和軟骨缺損部分之間并防止全方位缺損中骨缺損部分向軟骨缺損部分細胞遷移和血管滲入的材料。在本發(fā)明的方法和組合物中所用的用于修復(fù)全方位缺損的膜優(yōu)選地可生物降解。
骨生成因子——此處所用的是指任何誘導(dǎo)或刺激骨形成的肽、多肽、蛋白或其它化合物或組合物。骨生成因子誘導(dǎo)骨修復(fù)細胞向骨細胞如成骨細胞或骨細胞分化。這個過程可以經(jīng)由軟骨組織中間狀態(tài)達到。由骨細胞形成的骨組織將含有骨特異的物質(zhì)如Ⅰ型膠原蛋白原纖維、羥磷灰石礦質(zhì)和各種糖蛋白及小量骨蛋白聚糖。
增殖(促有絲分裂)劑——此處所用的是指任何能夠在體外刺激細胞增殖的化合物或組合物，包括肽、蛋白質(zhì)和糖蛋白。在體外測定肽、多肽和其它化合物增殖(促有絲分裂)活性的方法在本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知[見例如Canalis等，J.Clin.Invest.，第1572-1577頁(1988)；Gimenez-Gallego等，biochem.Biophys.Res.Commun.,135，第541-548頁(1986),Rizzino，“用于測定轉(zhuǎn)化生長因子和促有絲分裂肽的軟瓊脂生長測定法”，酶學(xué)方法，146A(New York:Academic Press,1987)，第341-352頁；dickson等，“Assays of Mitogen-Induced Effects onCellular Incorporation of Precursors for Scavengers,de Novo,and NetDNA Synthesis”，酶學(xué)方法，146A(New York:Academic Press,1987)，第329-340頁]。一種測定化合物或組合物增殖(促有絲分裂)活性的標準方法是在體外測定其在軟瓊脂中誘導(dǎo)非轉(zhuǎn)化細胞無貼壁依賴性生長的能力[例如Rizzino,1987，同上]。其它促有絲分裂活性測定體系也是已知的[例如Gimenez-Gallego等，1986，同上；Canalis等，1988，同上；Dickson等，1987，同上]。試劑的促有絲分裂效力常常是高度濃度依賴性的，它們促有絲分裂的效力能在比最適濃度范圍更低或更高的濃度下逆轉(zhuǎn)。
轉(zhuǎn)化因子——此處所用的是指任何誘導(dǎo)軟骨修復(fù)細胞分化成為軟骨細胞的肽、多肽、蛋白質(zhì)或其它化合物或組合物?；衔锘蚪M合物誘導(dǎo)或刺激細胞合成軟骨特異蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白的能力可以通過現(xiàn)有技術(shù)已知的體外分析法測定[Seyedin等，美國國家科學(xué)院院報，82，第2267-2271頁(1985)；Seyedin等，Path.Immunol.Res.,7，第38-42頁(1987)]。
轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)——從天然、合成或重組來源獲得的TGF-β多肽家族的任何成員[Derynck,R.等，自然，316，第701-705頁(1985)；Roberts等，“轉(zhuǎn)化生長因子-β”，肽生長因子和它們的受體I(Berlin:Springer Verlag,1990)第419頁]或其衍生物，它們具有獨特的TGF-β活性，在軟瓊脂分析中可刺激正常大鼠腎(NRK)細胞生長并形成克隆[Roberts等，“從非瘤性組織中純化β型轉(zhuǎn)化生長因子”，制備用于無血清動物細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基、補料和基質(zhì)的方法(紐約Alank.Liss,Inc.,1984)]；并且可由它們在體外誘導(dǎo)或刺激細胞合成軟骨特異蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白的能力證明，它們能夠誘導(dǎo)軟骨修復(fù)細胞轉(zhuǎn)化成為軟骨細胞[Seyedin等，1985，同上]。
本發(fā)明涉及治療軟骨和骨缺損或損傷的組合物和方法。本發(fā)明的組合物包含具有足夠大孔徑的基質(zhì)，使細胞能聚集于該基質(zhì)中。
為了用于修復(fù)表面缺損中的軟骨或全方位缺損中的軟骨層，基質(zhì)含有具有防止血管長入軟骨組織生物活性的抗血管生成劑，由此防止骨的形成和軟骨組織的不完全修復(fù)?；|(zhì)也可以包含增殖劑以刺激基質(zhì)中軟骨修復(fù)細胞的增殖。優(yōu)選地，其中增殖劑也作用為趨化劑以吸引軟骨修復(fù)細胞至基質(zhì)中。選擇性地，基質(zhì)除了含有增殖劑，還可含有趨化劑。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，基質(zhì)也含有適當濃度的轉(zhuǎn)化因子，其中轉(zhuǎn)化因子包含在載體系統(tǒng)中或與載體系統(tǒng)結(jié)合以實現(xiàn)轉(zhuǎn)化因子在適當?shù)臅r候釋放，轉(zhuǎn)化因子將基質(zhì)中增殖的軟骨修復(fù)細胞轉(zhuǎn)化成為軟骨細胞，以形成穩(wěn)定的軟骨組織。該基質(zhì)也可以包含細胞粘附促進因子。
修復(fù)全方位缺損使用的軟骨修復(fù)基質(zhì)可以不需要趨化劑或增殖劑，并且可以不必太多地延遲轉(zhuǎn)化因子的釋放。在全方位缺損中，可以充分地得到下面骨中的修復(fù)細胞，并且不必為此目的吸引滑膜細胞。修復(fù)細胞將迅速地從骨間隙遷移到軟骨缺損部位。然而如果需要，尤其是缺損范圍較大的地方，可以包含增殖劑和趨化因子。由于修復(fù)細胞將迅速地聚集到缺損部位，所以較多地延遲與轉(zhuǎn)化因子的接觸不如在表面缺損中重要，這是因為在表面缺損中需要更多的時間去吸引和擴增修復(fù)細胞。然而，如果缺損范圍較大，轉(zhuǎn)化因子可以被隔離以保證在與轉(zhuǎn)化因子接觸之前，在整個缺損區(qū)域增殖足夠的修復(fù)細胞。另外，為了治療全方位缺損，基質(zhì)中可以包含游離形式的和與載體系統(tǒng)結(jié)合的抗血管生成劑和轉(zhuǎn)化因子以提供在一定的時間范圍內(nèi)持久的濃度。
對于明顯延伸到下面骨中的全方位缺損病例，優(yōu)選地在用本發(fā)明的軟骨修復(fù)基質(zhì)填充缺損的軟骨部分之前用骨修復(fù)基質(zhì)填充缺損的骨部分。
在本發(fā)明的用于填充或敷裹軟骨或骨缺陷的方法和組合物中適用的基質(zhì)材料包括纖維蛋白原(在缺損或損傷中由凝血酶原激活形成纖維蛋白)、膠原蛋白、瓊脂糖、白明膠和其它可生物降解的任何材料，這些材料形成具有足夠大孔徑的基質(zhì)，使得軟骨或骨修復(fù)細胞能夠在此基質(zhì)中聚集并增殖，并且這些材料在修復(fù)過程中可以被降解并被軟骨或骨替換。在某些病例中，在治療骨缺損時，可單獨使用或與其它可生物降解的基質(zhì)材料結(jié)合使用形成固體基質(zhì)的含磷酸鈣化合物，如磷酸三鈣、羥磷灰石及其它鈣鹽。
在本發(fā)明組合物和方法中適用的基質(zhì)可以預(yù)先制備或臨時配制，例如通過聚合化合物和組合物如纖維蛋白原形成纖維蛋白基質(zhì)?？梢灶A(yù)先制備的基質(zhì)包括膠原(例如膠原海綿和膠原毛狀物)、化學(xué)修飾的膠原、白明膠珠或白明膠海綿、形成凝膠的物質(zhì)如瓊脂糖、其他任何由基質(zhì)材料組成的形成凝膠或組合物的物質(zhì)、或上述物質(zhì)的混合物，這些物質(zhì)將填充于缺損處使軟骨或骨修復(fù)細胞能聚集于基質(zhì)中。
在本發(fā)明的一個實施方案中，使用纖維蛋白原溶液配制基質(zhì)，在即將使用之前向其中加入凝血酶起始聚合作用?？梢允褂脻舛葹?.5-5mg/ml的纖維蛋白原水性緩沖溶液。優(yōu)選地使用1mg/ml的纖維蛋白原水性緩沖溶液。該纖維蛋白原溶液在缺損區(qū)域中的聚合作用產(chǎn)生具有足夠大孔徑(例如約50-200μm)的基質(zhì)，以便軟骨或骨修復(fù)細胞自由聚集于基質(zhì)中并增殖以填充基質(zhì)占據(jù)的缺損體積。優(yōu)選地，在即將使用前向纖維蛋白原溶液中加入足量的凝血酶，以在完成聚合作用前給外科醫(yī)生足夠的時間將此材料填充于缺損區(qū)域。通常地，凝血酶的濃度應(yīng)該使聚合作用在很少時間至幾分鐘(2-4分鐘)之內(nèi)完成，因為已證明軟骨長時間暴露于空氣中將會引起損傷[Mitchell等，J.Bone Joint Surg.,71A，第89-95頁(1989)]。不應(yīng)使用過量的凝血酶，因為凝血酶能裂解生長因子分子并使它們滅活。加入到纖維蛋白原溶液中的凝血酶溶液可以按每毫升水性緩沖溶液中10-500單位，優(yōu)選地每毫升中100單位的濃度制備。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，在填充缺損前，將約20μl凝血酶(100μ/ml)與每ml纖維蛋白原溶液(1mg/ml)混合200秒。如果加入的凝血酶濃度更低，那么聚合作用將更慢發(fā)生。應(yīng)當理解，使纖維蛋白聚合作用在2-4分鐘之內(nèi)完成所需的凝血酶溶液的量只能大約地給出，因為這取決于環(huán)境溫度、凝血酶溶液的溫度和纖維蛋白原溶液的溫度等。可選擇地，如果方便，可在基質(zhì)溶液被放入缺損部位之后將凝血酶加在基質(zhì)溶液的頂部，使它擴散入溶液。通過觀測凝血酶誘導(dǎo)的纖維蛋白原溶液體外樣品的聚合作用，可以很容易地監(jiān)測填充至缺損處的凝血酶活化的基質(zhì)溶液的聚合作用。在本發(fā)明組合物和方法中，優(yōu)選的纖維蛋白基質(zhì)由自體纖維蛋白原分子形成，即纖維蛋白原分子來自與治療品種相同的哺乳動物品種的血液。也可以使用來自其它物種的非免疫原性的纖維蛋白原。
在本發(fā)明的組合物和方法中也可使用含纖維蛋白和膠原蛋白，更優(yōu)選地含纖維蛋白和白明膠的基質(zhì)。膠原蛋白基質(zhì)也可用于修復(fù)軟骨缺損，包括全方位缺損。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，更多的固體基質(zhì)如含羥磷灰石或磷酸三鈣的那些固體基質(zhì)被用于修復(fù)深度全方位缺損的骨部分。
當用膠原作為基質(zhì)材料時，可以例如使用Collagen-Vliess(“毛狀物”)、Spongostan、或白明膠-血液混合物制成足夠粘的溶液，且不需要聚合劑。膠原蛋白基質(zhì)也可與由聚合劑活化的纖維蛋白原溶液一起使用以便得到混合的基質(zhì)。
當使用其它可生物降解的化合物配制基質(zhì)時，也可能不需要使用聚合劑。例如，可以選擇Sepharose溶液，該溶液在39-42℃時為液體基質(zhì)溶液而在35-38℃時變成固體(即凝膠狀)。Sepharose的濃度也應(yīng)該使填充缺損的凝膠具有一定的篩目大小，從而使骨或軟骨修復(fù)細胞自由聚集于基質(zhì)和缺損區(qū)域。
在修復(fù)軟骨使用的本發(fā)明的組合物中，可向基質(zhì)溶液加入適當濃度范圍的一種或多種抗血管生成劑以防止血管長入軟骨組織?？梢允褂玫目寡苌蓜┌ㄈ魏尉哂蟹乐寡軓南旅婀墙M織長入軟骨組織生物活性的試劑?？捎米鞅景l(fā)明的抗血管生成劑的一些例子已在上文中舉出?？寡苌蓜?yīng)該可以自由得到以在基質(zhì)中及時提供活性，并且也可以以持久釋放的形式存在，例如與如下述的載體系統(tǒng)結(jié)合以提供延長的活性。
可以在用于軟骨修復(fù)的基質(zhì)溶液中加入一種或多種增殖(促有絲分裂)劑。增殖劑應(yīng)該以適當?shù)臐舛确秶嬖?，以對填充缺損的基質(zhì)中的軟骨修復(fù)細胞具有增殖效應(yīng)。優(yōu)選地，同一增殖劑也應(yīng)對細胞具有趨化效應(yīng)(例如在TGF-β的例子中)；然而，只具有增殖效應(yīng)的因子也可以使用。選擇性地，也可以使用兩種不同的試劑以在產(chǎn)生趨化性細胞遷移后誘導(dǎo)細胞增殖，其中每種試劑僅具有這些特異效應(yīng)的一種(趨化或增殖)。
在本發(fā)明的組合物和方法中用于刺激軟骨修復(fù)細胞增殖的增殖(促有絲分裂)劑包括轉(zhuǎn)化生長因子(“TGF”)如TGF-α和TGF-β；胰島素樣生長因子(“IGF I”)；酸性或堿性成纖維細胞生長因子(“FGF”)；血小板衍生的生長因子(“PDGF”)；表皮生長因子(“EGF”)和造血生長因子如白細胞介素3(“IL-3”)和骨形態(tài)建成蛋白(“BMP”)，如骨形態(tài)建成蛋白-2(“BMP-2”)[Rizzino,1987，同上；Canalis等，同上，1988；生物和醫(yī)學(xué)中的生長因子，Ciba FoundationSymposium,116(New York:John Wiley & Sons,1985)；Baserga,R.編輯，細胞生長和分化(Oxford:IRL Press,1985)；Sporn,M.A.和Roberts,A.B.編輯，肽生長因子和它們的受體，Ⅰ和Ⅱ卷(Berlin:Springer-Verlag,1990)]。然而，其不限于這些具體的例子。任何由體外細胞增殖實驗證明能夠刺激細胞增殖的化合物或組合物都可在本發(fā)明中用作增殖劑。這些測定法在本領(lǐng)域內(nèi)已知[例如Canalis等，1988，同上；Gimenez-Gallego等，1986，同上；Dickson等，1987，同上；Rizzino,1987，同上]。
在本發(fā)明組合物和方法中用于吸引軟骨修復(fù)細胞至軟骨缺損的趨化劑包括例如TGF-β、FGF(酸性或堿性)、PDGF、腫瘤壞死因子(例如TNF-α、TNF-β)和蛋白聚糖降解產(chǎn)物如糖胺聚糖鏈[Roberts等，(1990)，同上；生物和醫(yī)學(xué)中的生長因子，Ciba FoundationSymposium,116(New York,John Wiley & Sons,1985)；R.Baserga，編輯，細胞生長和分化(Oxford:IRL Press,1985)]。測定多肽和其它化合物趨化能力的方法在本領(lǐng)域內(nèi)已知[例如Postlewaite等，1987，同上；Wahl等，1987，同上；Moore等，1989，同上]。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，在軟骨修復(fù)時使用的基質(zhì)含有TGF-β作為增殖劑和趨化劑。特別是，可以使用TGF-βⅠ或TGF-βⅡ作為增殖劑和趨化劑。其它TGF-β形式(例如TGF-βⅢ、TGF-βⅣ、TGF-βV等)或具有TGF-β活性的多肽[見Roberts,1990，同上]，以及將要得到鑒定的這種物質(zhì)的其它形式和其它生長因子也可用于此目的。為了用作增殖劑和趨化劑，將TGF-β分子溶解或懸浮于基質(zhì)中，其濃度優(yōu)選地是每毫升基質(zhì)溶液中2-50ng，最優(yōu)選地每毫升基質(zhì)溶液中2-10ng。選擇性地，BMP-2可以以少于1ng/ml的濃度用作增殖劑。應(yīng)當理解，刺激軟骨修復(fù)細胞增殖的TGF-β或BMP-2的優(yōu)選濃度可能隨著接受治療的具體動物變化而變化。
在修復(fù)軟骨時基質(zhì)溶液中還可以含有轉(zhuǎn)化因子以便在軟骨修復(fù)細胞聚集到基質(zhì)之后，將轉(zhuǎn)化因子以足以促進軟骨修復(fù)細胞向形成新的穩(wěn)定的軟骨組織的軟骨細胞分化(即轉(zhuǎn)化)的濃度釋放至缺損部位。如果轉(zhuǎn)化因子會抑制或干擾增殖劑的效力，那么適當控制轉(zhuǎn)化因子的釋放時間是特別重要的[見Robetts等(1990)，同上]。
在本發(fā)明的組合物和方法中用于促進軟骨修復(fù)的轉(zhuǎn)化因子包括任何誘導(dǎo)軟骨修復(fù)細胞向合成軟骨特異的蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白的軟骨細胞分化的肽、多肽、蚤白質(zhì)或其它化合物或組合物?；衔锘蚪M合物在細胞中誘導(dǎo)或刺激軟骨特異的蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白合成的能力可以用本領(lǐng)域已知的方法測定[例如Seyedin等，1985，同上；Seyedin等，1987，同上]。在本發(fā)明的組合物和方法中適用的轉(zhuǎn)化因子包括例如TGF-β、TGF-α、FGF(酸性或堿性)和BMP，包括BMP-2。這些轉(zhuǎn)化因子可以單獨或在組合中使用。也可使用這些因子的二聚體和多聚體。另外，TGF-β可以與EGF結(jié)合使用。
如果必要，可以通過將轉(zhuǎn)化因子包裹或結(jié)合在適當?shù)妮d體系統(tǒng)中來實現(xiàn)轉(zhuǎn)化因子適當?shù)囟〞r釋放。在本發(fā)明組合物和方法中適用的載體系統(tǒng)包括轉(zhuǎn)化因子能自動結(jié)合其上的脂質(zhì)體、可生物腐蝕的多聚體、以碳水化合物為基礎(chǔ)的微粒、纖維(如可以與硫酸肝素蛋白聚糖或其它這類分子化學(xué)聯(lián)接的膠原蛋白)和滲透泵。載體系統(tǒng)例如帶有結(jié)合的轉(zhuǎn)化因子的脂質(zhì)體、可生物腐蝕的多聚體、纖維和含有轉(zhuǎn)化劑的以碳水化合物為基礎(chǔ)的微?？梢耘c用于填充缺損的基質(zhì)溶液混合。這些系統(tǒng)在本領(lǐng)域內(nèi)已知并易得到[見P.Johnson和J.G.Lloyd-Jones編輯，藥物載體系統(tǒng)(Chichester,England:Ellis Horwood有限公司(1987)]。脂質(zhì)體可以按照Kim等，Biochem.Biophys.Acta,728，第339-348頁，(1983)中的方法制備。也可以使用其它脂質(zhì)體制備方法。其它刺激軟骨細胞合成軟骨組織成分的因子可以和轉(zhuǎn)化因子一起包含在載體系統(tǒng)中?？傻玫睫D(zhuǎn)化因子的時間應(yīng)該與修復(fù)細胞增殖和填充到要治療的缺損部位的速度相協(xié)調(diào)。當不必較多地延遲轉(zhuǎn)化因子的釋放時，轉(zhuǎn)化因子可以游離的形式或以與載體結(jié)合的形式包含在基質(zhì)中以提供持續(xù)的適當濃度的釋放。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，修復(fù)軟骨時所用的基質(zhì)含有抗血管生成劑、TGF-β或BMP作為增殖劑和趨化劑，和包裝在載體系統(tǒng)中的TGF-β或BMP作為轉(zhuǎn)化因子。尤其是，TGF-βⅠ或TGF-βⅡ或BMP-2可以用作增殖劑、趨化劑和轉(zhuǎn)化因子。其它TGF-β形式(例如TGF-βⅢ、TGF-βⅣ、TGF-βⅤ或TGF-β家族的任何成員)或具有TGF-β活性的多肽(見Roberts,1990，同上)，以及將來要得到鑒定的這種物質(zhì)的其它形式和其它生長因子均可以用于此目的。優(yōu)選地，抗血管生長劑在基質(zhì)中包含在含轉(zhuǎn)化濃度的TGF-β和BMP的載體系統(tǒng)內(nèi)，以及以游離形式存在。
在修復(fù)軟骨的優(yōu)選的實施方案中，用作增殖劑和趨化劑的TGF-β的濃度優(yōu)選為2-50ng/ml基質(zhì)溶液，最優(yōu)選地2-10ng/ml基質(zhì)溶液。在基質(zhì)組合物中，高得多濃度的TGF-β也可以隨后釋放的形式存在于基質(zhì)組合物中作為轉(zhuǎn)化因子。優(yōu)選地，TGF-β的隨后濃度大于200ng/ml基質(zhì)，最優(yōu)選地大于或等于500ng/ml基質(zhì)。可選擇地，BMP可以在優(yōu)選的濃度100-2000ng/ml時用作轉(zhuǎn)化因子。應(yīng)當理解，誘導(dǎo)修復(fù)細胞分化的TGF-β的優(yōu)選濃度隨受到治療的具體動物變化而變化。
由于TGF-β在相對高濃度(例如大于200ng/ml基質(zhì)溶液)時，不僅可以將軟骨修復(fù)細胞轉(zhuǎn)化成為軟骨細胞，而且會抑制趨化性吸引修復(fù)細胞；而在相對低濃度(例如2-10ng/ml)時，TGF-β吸引軟骨修復(fù)細胞并刺激它們增殖，但不會誘導(dǎo)軟骨修復(fù)細胞轉(zhuǎn)化成為產(chǎn)生軟骨組織的軟骨細胞，所以必需錯開軟骨修復(fù)細胞與兩種濃度TGF-β接觸的時間。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，當有必要保持趨化性和增殖，然后轉(zhuǎn)化的順序時，將TGF-β以游離的、非膠囊化的形式和膠囊化或隔離的形式配制于基質(zhì)中。優(yōu)選地，為了吸引軟骨修復(fù)細胞并誘導(dǎo)基質(zhì)和缺損區(qū)域中的軟骨修復(fù)細胞增殖，將TGF-β分子以2-10ng/ml基質(zhì)溶液的濃度溶解或懸浮于基質(zhì)中。為了促進基質(zhì)中的軟骨修復(fù)細胞轉(zhuǎn)化成軟骨細胞，在基質(zhì)中也可存在按照Kim等，1983，同上的方法隔離在多囊脂質(zhì)體中的TGF-β分子，其濃度大于200ng/ml基質(zhì)溶液，優(yōu)選的濃度為500-800ng/ml。當吸引的修復(fù)細胞已聚集于基質(zhì)中并開始降解基質(zhì)時，載有TGF-β的脂質(zhì)體即破裂。在降解基質(zhì)期間，軟骨修復(fù)細胞攝入和/或降解脂質(zhì)體，導(dǎo)致TGF-β以足以誘導(dǎo)軟骨修復(fù)細胞向軟骨細胞轉(zhuǎn)化的濃度釋放。
通過將轉(zhuǎn)化濃度的TGF-β與可生物腐蝕的多聚體混合，也可以實現(xiàn)所需的趨化性和增殖濃度與轉(zhuǎn)化濃度的TGF-β兩階段釋放。選擇性地，也可以使用泵，優(yōu)選地植入的滲透泵來控制TGF-β在缺損處和基質(zhì)中的濃度。在本發(fā)明的實施方案中，泵控制TGF-β在基質(zhì)中的濃度，即泵可以以起始的趨化性和增殖刺激濃度釋放TGF-β，并隨后以轉(zhuǎn)化濃度釋放TGF-β。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)化濃度的TGF-β在手術(shù)后大約1-2周由泵傳送。轉(zhuǎn)化因子向缺損體積的傳運最好定位到缺損部位的基質(zhì)中。
本發(fā)明組合物中的增殖劑和轉(zhuǎn)化因子(當使用時)可在基質(zhì)內(nèi)施用于缺損部位。它們的存在被限制于非常局限的部位。這樣做可避免它們自由注入或輸注到關(guān)節(jié)腔中。這種自由輸注可能產(chǎn)生刺激滑膜細胞的副作用，從而產(chǎn)生關(guān)節(jié)滲漏。
在本發(fā)明治療全方位缺損的某些實施方案中，不必延遲與轉(zhuǎn)化因子的接觸。在一些全方位缺損中，可充分地得到修復(fù)細胞，延遲與轉(zhuǎn)化因子的接觸不如表面損傷中重要，因為表面損傷中需要更多的時間吸引和增殖修復(fù)細胞。然而，在深度缺損中，也可能需要延遲與轉(zhuǎn)化因子的接觸以使修復(fù)細胞聚集到整個損傷部位。
在本發(fā)明用于修復(fù)骨的組合物中，可向基質(zhì)溶液加入一種或多種血管生成因子以刺激骨缺損區(qū)域血管和相關(guān)細胞(例如上皮、血管周、間充質(zhì)和平滑肌細胞)及基膜的形成和長入。在本發(fā)明用于刺激整個骨缺損區(qū)域填充基質(zhì)內(nèi)血管形成的組合物和方法中有用的血管生成因子包括bFGF、TGF-β、PDGF、TNF-α、血管生成素或促血管素。已發(fā)現(xiàn)硫酸肝素增強bFGF的血管生成活性。在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，將bFGF以5-10ng/ml基質(zhì)溶液的濃度與足以加強bFGF血管生成活性的一定量的硫酸肝素一起溶解、懸浮或結(jié)合于基質(zhì)中。其它血管生成因子的優(yōu)選濃度是TGF-β為5ng/ml基質(zhì)溶液，TNFα為10ng/ml基質(zhì)溶液，PDGF為10ng/ml基質(zhì)溶液。然而，bFGF與硫酸肝素結(jié)合是上述血管生成因子中最優(yōu)選的血管生成因子。
骨生成因子也可存在于用于骨修復(fù)的基質(zhì)中，以便在血管和相關(guān)細胞已聚集于基質(zhì)中之后，當基質(zhì)被降解時將骨生成因子以促進成骨細胞和骨細胞最終發(fā)育的濃度釋放到骨缺損部位中。骨生成因子在基質(zhì)內(nèi)被適當載體系統(tǒng)隔離或包裝并在基質(zhì)被降解時釋放。在軟骨修復(fù)組合物中所用的載體系統(tǒng)也適于本發(fā)明的骨修復(fù)組合物，例如脂質(zhì)體或以碳水化合物為基礎(chǔ)的微粒(見上文)。在本發(fā)明的一個實施方案中，在骨修復(fù)時使用的基質(zhì)含有包裝在載體系統(tǒng)中的TGF-β作為骨生成因子，優(yōu)選的濃度為100ng/ml基質(zhì)溶液。也可以使用更低和更高的濃度。在另一實施方案中，用于骨修復(fù)的基質(zhì)含有包裝在載體系統(tǒng)中的BMP-2作為骨生成因子，優(yōu)選的濃度為100-2000ng/ml基質(zhì)溶液。在另一個實施方案中，基質(zhì)含有包裝在載體系統(tǒng)中的一定濃度的FGF作為骨生成因子。
在本發(fā)明的骨修復(fù)組合物中有用的骨修復(fù)因子包括任何誘導(dǎo)骨修復(fù)細胞向形成骨組織的骨細胞如成骨細胞和骨細胞分化的肽、多肽、蛋白或其它化合物或組合物。在本發(fā)明中適用的骨生成因子包括諸如TGF-β[Sampath,T.R.等，生物化學(xué)雜志，265(22)，第13198-13205頁(1990)]、血管生成素[Luyten,F.P.等，生物化學(xué)雜志，264(15)，第13377-13380(1989)]、骨形態(tài)建成蛋白(BMP)[Wang,E.等，美國國家科學(xué)院院報，87，第2220-2224(1990)]、FGF、和與表皮生長因子(EGF)結(jié)合的TGF-β的蛋白。
由骨生成因子誘導(dǎo)的間充質(zhì)細胞的分化可能包括中間組織如纖維狀的、透明的和鈣化的軟骨的形成；和軟骨內(nèi)成骨，軟骨內(nèi)成骨導(dǎo)致編織骨組織的形成，進而將重建并轉(zhuǎn)化為成熟的板層骨組織。在某些情況下，骨可以直接由間充質(zhì)細胞形成而不出現(xiàn)中間組織。在基質(zhì)內(nèi)骨組織形成的過程通常出現(xiàn)在由于基質(zhì)中所含的血管生成因子而形成血管并滲入基質(zhì)中之后3-4周。盡管不加血管生成因子和骨生成因子時(在較大缺損中需要使用至少一種基質(zhì)材料)骨仍將長入骨缺損部位，但是使用這些因子大大地提高了修復(fù)過程的速度。
在需要時，在本發(fā)明中所述的用于修復(fù)關(guān)節(jié)全方位缺損的骨部分的基質(zhì)組合物也可用于治療任何骨組織的缺損。這樣的缺損包括骨折、關(guān)節(jié)折斷、未連接(non-Union)和錯誤連接(delay-Union)、經(jīng)皮膚的關(guān)節(jié)固定術(shù)、假關(guān)節(jié)炎以及由先天性缺損、創(chuàng)傷、腫瘤侵染、退化性疾病和其它骨組織缺損原因?qū)е碌墓侨睋p。骨修復(fù)基質(zhì)組合物也可用于假肢的植入和假肢穩(wěn)定性的增強、用作內(nèi)部固定方法的植入材料的骨整合的加強、牙科植入材料的穩(wěn)定、韌帶著生處的加速愈合和脊柱或其它關(guān)節(jié)融合過程。纖粘蛋白或含有氨基酸序列Arg-Gly-Asp的其它任何化合物，包括象四肽這樣小的肽，也可以用作細胞粘附促進因子[Ruoslathi等，細胞，44，第517-518頁(1986)]以加強軟骨或骨修復(fù)細胞起始粘附到填充缺損部位的基質(zhì)上。纖維蛋白和某些膠原蛋白基質(zhì)已經(jīng)含有此序列[Ruoslathi等，1986，同上]。當使用其它可生物降解的基質(zhì)時，這些細胞粘附促進因子可在基質(zhì)用于填充或敷裹缺損之前與基質(zhì)材料混合。含有Arg-Gly-Asp的肽也可以與基質(zhì)材料(例如與纖維或網(wǎng)孔)化學(xué)偶聯(lián)，或者與加入基質(zhì)的化合物例如白蛋白偶聯(lián)。
前面所述的組合物適用于在所選動物的軟骨或骨組織缺損部位誘導(dǎo)軟骨或骨的形成。
本發(fā)明的方法可以用于治療動物包括人的軟骨和骨缺損，該方法易于使用并且局限在受侵襲的關(guān)節(jié)區(qū)域的局部。全部治療可以通過關(guān)節(jié)鏡或開放式外科術(shù)或經(jīng)皮膚的方法進行。
根據(jù)本發(fā)明，為了實施治療軟骨或骨缺損或損傷的方法，對缺損或損傷進行鑒定、制備，并敷用根據(jù)本發(fā)明的基質(zhì)組合物。
對于軟骨修復(fù)，基質(zhì)組合物可以含有抗血管生成劑以防止血管長入。增殖(促有絲分裂)劑也可以適當濃度存在于基質(zhì)組合物中以刺激基質(zhì)和缺損或損傷中的軟骨修復(fù)細胞增殖。如果所用的因子具有綜合的細胞增殖和趨化效應(yīng)，那么在此濃度的同一試劑也可以作為趨化劑以吸引軟骨修復(fù)細胞(例如TGF-β于2-10ng/ml基質(zhì)時)。選擇性地，在基質(zhì)中可存在兩種不同的試劑，一種具有特異的增殖效應(yīng)，另一種具有特異的趨化效應(yīng)。在替換的實施方案中，在用基質(zhì)敷裹缺損區(qū)域之后，可以將抗血管生成劑、如果需要增殖劑和趨化劑直接注射到基質(zhì)填充的缺損區(qū)域。注射應(yīng)定位到基質(zhì)和填充的缺損區(qū)域以避免滑膜細胞與生長因子接觸，導(dǎo)致細胞增殖和關(guān)節(jié)滲漏。
在用基質(zhì)組合物敷裹缺損部位(并且，在纖維蛋白基質(zhì)的例子中，一旦基質(zhì)固化)和如果需要將抗血管生成劑或增殖劑注射入基質(zhì)填充的缺損部位之后，可以合上關(guān)節(jié)囊和皮膚切口并終止關(guān)節(jié)鏡和開放式外科手術(shù)。
在隨后的軟骨修復(fù)步驟中，將基質(zhì)中的軟骨修復(fù)細胞在適當?shù)臅r候轉(zhuǎn)化因子(于足以將軟骨修復(fù)細胞轉(zhuǎn)化成為產(chǎn)生穩(wěn)定軟骨組織的軟骨細胞的濃度)接觸。這可以通過在上述基質(zhì)組合物內(nèi)包含適當?shù)暮修D(zhuǎn)化因子的載體系統(tǒng)來實現(xiàn)。選擇性地，可以在適當?shù)臅r候通過直接注射或通過滲透泵來向基質(zhì)填充的缺損區(qū)域傳送轉(zhuǎn)化劑。在表面軟骨缺損中不能從骨組織得到修復(fù)細胞，應(yīng)該使細胞在開始將基質(zhì)植入缺損區(qū)域后約1-2周得到轉(zhuǎn)化濃度的轉(zhuǎn)化因子。在全方位缺損中，根據(jù)缺損的大小，可使轉(zhuǎn)化因子更早得到。其它因子可以加到載體系統(tǒng)中或者直接注射以更好地促進此時間點的軟骨基質(zhì)成分的合成。而且，其它的抗血管生成劑也可以包含在載體系統(tǒng)中或直接注射。
在關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)鏡檢查過程中或者在開放式外科手術(shù)簡單檢查損傷或缺損的過程中，很容易通過肉眼鑒定動物軟骨或骨缺損。軟骨或骨缺損也可以通過使用計算機輔助X射線斷層照相(CAT掃描)檢查、磁共振成像(MRI)分析滑液或血清標記或通過任何本領(lǐng)域已知的其它方法推理鑒定。
一旦缺損得到鑒定，外科醫(yī)生可以選擇通過外科手術(shù)修飾缺損，以提高缺損物理上留住在此處所述的治療方法中加入的溶液和基質(zhì)材料的能力。優(yōu)選地，為了更好地保留在此處所述的治療方法中加入的溶液和基質(zhì)材料，缺損具有或形成垂直的邊緣或是深凹的，而不是平的或淺凹面的幾何形狀。
根據(jù)本發(fā)明的方法，可以用骨修復(fù)基質(zhì)組合物填充全方位缺損的骨缺損部位直至骨軟骨界面的鈣化軟骨層并形成平整表面。用骨修復(fù)基質(zhì)填充骨缺損對于幾毫米或更深的缺損特別有用。骨修復(fù)基質(zhì)可以包含包裝在適當載體中的血管生成因子和骨生成因子。
剩下的缺損的軟骨部分用刺激軟骨修復(fù)的基質(zhì)組合物填滿。用于修復(fù)軟骨的基質(zhì)包含含有抗血管生成劑和如果需要增殖劑和趨化劑的基質(zhì)材料。在本發(fā)明的組合物和方法中適用的抗血管生成劑包括任何具有抑制血管形成的生物活性的試劑。本發(fā)明也考慮到，抗血管生成劑可以包括能夠抑制血管生成的一種或多種分子。在此步驟中所用的組合物也可以含有包裝在載體系統(tǒng)中的和如果適合游離形式的轉(zhuǎn)化因子。在本發(fā)明最優(yōu)選的軟骨修復(fù)方法中，基質(zhì)包含抗血管生成因子(以游離形式和包裝或結(jié)合于載體系統(tǒng)中以持久地釋放)、增殖劑、趨化劑(可與增殖劑相同)和轉(zhuǎn)化因子(包裝或結(jié)合于載體系統(tǒng)中)，使轉(zhuǎn)化因子在聚集于基質(zhì)中的修復(fù)細胞已開始重建細胞間物質(zhì)時釋放。優(yōu)選的組合物如上述。
如美國專利5,270,300所述，在填充全方位缺損的軟骨部分之前，全方位缺損的骨-軟骨界面可用物理膜，優(yōu)選地不能滲入細胞的(例如孔經(jīng)小于5μM)可生物降解的膜隔離。膜放置在基質(zhì)填充的骨缺損上，在軟骨-骨連接的區(qū)域膜的邊緣必須密封到缺損的周邊以防止血管長入軟骨缺損區(qū)域。在這種方法中，不易得到來自骨區(qū)域的修復(fù)細胞以聚集于軟骨缺損區(qū)域，因此在軟骨修復(fù)基質(zhì)中需要增殖劑和/或趨化劑以吸引來自滑膜的修復(fù)細胞并刺激增殖。
在本發(fā)明優(yōu)選的治療全方位缺損的實施方案中，在骨-軟骨界面不放置膜。根據(jù)需要，可以用或不用骨修復(fù)組合物填充缺損的骨部分。如上所述，缺損的軟骨部分用含抗血管生成劑和轉(zhuǎn)化因子及如果需要增殖劑和/或趨化劑的基質(zhì)組合物填充。軟骨修復(fù)基質(zhì)組合物中的抗血管生成劑作用為功能屏障以防止血管的長入和軟骨區(qū)域中骨的形成，并避免物理膜的必要性，允許來自骨區(qū)域的修復(fù)細胞遷移。
在本發(fā)明的另一個治療全方位缺損的方法的實施方案中，骨-軟骨界面由暫時的生物膜隔離，此生物膜由加熱的裝置在骨-軟骨界面形成。加熱的裝置可施用于出血的部位以使血凝固并形成沉淀的蛋白層，由此產(chǎn)生生物的物理屏障防止血管的長入和缺損部位中骨組織形成。加熱的裝置的例子包括但不限于加熱的手術(shù)刀、加熱的剪刀或加熱的鑷子。應(yīng)當將裝置加熱到約200℃溫度。加熱的裝置應(yīng)施用于全方位缺損的基部。在另一實施方案中，可以通過CO2,N2或釹-釔鋁柘榴石激光器進行加熱。結(jié)合或替代在軟骨修復(fù)基質(zhì)中包含抗血管生成劑，可以使用加熱形成的骨-軟骨界面處的暫時生物膜。當使用熱處理方法時，在軟骨修復(fù)基質(zhì)中應(yīng)含有增殖劑和/或趨化劑。
化學(xué)方法也可以加強基質(zhì)粘附。這些方法包括降解缺損表面的軟骨蛋白聚糖表層以暴露軟骨的膠原蛋白原纖維，這樣它們可以與基質(zhì)的膠原蛋白原纖維(當使用膠原蛋白基質(zhì)時)或與基質(zhì)中的纖維蛋白原纖維(當使用纖維蛋白基質(zhì)時)相互作用。軟骨表面的蛋白聚糖不僅會干擾纖維蛋白或其它可生物降解的基質(zhì)到粘附軟骨上，而且會局部抑制凝血酶的活性。有利的是，蛋白聚糖降解產(chǎn)物也可能具有對修復(fù)細胞的趨化作用〔Moore,A.R.等，Int,J.Tiss.Reac.,Ⅺ(6)第301-307頁(1989)〕。
根據(jù)本發(fā)明方法的一個實施方案，通過用無菌吸水紙吸去缺損區(qū)域的液體使缺損表面干燥，并用無菌酶溶液填充缺損體積2-10分鐘以降解軟骨表面上存在和位于缺損表面下深約1-2μm處的蛋白聚糖。可以單獨或組合使用在無菌緩沖水溶液中的各種酶以降解蛋白聚糖。溶液的pH值應(yīng)調(diào)節(jié)至使酶活性最佳。
在本發(fā)明的方法中，適用于降解蛋白聚糖的酶包括軟骨素酶(Chondroitinase)ABC、軟骨素酶AC、透明質(zhì)酸酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、Chmotrypsin、木瓜蛋白酶、鏈霉蛋白酶、基質(zhì)溶素和Staph V8蛋白酶。具體的酶或酶組合的適當濃度取決于酶溶液的活性。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，用1U/ml濃度的軟骨素酶AC的無菌溶液填充缺損，允許消化進行4分鐘。根據(jù)實施例1所述的方法決定軟骨素酶AC的優(yōu)選濃度。任何其它酶的使用濃度和使用時間應(yīng)使只有深至約1-2μm的表面蛋白聚糖被降解。
酶溶液施用的時間應(yīng)保持在最小，使其主要在修復(fù)區(qū)域影響蛋白聚糖的降解。對于1U/ml濃度的軟骨素酶ABC或AC，消化時間超過10分鐘可能導(dǎo)致缺損區(qū)域以外的蛋白聚糖不必要的和潛在有害的降解。而且，消化時間超過10分鐘會使操作的總時間過長。尤其在開放式關(guān)節(jié)切開術(shù)過程中，操作的總時間應(yīng)保持在最小，因為軟骨可能由于暴露在空氣中而受到損傷〔Mitchell等，(1989)，同上〕。由于這些原因，在包括了通過酶消化降解蛋白聚糖步驟的本發(fā)明方法的實施方案中，優(yōu)選消化時間少于10分鐘，最優(yōu)選消化時間少于5分鐘。
根據(jù)本發(fā)明的方法，在酶已降解缺損表面的蛋白聚糖之后，應(yīng)該將酶溶液從缺損區(qū)域除去。通過使用裝有細吸頭的抽氣器，然后在用帶有棉狀物的海綿吸收，可以有效地除去酶溶液。選擇性地，可以只用帶有棉狀物的海綿吸去酶溶液。
除去酶溶液后，應(yīng)該用無菌生理鹽水(例如0.15M NaCl)徹底清洗缺損處，最優(yōu)選地洗三次。然后應(yīng)將清洗過的缺損部位干燥。可以用無菌紗布或棉狀物對缺損部位進行干燥。
基質(zhì)對軟骨缺損的粘附也可以通過使用纖維蛋白膠粘物(即血液因子ⅩⅢ或纖維蛋白穩(wěn)定因子)促進基質(zhì)原纖維與缺損表面上軟骨膠原原纖維的化學(xué)結(jié)合(交聯(lián))來加強〔見Gibble等，輸血，30(8)，第741-747頁(1990)〕。谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶也有相同的作用〔見例如Ichinose等，生物化學(xué)雜志，265(23)，第13411-13414頁(1990)；“谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶”，編輯V.A.Najjar和L.Lorand,Martinus NijhoffPublishers(Boston,1984)〕。也可以使用其它能促進胞外物質(zhì)粘附的化合物。
也可以用本發(fā)明的方法和組合物輔助治療牙周疾病。例如治療其中牙周韌帶和牙頸暴露的疾病如paradontitis時，可以促進牙周結(jié)締組織的再生。尤其是，可用包含一種或多種刺激牙周形成的因子如IGF或FGF，和一種或多種抑制上皮形成的抗上皮因子如表皮生長因子(EGF)的抑制劑、抗基膜的抗體、維生素A抑制劑、抗視網(wǎng)膜抗體的可生物降解的基質(zhì)和富含纖連蛋白的基質(zhì)填充牙周結(jié)締組織即韌帶空隙?？股掀ひ蜃討?yīng)該以游離形式和包裝或結(jié)合于載體系統(tǒng)中的形式存在以基質(zhì)填允區(qū)域內(nèi)提供持久的釋放。優(yōu)選的基質(zhì)材料是具有足夠粘附牙齒和牙床能力的交聯(lián)的白明膠或膠原蛋白基質(zhì)。
也可以通過本發(fā)明的方法和組合物促進缺齒后骨的再生。當缺齒時，固定牙齒的骨腔隙通常萎縮凹陷。這個區(qū)域即下顎或上顎邊緣必須在牙齒移入之前并重新建立和形成。然而，骨的再生常常被包圍它的迅速生長的結(jié)締組織阻止。這一點可以通過使用如上所述的那些骨修復(fù)基質(zhì)防止，基質(zhì)中包含有效劑量的一種或多種抑制結(jié)締組織細胞遷移和/或增殖和/或分化的抑制劑。例如，可以將包含與載體系統(tǒng)結(jié)合的血管生成因子和骨生成因子及抗結(jié)締組織因子如抑制間充質(zhì)細胞增殖的因子的基質(zhì)放入此區(qū)域以重建骨組織。為促進牙周結(jié)締組織腔隙周圍的結(jié)締組織的重新形式，可以將包含刺激結(jié)締組織干細胞和前體細胞遷移、增殖和分化的因子如IGF-1和FGF的可生物降解的基質(zhì)填充在牙周組織內(nèi)的空隙。結(jié)締組織基質(zhì)也可以包含抗上皮因子。
本發(fā)明的另一方面是防止例如在關(guān)節(jié)移殖如整個髖關(guān)節(jié)移殖之后出現(xiàn)骨周圍結(jié)締組織腔隙的關(guān)節(jié)周鈣化和骨化。可以將包含抗骨因子如抗血管生成因子、抗TGF-β和BMP化合物的抗體或其組合的基質(zhì)施用于關(guān)節(jié)周結(jié)締組織空隙以防止鈣化和骨組織形成，其中抗骨因子以游離的形式和結(jié)合或包裝于載體系統(tǒng)中的形式存在以提供持久的釋放。
本發(fā)明的進一步應(yīng)用是在年幼動物和兒童中防止骨組織長入穿過軟骨生長板的骨折部位，這可能在長骨頂端骨折時出現(xiàn)。與防止骨周圍結(jié)締組織腔隙骨化一樣，可以用含抗骨因子如抗血管生成因子、抗TGF-β和BMP化合物的抗體或其組合的基質(zhì)填充軟骨生長板區(qū)域的骨折裂縫。
為了使本文所述的發(fā)明得到更充分地理解，舉出下列實施例。應(yīng)當理解這些實施例是用于舉例說明而不是用來以任何方式限制本發(fā)明。實施例1測試用于清除蛋白聚糖的酶為了促進和改善基質(zhì)與關(guān)節(jié)軟骨組織表面缺損的表面的粘附，可以將表面軟骨基質(zhì)內(nèi)的蛋白聚糖分子酶解清除，以使膠原纖維網(wǎng)與外部施用的基質(zhì)和遷移的修復(fù)細胞接觸。各種蛋白酶和糖胺聚糖降解酶都適用于此目的，但是應(yīng)該控制pH值以使每種酶達到最大活性。
在此實施例中，我們對軟骨素酶ABC(0.5-5U/ml)和胰蛋白酶(0.5-4％)清除蛋白聚糖的能力進行了測試。使用的是來自當?shù)赝婪虻膭傇讱⒌耐孟リP(guān)節(jié)。將機械產(chǎn)生的表面軟骨缺損放在酶溶液中4分鐘。然后用吸水紙除去溶液，并用生理鹽水徹底清洗缺損部位。完成此程序后，軟骨組織立刻在含有0.7％(重量/體積)六胺三氯化釕(RHF)的2％(體積/體積)戊二醛溶液(用0.05M卡可酸鈉緩沖，pH7.4)中固定以進行組織檢查。固定后的培養(yǎng)基含有1％RHT’-四氧化鋨溶液(用0.1M卡可酸鈉緩沖)。將組織在級配的一系列乙醇中脫水并包埋在Epon 812中。將組織學(xué)切成薄切片，用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，并用電子顯微鏡檢查。在這些切片中，RHT固定的(即沉淀的)蛋白聚糖呈現(xiàn)為黑色染色顆粒。清除不超過1-2μm厚的蛋白聚糖表層的酶濃度定義為最佳(酶更深的滲透會影響下面的軟骨細胞)。發(fā)現(xiàn)軟骨素酶ABC在約1U/ml濃度時具最佳活性。胰蛋白酶在約2.5％濃度時具最佳活性。其它糖胺聚糖酶或蛋白酶的最佳活性范圍可以用相似的方法測定。任何緩沖液，只要是非毒性的并且其最大緩沖容量與最大酶活性所需的pH值接近的地方出現(xiàn)，都可以與酶結(jié)合使用。實施例2基質(zhì)對表面缺損的粘附對通過可控制的軟骨表面蛋白聚糖的酶解消化來促進基質(zhì)對缺損表面粘附的可能性進行研究。通過用整平刀刮在三只成年兔的膝關(guān)節(jié)上形成缺損。這些缺損不用酶處理。用纖維蛋白基質(zhì)填充缺損，該基質(zhì)在填充缺損前約200秒時通過將20μl凝血酶溶液(100U/ml水性緩沖液)與每ml纖維蛋白原溶液(1mg/ml水性緩沖液)混合來配制。一個月后將兔子殺死，檢查膝關(guān)節(jié)以測定纖維蛋白基質(zhì)對缺損部位的粘附程度。將結(jié)果與在用纖維蛋白基質(zhì)填充缺損前已用軟骨素酶ABC(1U/ml,4分鐘)處理缺損的兔子(見實施例3、4和5)進行比較。
未用酶處理過的填充在缺損區(qū)域的纖維蛋白基質(zhì)粘附缺損表面的親和力低。酶處理后，纖維蛋白基質(zhì)的粘著能力(通常測量粘附的機械強度，即通過測試用鑷尖人工推開基質(zhì)的容易程度，以及通過記錄在整個實驗過程中其中基質(zhì)成功地保持粘著的缺損數(shù)目間接測定)顯著增加?；|(zhì)對未用酶處理的缺損表面親和力低可能是由于蛋白聚糖分子對基質(zhì)粘著的局部抑制以及對纖維蛋白聚合作用的抑制。都可以通過將沿著缺損表面區(qū)域的表面蛋白聚糖酶解清除來防止這兩種影響。實施例3將生長因子施用于缺損部位以趨化性地刺激修復(fù)細胞使之遷移至缺損區(qū)域并誘導(dǎo)修復(fù)細胞增殖對各種生長因子刺激修復(fù)細胞趨化性遷移至缺損區(qū)域以實現(xiàn)缺損愈合的作用進行測試。
所使用的生長因子包括a)表皮生長因子(EGF),b)堿性成纖維細胞生長因子(bFGF),c)胰島素樣生長因子I(IGF I),d)人生長激素(hGH)，和e)濃度為5-10ng/ml的轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)。
如實施例2所述用軟骨素酶ABC處理并清洗之后，將每種生長因子局部施用于膝關(guān)節(jié)中產(chǎn)生的缺損?？偣彩褂昧?0只動物(每種生長因子兩只)。每種生長因子都能夠充分地趨化性吸引或局部刺激修復(fù)細胞增殖到缺損表面以完全覆蓋缺損表面。但是，細胞只存在于缺損的表面，并且修復(fù)細胞的增殖不能充分地填充缺損體積。
可以相信，蛋白聚糖降解產(chǎn)物本身，即不加入任何其它試劑，可產(chǎn)生足夠的趨化效應(yīng)以吸引修復(fù)細胞至缺損部位。Moore,A.R.等〔Int.J.Tiss.Reac.,Ⅺ(b)，第301-307頁，1989〕已證明蛋白聚糖降解產(chǎn)物本身具有趨化效應(yīng)。實施例4將包裹在可生物降解的基質(zhì)中的生長因子施用于缺損部位以趨化性地刺激修復(fù)細胞遷移至缺損區(qū)域并誘導(dǎo)修復(fù)細胞增殖既然在實施例3的條件下局部施用生長因子不能誘導(dǎo)足以填充缺損體積的修復(fù)細胞增殖，那么這次將同樣的生長因子包裹在可生物降解的基質(zhì)中，重復(fù)此實驗。所使用的可生物降解的基質(zhì)是纖維蛋白，膠原蛋白和Sepharose。足量的含有生長因子的基質(zhì)將用于完全地填充缺損體積。
在填充缺損前約200秒時，將20μl凝血酶溶液(100U/ml水性緩沖液Veronal乙酸鹽緩沖液，pH7.0)與每ml纖維蛋白原溶液(1mg/ml水性緩沖溶液0.05M Tris,pH7.4,0.1M NaCl)混合制成纖維蛋白基質(zhì)。對膠原蛋白基質(zhì)，使用Colagen-Vliess或白明膠-血液混合物制成足夠粘度的溶液。對于Sepharose基質(zhì)，用液體Sepharose溶液于39-42℃填充缺損。冷卻(35-38℃)后，在缺損處形成Sepharose基質(zhì)、使用30只兔子(每種基質(zhì)和生長因子兩只兔子)進行此實驗。在所有填充基質(zhì)保持與缺損粘附的例子中，已由成纖維細胞樣修復(fù)細胞完全聚集。早在手術(shù)后8-10天就可發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象。除了可生物降解的基質(zhì)由修復(fù)細胞重建并且被松散的、結(jié)締組織類型的胞外基質(zhì)替代之外，直到在手術(shù)后4周沒有出現(xiàn)修復(fù)組織結(jié)構(gòu)組成的進一步改變。
該組織沒有轉(zhuǎn)化成為軟骨組織。實施例5將包裹在可生物降解的基質(zhì)中的生長因子施用于缺損部位以趨化性地刺激修復(fù)細胞遷移至缺損區(qū)域并誘導(dǎo)修復(fù)細胞增殖；然后在第二階段定時、局部釋放轉(zhuǎn)化因子以使缺損部位轉(zhuǎn)化成為透明軟骨在施用生長因子后，缺損體積內(nèi)的基質(zhì)被修復(fù)細胞完全填充，并且這些細胞能重建填充的基質(zhì)(見實施例4)，結(jié)果促使我們研究導(dǎo)入膠囊化形式(例如脂質(zhì)體)的轉(zhuǎn)化因子(如TGF-β)的影響，其中轉(zhuǎn)化因子在基質(zhì)被修復(fù)細胞完全占據(jù)，修復(fù)細胞開始重建胞間結(jié)構(gòu)時，得到釋放。
為促進最初的趨化和增殖效應(yīng)，將TGF-β以低濃度(例如2-10ng/ml混入纖維蛋白原溶液(1mg/ml)中。另外根據(jù)Kim等(1983)，上文的方法將TGF-β包裹在脂質(zhì)體中。將含有TGF-β的脂質(zhì)體加入到同樣的纖維蛋白原溶液中，所用濃度足以在這些脂質(zhì)體破裂并釋放TGF-β時提供更高濃度(100-1000ng TGF-β/ml纖維蛋白原)的TGF-β，以便在聚集于纖維蛋白基質(zhì)的修復(fù)細胞開始重建胞間物質(zhì)的第二階段促進修復(fù)細胞向軟骨細胞的轉(zhuǎn)化和基質(zhì)填充的缺損向軟骨的轉(zhuǎn)化。
如實施例2，使10只成年兔的膝關(guān)節(jié)表面軟骨產(chǎn)生缺損，并通過對缺損部位施用含有游離的和脂質(zhì)體包裹的TGF-β的纖維蛋白原混合物進行治療。在這一系列實驗的各個實驗中，游離TGF-β的濃度保持在2-10ng/ml纖維蛋白原范圍內(nèi)，同時改變膠囊化TGF-β的濃度以便以100ng的間隔(根據(jù)從脂質(zhì)體釋放TGF-β的多少)提供100-1000ngTGF-β/ml纖維蛋白原的濃度。在所有實驗的治療部位都有透明軟骨組織的形成。在濃度高于200ng膠囊化TGF-β/ml纖維蛋白原溶液時，優(yōu)選地高于500ng TGF-β/ml纖維蛋白原溶液時得到重復(fù)性最好的結(jié)果。實施例6測定組織轉(zhuǎn)化的時間點在此實驗中，根據(jù)實施例2所述對一組6只成年兔進行膝外科手術(shù)，以產(chǎn)生表面缺損。使用用于表面缺損修復(fù)的全面治療方案，即用軟骨素酶ABC(1U/ml)處理4分鐘，然后用含有游離TGF-β(2-10ng/ml)和脂質(zhì)體包裹的TGF-β(800ng/ml)的纖維蛋白基質(zhì)(1mg/ml纖維蛋白原溶液，20μl 100U/ml凝血酶溶液/ml纖維蛋白原溶液)填充缺損部位。在手術(shù)后第8、10和12天殺死三只兔子，在第20、24和28天殺死剩余的三只。在這種動物模型中，原始的成纖維細胞樣的修復(fù)細胞組織向透明軟骨組織的轉(zhuǎn)化在第12-20天之間出現(xiàn)。這是根據(jù)組織學(xué)檢查確定的。在第8-12天，仍然存在松散的纖維性修復(fù)組織(所施用的纖維蛋白基質(zhì)被部分或全部重建)；而在20天及20天以后，缺損的空間由透明軟骨組織部分或完全填充。實施例7在微型豬模型中使用軟骨修復(fù)方法將上面用于兔模型的實驗方法用于更大的動物模型微型豬(mini-pig)。通過用整平刀刮在四只成年微型豬(2-4歲，80-110磅)的髕骨溝和內(nèi)側(cè)髁產(chǎn)生表面缺損(0.6mm寬，0.6mm深，10-15mm長)。然后用軟骨素酶ABC(1U/ml，如上面對兔子所用的)處理缺損4分鐘。除去酶溶液，使缺損干燥，用生理鹽水清洗，然后再干燥。然后用纖維蛋白原基質(zhì)溶液填充缺損部位。用于此實驗的纖維蛋白原基質(zhì)溶液每ml含有2-6ng游離的TGF-β和1500-2000ng脂質(zhì)體包裹的TGF-β。在填充缺損前，如上面兔子實驗中所述，將凝血酶加入基質(zhì)溶液中。
手術(shù)后6周將微型豬殺死，對基質(zhì)填充的缺損部位進行組織學(xué)檢查。所有部位看來已愈合，即在治療部位形成了透明軟骨組織。實施例8使用抗血管生成劑修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨全方位缺損在成年微型豬膝關(guān)節(jié)的髕骨溝和內(nèi)側(cè)髁造成1mm深、10mm寬的全方位關(guān)節(jié)軟骨缺損。使用整平儀器在兩只動物中各形成五處損傷。在每個髕骨溝的頭部形成兩處缺損，尾部形成兩處缺損，另一處缺損在股骨內(nèi)側(cè)髁。通過肉眼觀察流血的出現(xiàn)控制每處缺損向軟骨下骨組織(包括骨血管和骨髓細胞)的垂直深入以確保在關(guān)節(jié)中已形成全方位缺損。然后用軟骨素酶AC(1U/ml)處理缺損4分鐘。除去酶溶液，使缺損干燥，用生理鹽水洗，然后再干燥。然后用軟骨修復(fù)基質(zhì)填充缺損部位。在此實驗中使用的基質(zhì)溶液含有白明膠(Gelfoam,Upjohn)共聚物(于100mg/ml時使用)和纖維蛋白原(在200mg/ml時使用)。在基質(zhì)填充缺損之后，將凝血酶加入缺損表面的頂部并使之擴散入基質(zhì)。
軟骨修復(fù)基質(zhì)含有濃度約為40ng/ml基質(zhì)體積的游離的增殖劑胰島素生長因子-Ⅰ(IGF-I)作為轉(zhuǎn)化因子和濃度為500ng/ml基質(zhì)體積的脂質(zhì)體包裹的TGF-β1作為轉(zhuǎn)化因子。另外，在含TGF-β1的相同脂質(zhì)體中加入濃度為10m mol/升基質(zhì)體積的游離舒拉明(Suramin)和10m mol/升基質(zhì)體積濃度的脂質(zhì)體包裹的舒拉明。在對照損傷中，用相同方法處理損傷，但是不加舒拉明。
手術(shù)治療后約8周，將動物殺死并對基質(zhì)填充的缺損部位進行組織學(xué)檢查。缺損空隙與關(guān)節(jié)軟骨組織毗連的部分，即用含舒拉明的基質(zhì)組合物填充的區(qū)域已由關(guān)節(jié)軟骨組織填充。在對照損傷中，即未用舒拉明鈉處理的缺損空隙的相同部分已由新形成的骨組織填充。
用濃度為1000ng/ml基質(zhì)體積的BMP-2代替TGF-β1重復(fù)上述實驗，得到相同的結(jié)果。實施例9使用加熱方法修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨的全方位缺損在成年微型豬的內(nèi)側(cè)髁和髕骨溝中造成1mm深、10mm寬的全方位關(guān)節(jié)軟骨缺損。在每個出現(xiàn)出血的部位，通過向缺損表面上施用加熱的儀器誘導(dǎo)凝血以形成生物的物理屏障。我們使用加熱至220℃的手術(shù)刀邊緣造成暫時的組織屏障。
在一只微型豬中，一個關(guān)節(jié)中的關(guān)節(jié)軟骨缺損用含TGF-1(濃度為約40ng/ml基質(zhì)體積)和脂質(zhì)體包裹的TGF-β3(濃度為50ng/ml基質(zhì)體積)的軟骨修復(fù)基質(zhì)填充。在另一個關(guān)節(jié)中的缺損中，如實施例8所述基質(zhì)中含有舒拉明。
在第二只微型豬中，一個關(guān)節(jié)中的缺損用含TGF-1(濃度為40ng/ml基質(zhì)體積)和脂質(zhì)體包裹的BMP-2(濃度為1000ng/ml基質(zhì)體積)的軟骨修復(fù)基質(zhì)填充。在第二只微型豬的另一個關(guān)節(jié)的缺損中，如實施例8所述基質(zhì)中含有舒拉明。
如前面的實驗，在手術(shù)治療后第8天將動物殺死并檢查。在兩只動物中，與關(guān)節(jié)軟骨組織毗連的缺損空隙中沒有骨組織形成。而且缺損空隙已由關(guān)節(jié)軟骨組織填充。實施例10使用抗血管生成劑修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨的深度全方位缺損可以在成年微型豬膝關(guān)節(jié)的內(nèi)側(cè)髁和髕骨溝中造成深達5mm的非常深的全方位關(guān)節(jié)軟骨缺損。使用整平儀器在維持全身麻醉的動物中實施損傷。缺損的骨部分用如上所述的骨修復(fù)基質(zhì)填充。缺損的骨部分應(yīng)用基質(zhì)填充至軟骨-骨界面。關(guān)節(jié)軟骨缺損空隙用如上面例如實施例8-9中所的含抗血管生成因子的軟骨修復(fù)基質(zhì)填充。
權(quán)利要求
1．治療動物軟骨全方位缺損的方法，該方法包括用含有效劑量抗血管生成劑的基質(zhì)填充缺損的軟骨部分以防止血管長入軟骨。
2．權(quán)利要求1的方法，其中基質(zhì)進一步包含有效劑量的轉(zhuǎn)化因子以將修復(fù)細胞轉(zhuǎn)化成為軟骨細胞。
3．權(quán)利要求2的方法，其中基質(zhì)進一步包含有效劑量的增殖劑以刺激修復(fù)細胞的增殖。
4．權(quán)利要求3的方法，其中基質(zhì)進一步包含有效劑量的趨化劑以吸引修復(fù)細胞。
5．權(quán)利要求2或3的方法，其中將轉(zhuǎn)化因子與載體系統(tǒng)結(jié)合以便以足以將修復(fù)細胞轉(zhuǎn)化成為軟骨細胞的濃度釋放轉(zhuǎn)化因子。
6．權(quán)利要求5的方法，其中抗血管生成劑以游離的形式和以與載體系統(tǒng)結(jié)合的形式包含在基質(zhì)中以提供持久的釋放。
7．權(quán)利要求1的方法，進一步包括當修復(fù)細胞已聚集于基質(zhì)時向基質(zhì)填充的缺損部分提供有效劑量的轉(zhuǎn)化因子以將修復(fù)細胞轉(zhuǎn)化成為軟骨細胞。
8．治療動物軟骨全方位缺損的方法，該方法包括加熱處理出血部位以形成暫時的生物膜；并且用基質(zhì)填充全方位缺損的軟骨部分，所述基質(zhì)含有有效劑量的增殖劑以刺激修復(fù)細胞的增殖和有效劑量的與載體系統(tǒng)結(jié)合的轉(zhuǎn)化因子以便以足以將修復(fù)細胞轉(zhuǎn)化成為軟骨細胞的濃度釋放轉(zhuǎn)化因子。
9．權(quán)利要求8的方法，其中基質(zhì)進一步包含有效劑量的抗血管生成劑以防止血管長入軟骨。
10．權(quán)利要求8的方法，其中基質(zhì)進一步包含有效劑量的趨化劑以吸引修復(fù)細胞。
11．權(quán)利要求2的方法，進一步包括用第二種基質(zhì)填充缺損的骨部分。
12．權(quán)利要求11的方法，其中第二種基質(zhì)含有有效劑量的血管生成因子以刺激血管與相關(guān)細胞的形成和長入，并含有與載體系統(tǒng)結(jié)合的骨生成因子以便以足以誘導(dǎo)骨修復(fù)細胞分化成為形成骨的骨細胞的濃度釋放骨生成因子。
13．治療動物軟骨缺損的方法，該方法包括用基質(zhì)填充缺損，所述基質(zhì)含有有效劑量的抗血管生成劑以防止血管長入軟骨、有效劑量的趨化劑以吸引修復(fù)細胞、有效劑量的增殖劑以刺激修復(fù)細胞的增殖和有效劑量的與載體系統(tǒng)結(jié)合的轉(zhuǎn)化因子以便以足以將修復(fù)細胞轉(zhuǎn)化成為軟骨細胞的濃度釋放轉(zhuǎn)化因子。
14．權(quán)利要求13的方法，其中抗血管生成劑以游離的形式和以與載體系統(tǒng)結(jié)合的形式包含在基質(zhì)中以提供持久的釋放。
15．權(quán)利要求1、8或11的方法，進一步包括用無菌的試劑溶液處理缺損部位以從缺損的表面降解蛋白聚糖，并在用基質(zhì)填充缺損之前去除該試劑。
16．權(quán)利要求15的方法，其中降解蛋白聚糖的試劑是軟骨素酶ABC。
17．權(quán)利要求6的方法，其中載體系統(tǒng)選自含脂質(zhì)體、可生物腐蝕的聚合物、膠原蛋白纖維、以碳水化合物為基礎(chǔ)的微粒和水油乳劑的群體。
18．權(quán)利要求17的方法，其中基質(zhì)選自含纖維蛋白、膠原蛋白、白明膠、瓊脂糖和其組合的群體。
19．權(quán)利要求11的方法，其中用于填充缺損的軟骨部分的基質(zhì)選自含纖維蛋白、膠原蛋白、白明膠、瓊脂糖和其組合的群體，用于填充缺損的骨部分的第二種基質(zhì)選自由含鈣鹽的基質(zhì)組成的群體。
20．權(quán)利要求2的方法，其中抗血管生成劑是舒拉明。
21．權(quán)利要求2的方法，其中轉(zhuǎn)化因子選自含TGF-β和BMP的群體。
22．權(quán)利要求12的方法，其中轉(zhuǎn)化因子選自含TGF-β和BMP的群體；骨生成因子選自含TGF-β、BMP和FGF的群體。
23．治療軟骨缺損的組合物，該組合物含有用于敷裹軟骨缺損或損傷區(qū)域的可生物降解的基質(zhì)或基質(zhì)形成材料，和有效劑量的抗血管生成劑以防止血管長入軟骨。
24．權(quán)利要求23的組合物，其中基質(zhì)或基質(zhì)形成材料進一步包含有效劑量的轉(zhuǎn)化因子以將修復(fù)細胞轉(zhuǎn)化成為軟骨細胞。
25．權(quán)利要求24的組合物，其中基質(zhì)或基質(zhì)形成材料進一步包含有效劑量的增殖劑以刺激修復(fù)細胞的增殖。
26．權(quán)利要求25的組合物，其中基質(zhì)或基質(zhì)形成材料進一步包含有效劑量的趨化劑以吸引修復(fù)細胞。
27．權(quán)利要求24的組合物，其中將轉(zhuǎn)化因子與載體系統(tǒng)結(jié)合。
28．權(quán)利要求27的組合物，其中抗血管生成劑為游離的形式和與載體系統(tǒng)結(jié)合的形式。
29．權(quán)利要求28的組合物，其中轉(zhuǎn)化因子和抗血管生成劑與同一載體系統(tǒng)結(jié)合。
30．權(quán)利要求6的組合物，其中傳送轉(zhuǎn)化因子和抗血管生成劑的載體系統(tǒng)選自含脂質(zhì)體、可生物腐蝕的聚合物、膠原蛋白纖維、以碳水化合物為基礎(chǔ)的微粒和水油乳劑的群體。
31．權(quán)利要求24的組合物，其中基質(zhì)選自含纖維蛋白、膠原蛋白、白明膠、瓊脂糖和其組合的群體。
32．權(quán)利要求28的組合物，其中抗血管生成劑是舒拉明。
33．權(quán)利要求27的組合物，其中轉(zhuǎn)化因子選自含TGF-β和BMP的群體。
34．促進動物結(jié)締組織再生的組合物，該組合物包含含有有效劑量刺激結(jié)締組織形成的因子和有效劑量抑制上皮形成的抗上皮因子的基質(zhì)，其中抗上皮因子與載體系統(tǒng)結(jié)合以提供持久的釋放。
35．促進動物骨再生的組合物，該組合物包含含有有效劑量血管生成劑、與載體系統(tǒng)結(jié)合的骨生成劑和抑制結(jié)締組織形成的抗結(jié)締組織因子的基質(zhì)。
36．防止動物關(guān)節(jié)區(qū)域結(jié)締組織關(guān)節(jié)周鈣化和骨化的組合物，該組合物包含含有有效劑量抑制骨形成的抗骨因子的基質(zhì)，其中抗骨因子與載體系統(tǒng)結(jié)合以提供持久的釋放。
37．防止骨組織長入軟骨生長板中骨折部位的方法，該方法包括用基質(zhì)填充生長板中的骨折部位，所述基質(zhì)含有有效劑量的抗骨因子以抑制骨的形成，其中抗骨因子與載體系統(tǒng)結(jié)合以提供持久的釋放。
全文摘要
本發(fā)明提供了治療和修復(fù)人和其它動物軟骨或骨缺損如關(guān)節(jié)全方位缺損的方法和組合物。為了誘導(dǎo)軟骨形成,用具足夠大孔徑的基質(zhì)填充缺損,使軟骨修復(fù)細胞能聚集于基質(zhì)中?；|(zhì)含有作為功能屏障的抗血管生成劑以防止血管形成并防止骨長入軟骨區(qū)域。填充關(guān)節(jié)軟骨缺損的基質(zhì)也可包含增殖劑和趨化劑,及在適當載體系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)化因子。全方位缺損中,骨和軟骨區(qū)域間的功能屏障也可以通過加熱出血區(qū)域形成暫時組織屏障得到,該屏障防止血管和相關(guān)細胞從骨區(qū)域穿透到軟骨區(qū)域。如果需要,全方位缺損的骨部分可以用具足夠大孔徑的基質(zhì)填充以使細胞能聚集于基質(zhì)中并形成血管。填充骨缺損的基質(zhì)可以含有在適當載體系統(tǒng)中的血管生成因子和骨生成因子。本發(fā)明也提供用于牙科和其它應(yīng)用的促進骨和結(jié)締組織再生的方法和組合物。
文檔編號A61F2/30GK1226839SQ97196887
公開日1999年8月25日 申請日期1997年6月24日 優(yōu)先權(quán)日1996年6月28日
發(fā)明者E·B·胡恩茲克 申請人:羅伯特·弗朗西斯·肖