專利名稱：Rsv基因表達(dá)疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及基因表達(dá)疫苗。更具體地，本發(fā)明涉及可鼻內(nèi)或經(jīng)口施用的基因表達(dá)疫苗。
背景技術(shù)：
呼吸道合胞病毒(RSV)是造成嬰兒和兒童下呼吸道病毒性感染最常見的原因，全球每年約感染4百萬兒童并導(dǎo)致約100,000人入院治療，且僅在美國就導(dǎo)致4,500例死亡。RSV感染與兒童的支氣管炎、支氣管阻塞和哮喘加重的復(fù)發(fā)事件有關(guān)。RSV感染誘發(fā)的支氣管炎的發(fā)病率一直在升高。目前尚無抗RSV感染的有效預(yù)防措施。先前嘗試研發(fā)的福爾馬林滅活的RSV疫苗不僅無效，而且當(dāng)隨后發(fā)生RSV感染時還可使疾病加重。(Chanock等，由呼吸道合胞病毒引起的嚴(yán)重呼吸道疾病改進(jìn)的治療和免疫的前景，兒科學(xué)(Pediatrics)，1992；90137-43)。此外，對RSV治療的研發(fā)由于其潛伏期短而受到限制。因此，研發(fā)RSV疫苗已在全球范圍內(nèi)具有高度的重要性。
大多數(shù)RSV抗原在人和小鼠中具有免疫原性，但F和G抗原產(chǎn)生大多數(shù)的抗RSV中和抗體。(Connors等，呼吸道合胞病毒(RSV)的F、G、M2(22K)和N蛋白均誘導(dǎo)產(chǎn)生對RSV攻擊的抗性，但M2和N蛋白誘導(dǎo)的抗性存在時間相對較短，病毒學(xué)雜志(J Virol)，65.1634，1991；Wyatt等，通過重組的復(fù)制缺陷型痘苗病毒MVA對呼吸道合胞病毒的初次和加強(qiáng)免疫，疫苗(Vaccine)18392，1999)。人類CTL庫的分析表明N、SH、F、M、M2和NS2蛋白為強(qiáng)的靶抗原。類似地，在BALB/c小鼠中，F(xiàn)、N且特別是M2蛋白顯示為CTL活性的主要靶抗原。(Domachowske等，呼吸道合胞病毒感染免疫反應(yīng)、免疫病理和治療，臨床微生物學(xué)綜述(ClinMicrobiol Rev)12298，1999)。病毒特異的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞在清除RSV感染中起到主要作用。血清和粘膜抗體以及MHC I類限制的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTLs)均介導(dǎo)抗RSV感染的保護(hù)。(Brandenburg等，RSV下呼吸道感染的發(fā)病機(jī)理對疫苗研發(fā)的啟示，疫苗(Vaccine)192769，2001)。先前，被動施用中和血清抗體顯示可在動物模型和人中降低RSV疾病的危險。(Groothuis等，靜脈應(yīng)用γ球蛋白被動免疫對呼吸道合胞病毒高危的兒童安全性和藥物動力學(xué)。RSVIG研究組，抗微生物劑的化學(xué)治療(Antimicrob Agents Chemother)。1991年7月；35(7)1469-73；Hemming等，在預(yù)防和治療呼吸道合胞病毒感染中的超免疫球蛋白，臨床微生物述評(Clin Microbiol Rev.)，1995年1月；8(1)22-33.綜述)。
至今為止所研究的疫苗研究包括由RSV的F、G和/或M2蛋白組成的亞單位、肽或DNA疫苗。肌內(nèi)注射編碼RSV的F或G蛋白的pDNA在小鼠中有效(Li等，通過DNA免疫保護(hù)免受呼吸道合胞病毒感染，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J Exp Med)1998年8月17日；188(4)681-8；Li等，編碼呼吸道合胞病毒G蛋白的質(zhì)粒DNA為有希望的侯選疫苗，病毒學(xué)(Virology)。2000年3月30日；269(1)54-65)。在棉鼠模型中，F(xiàn)-G疫苗誘導(dǎo)的中和抗體滴度與活RSV相比低1-2個數(shù)量級。(Prince等，重組嵌合呼吸道合胞病毒FG糖蛋白疫苗在棉鼠中的功效和安全性研究，病毒學(xué)雜志(J Virol)。2000年11月；74(22)10287-92)。應(yīng)用可體內(nèi)表達(dá)引起保護(hù)性細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)的抗原的質(zhì)粒DNA(pDNA)進(jìn)行免疫，宣稱該pDNA與其他疫苗相比具有多種優(yōu)勢。但是，每單位體重應(yīng)用的DNA量以及選擇的施用途徑使這些疫苗并不適于人類應(yīng)用。(Guy等，用于流感片段疫苗的陽離子脂類佐劑的設(shè)計(jì)、特征和臨床前功效，疫苗(Vaccine)191794，2001)。
目前，對于患RSV感染的高危嬰兒的一個可獲得的選擇是，以一個月的間隔被動免疫人源化的抗RSV-F抗原的抗體。盡管不方便、昂貴且部分有效，但由于沒有安全有效的抗RSV疫苗，被動免疫通常被認(rèn)為是唯一的選擇。
因此，仍然需要能夠產(chǎn)生抗RSV的粘膜免疫的DNA疫苗。由于2到6個月的嬰兒最容易感染RSV且疫苗接種優(yōu)選地在一個月齡的嬰兒進(jìn)行，且由于認(rèn)為粘膜疫苗更適于在這些局部和全身免疫系統(tǒng)還不成熟的嬰兒中產(chǎn)生局部免疫，因此粘膜RSV疫苗成為優(yōu)選。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了基因表達(dá)疫苗(GXV)，所述疫苗包含以脫乙酰殼多糖納球形式存在的編碼相應(yīng)RSV抗原的質(zhì)粒DNA的混合物。在第一個實(shí)施方案中，混合物包含的組合含有F、G以及含有M、M2、SH、NS1、NS2、N和P RSV抗原中的至少一個。在一備選實(shí)施方案中，混合物為包含M2和包含F(xiàn)、G、M、SH、NS1、NS2、N和P RSV抗原中至少一個的組合。在另一備選實(shí)施方案中，混合物包含的組合含有F、G、M2和含有M、SH、NS1、NS2、N、P RSV抗原中的至少一個。GXV抗RSV安全且有效，可顯著減輕RSV感染誘發(fā)的肺部炎癥，且可鼻內(nèi)或經(jīng)口施用。不被理論所束縛，且GXV有效性的確切細(xì)胞和分子機(jī)制仍有待研究，但認(rèn)為途徑、免疫原性抗原的組合和/或與脫乙酰殼多糖的結(jié)合可能對其有效性起到作用。
因此，在第一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及抗RSV感染的預(yù)防性粘膜疫苗。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，應(yīng)用RSV基因表達(dá)文庫研發(fā)疫苗，所述疫苗以脫乙酰殼多糖納球形式制劑以通過經(jīng)鼻或經(jīng)口途徑進(jìn)行遞送。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，疫苗的施用并不誘發(fā)呼吸道的高反應(yīng)性。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，提供的基因表達(dá)疫苗具有兩種不同的組分賦予疫苗能力的pDNA混合物以及賦予佐劑活性的脫乙酰殼多糖。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，基因表達(dá)疫苗提供的誘導(dǎo)免疫與活病毒感染所產(chǎn)生的免疫相當(dāng)。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中疫苗以約25μg的混合物/小鼠的單劑提供時是有效的。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生對多抗原，且優(yōu)選地為對9種抗原的抗體。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，公開了制備GXV疫苗的方法，其中將除外L抗原的所有RSV抗原的cDNA克隆到pVAX質(zhì)粒中，且混合物與脫乙酰殼多糖團(tuán)聚以制劑成納球。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，疫苗誘導(dǎo)特異IgG滴度、鼻的IgA滴度增加，并提高IFN-γ在肺以及脾組織中的產(chǎn)量。
本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員從隨后描述的了解中將會明曉其他的對象和優(yōu)點(diǎn)，所述描述參照以下說明性圖表進(jìn)行。
附圖簡述

圖1(A-B)圖1A顯示鼻內(nèi)免疫GXV后RSV cDNA的表達(dá)；泳道Bp為分子量標(biāo)記，標(biāo)為NS1、NS2、M、SH、F、M2、N、G和P的泳道指與RSV cDNA對應(yīng)的PCR產(chǎn)物。圖1B顯示鼻內(nèi)免疫GXV后RSV cDNA的表達(dá)；免疫印跡分析泳道Kd為分子量標(biāo)記；1泳道和2泳道為經(jīng)和未經(jīng)RSV感染的HEp-2細(xì)胞的提取物。
圖2(A-C)圖2A顯示由鼻內(nèi)施用PBS、裸DNA和GXV的小鼠肺中所來源的RSV的空斑形成單位。圖2B顯示鼻內(nèi)施用PBS、裸DNA和GXV的小鼠肺中所來源的RSV的抗原載量，所述抗原載量通過ELISA檢測。圖2C顯示鼻內(nèi)施用PBS、裸DNA和GXV的小鼠對乙酰甲基膽堿的反應(yīng)性，所述反應(yīng)通過全身體積描記器檢測。乙酰甲基膽堿反應(yīng)性測量表示為基線暫停增加(enhanced pause)百分比(Penh)。
圖3(A-C)圖3A顯示GXV免疫后抗RSV抗體反應(yīng)。BALB/c小鼠鼻內(nèi)施用GXV疫苗(25μg)、裸DNA(25μg)或PBS。免疫后14和21天從小鼠中收集血清，并通過ELISA測定抗RSV抗體。圖3B顯示免疫后RSV中和抗體滴度的測定。RSV懸液與多種血清稀釋度(0.01、0.1和1)孵育并進(jìn)行中和。圖3C顯示免疫后鼻洗液的IgA抗體反應(yīng)。免疫14和21天后從動物中收集鼻洗液(i.n)，并通過ELISA測定總IgA抗體水平。
圖4(A-B)圖4A顯示GXV免疫所誘導(dǎo)的RSV特異的CTL的表征。用25μg GXV、25μg裸DNA或PBS免疫小鼠。三周后用RSV持續(xù)感染的纖維母細(xì)胞系BCH4刺激免疫脾細(xì)胞。用未感染的BC細(xì)胞和RSV-感染的BCH4纖維母細(xì)胞作為靶標(biāo)以標(biāo)準(zhǔn)的4小時51Cr釋放試驗(yàn)測定測定CTL活性。圖4B顯示在BAL液中測定的IFN-γ水平。如上描述所免疫的多組鼠在第16天用RSV感染。在第21天對這些鼠進(jìn)行BAL，并通過ELISA測定IFN-γ水平。圖4C測定脾細(xì)胞培養(yǎng)物中IFN-γ水平。如上免疫的多組小鼠在第16天感染RSV。在第21天處死小鼠并將其脾細(xì)胞體外培養(yǎng)在抗CD3抗體包被的平板內(nèi)，通過ELISA測定培養(yǎng)上清中IFN-γ的水平。
圖5圖5顯示小鼠如前描述進(jìn)行免疫，并在第16天感染RSV。四天后，處死這些小鼠，移出肺，并用蘇木素和伊紅(HE)對組織切片進(jìn)行染色。GXV免疫的小鼠與對照相比顯示出較少的上皮損傷和細(xì)胞浸潤。
圖6(A-B)圖6A顯示鼻內(nèi)免疫RGCN后RSV cDNA的表達(dá)。BALB/c小鼠鼻內(nèi)施用克隆在質(zhì)粒載體pVAX內(nèi)的RSV抗原(GXV)。每只小鼠吸入總量為25μg的混合體DNA。三天后完成最后鼻內(nèi)施用后處死動物并從肺的總RNA中進(jìn)行RT-PCR。七種RSV mRNA的表達(dá)得以顯示。圖6B顯示單獨(dú)的GXV并不誘導(dǎo)呼吸道的高反應(yīng)性。BALB/c小鼠經(jīng)口施用RGCN疫苗，并在三天后應(yīng)用全身體積描記器測量呼吸道高反應(yīng)性。接受GXV的動物與接受裸DNA或僅接受PBS(對照)的動物相比呈現(xiàn)出對乙酰甲基膽堿攻擊類似的反應(yīng)。
圖7(A-B)圖7A顯示gRGCN免疫后的抗RSV抗體反應(yīng)。BALB/c小鼠經(jīng)口施用GXV(25μg)、僅施用裸DNA(25μg)或PBS。免疫后第14和21天收集動物的血清，并通過ELISA測定抗RSV抗體滴度。與對照相比，以RGCN疫苗免疫的動物呈現(xiàn)出顯著增高的抗體滴度。圖7B顯示RGCN免疫后的IgA抗體反應(yīng)。BALB/c小鼠經(jīng)口或鼻內(nèi)施用RGCN疫苗(25μg)、僅施用裸DNA(25μg)或PBS。免疫后第14和21天收集動物的糞便塊(經(jīng)口施用)和鼻洗液(鼻內(nèi)施用)，并通過ELISA測定總IgA抗體滴度。
圖8(A-B)圖8A經(jīng)口和鼻內(nèi)免疫小鼠的脾內(nèi)IFN-γ的表達(dá)。接受經(jīng)口和鼻內(nèi)RGCN免疫的小鼠在第16天感染RSV。在第21天，處死動物并在體外培養(yǎng)動物的脾臟或進(jìn)行BAL。α-CD3刺激的脾細(xì)胞的表達(dá)；經(jīng)口免疫的動物比鼻內(nèi)組產(chǎn)生更多的IFN-γ。圖8B顯示經(jīng)口和鼻內(nèi)免疫小鼠的BAL液中IFN-γ的表達(dá)。與經(jīng)口免疫組相比，鼻內(nèi)免疫的小鼠在其BAL液中產(chǎn)生更多的IFN-γ。
圖9圖9顯示經(jīng)口的GXV減輕鼠肺中的肺部炎癥。BALB/c小鼠經(jīng)口施用GXV或裸DNA(共25μg)。動物在第16天后感染RSV并在4天后(第21天)處死。移出肺并用蘇木素和伊紅(HE)染色組織切片。顯示了代表性的顯微圖片。與對照組相比，接受GXV的小鼠出現(xiàn)上皮細(xì)胞損傷減輕和間質(zhì)空間增厚。
詳細(xì)描述在pVAX質(zhì)粒中構(gòu)建RSV基因表達(dá)文庫，且文庫與脫乙酰殼多糖團(tuán)聚以制劑成納球，此處稱為RGCN疫苗。
本發(fā)明提供了這樣的基因表達(dá)疫苗(GXV)，所述疫苗包含編碼相應(yīng)RSV抗原的質(zhì)粒DNA的混合物。該混合物包含F(xiàn)、G、M、M2、SH、NS1、NS2、N和P RSV抗原的組合。該混合物可包含含有F、G和至少一種M、M2、SH、NS1、NS2、N和P RSV抗原的組合。備選地，該混合物可包含含有M2和至少一種F、G、M、SH、NS1、NS2、N和P RSV抗原的組合。另外，備選地，該混合物可包含含有F、G、M2和至少一種M、SH、NS1、NS2、N和P RSV抗原的組合。GXV與脫乙酰殼多糖制劑成納球形式，可生物降解，對人類友好，且陽離子聚合物可增加疫苗的粘膜吸附而無任何的副作用。
脫乙酰殼多糖由于其可保護(hù)基質(zhì)中的DNA免受血清核酸酶降解，使DNA的生物利用度提高，且因此具有成為粘膜基因遞送體系的巨大潛力。脫乙酰殼多糖也具有多種有益的功效，包括抗凝活性，傷口愈合特性，免疫刺激活性，且能夠調(diào)節(jié)粘膜和支氣管相關(guān)淋巴樣組織的免疫性。與裸DNA對照相比，脫乙酰殼多糖納球形式的GXV顯著誘導(dǎo)中和IgG抗體滴度，以及鼻IgA滴度和IFN-γ水平。脫乙酰殼多糖提高了GXV的免疫能力。但是，脫乙酰殼多糖增強(qiáng)抗病毒免疫性的詳細(xì)機(jī)制仍不清楚。需要指出的是，除了非常有效外，GXV還安全，這可通過下述實(shí)驗(yàn)進(jìn)行證明，即與未免疫的感染組相比伴隨于免疫組的總體肺炎癥顯著減輕且在免疫小鼠和未免疫小鼠之間不存在對乙酰甲基膽堿反應(yīng)性的改變?？紤]到先前可加重疾病的不成功的福爾馬林滅活疫苗，該結(jié)果尤其令人鼓舞。
研究了疫苗引起的體液和細(xì)胞免疫。與裸DNA免疫和未免疫對照組相比GXV可顯著提高中和血清和粘膜IgA抗體的水平。盡管分泌型IgA抗體提供的保護(hù)是免受通過粘膜途徑進(jìn)入的病原感染，但分泌型IgA在抗RSV中的作用仍所知甚少。并不希望被理論所束縛，可推測由于RSV是影響上下呼吸道的專性胞內(nèi)粘膜病原，粘膜IgA可能通過阻止RSV進(jìn)入粘膜和/或通過抑制其細(xì)胞-細(xì)胞間合胞體的傳播而避免罹患重癥RSV疾病。
與裸DNA和未免疫對照相比，GXV產(chǎn)生明顯較強(qiáng)的CTL反應(yīng)。這些結(jié)果與其他實(shí)驗(yàn)性疫苗的結(jié)果一致，明確支持疫苗誘導(dǎo)的CTL在病毒清除中的作用。一些研究表明，CTL抗細(xì)胞病變性病毒的保護(hù)性效果依賴于其細(xì)胞因子如IFN-γ的產(chǎn)生。免疫后GXV顯著促進(jìn)可用于抗RSV感染的IFN-γ的產(chǎn)生。IFN-γ具有直接的抗病毒作用，且在刺激天然殺傷(NK)細(xì)胞和CD8+細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)的溶細(xì)胞活性中特別重要，前述細(xì)胞在鼠模型和人類的控制RSV感染中起到關(guān)鍵作用。
除了GXV的免疫調(diào)節(jié)活性，由GXV誘導(dǎo)炎癥的可能性通過對肺切片的免疫組織學(xué)分析進(jìn)行評估。上皮損傷以及血管周、支氣管周和間質(zhì)浸潤細(xì)胞的半定量分析表明，與裸DNA和未免疫小鼠相比GXV使細(xì)胞浸潤和上皮損傷顯著減輕。在裸DNA和GXV間觀察到的顯著差異的原因仍然未知。不希望被理論所束縛，認(rèn)為與裸DNA相比，GXV作為粘膜系統(tǒng)的天然組份，可能其侵染性較低。也可能由于上皮細(xì)胞對裸DNA攝入的減少而導(dǎo)致裸DNA在上皮粘膜下層的積聚加劇了炎癥反應(yīng)。
總之，我們的數(shù)據(jù)證明，GXV代表了抗RSV感染的新型疫苗設(shè)計(jì)，僅1mg/kg體重的單劑就能夠在初次感染時將病毒滴度降低兩個數(shù)量級(100倍)。該疫苗有效性的免疫機(jī)制包括誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的血清IgG和粘膜IgA抗體，產(chǎn)生有效的CTL反應(yīng)，以及提高肺臟特異的具有抗病毒作用的IFN-γ的產(chǎn)生。由于單劑的GXV疫苗非常有效，因此認(rèn)為提高劑量以及初次免疫-加強(qiáng)免疫的策略可進(jìn)一步提高疫苗的效果。此外，GXV顯著減輕肺部炎癥且并不改變呼吸道高反應(yīng)性，這使得該疫苗是安全的。
材料和方法動物六周齡雌性BALB/c小鼠購自Jackson實(shí)驗(yàn)室(Bar Harbor，ME)并在動物中心以無病原條件飼養(yǎng)。所有操作經(jīng)University of South Florida和James A Haley VA Medical Center Committee on Animal Research進(jìn)行審查并批準(zhǔn)。
基因構(gòu)建體，脫乙酰殼多糖納球的產(chǎn)生和基因轉(zhuǎn)移RSV cDNA從RSV感染的小鼠肺cDNA文庫中擴(kuò)增，所述擴(kuò)增通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)應(yīng)用Vent聚合酶(New England Biolabs，Beverly，MA)實(shí)現(xiàn)，并將其克隆到哺乳表達(dá)載體pVAX(Invitrogen，San Diego，CA)中。產(chǎn)生的質(zhì)粒在大腸桿菌DH5α細(xì)胞中增殖。應(yīng)用Qiagen試劑盒(Qiagen，Chatsworth，CA)根據(jù)生產(chǎn)商的說明書進(jìn)行大規(guī)模質(zhì)粒DNA的制備。該方法產(chǎn)生足夠純度的具有最少內(nèi)毒素污染物的DNA。混合pDNA以產(chǎn)生RSVcDNA的混合物。DNA脫乙酰殼多糖納球的產(chǎn)生如由以下所描述Roy，K.，等1999，用脫乙酰殼多糖-DNA納球經(jīng)口遞送基因在花生過敏的鼠模型中產(chǎn)生免疫保護(hù)，自然醫(yī)藥(Nat Med)5387。在鼻內(nèi)免疫的情況下，小鼠在輕度麻醉?xiàng)l件下用DNA混合物脫乙酰殼多糖納球鼻內(nèi)接種三次。每只小鼠接受在脫乙酰殼多糖納球中復(fù)合的總量為25μg的DNA。對照小鼠接受PBS和裸DNA。
疫苗施用小鼠在輕度麻醉下鼻內(nèi)(i.n.)施用GXV(25μg的總DNA/小鼠)。對照小鼠接種PBS或等量的裸DNA。免疫后第16天，小鼠鼻內(nèi)感染1×106pfu的體積為50μl的人RSV A2株(ATCC，Rockville，MD)。感染后(p.i)第5天，處死小鼠，并在無菌條件下取出鼠的肺臟和脾臟進(jìn)行RT-PCR、組織病理研究、細(xì)胞因子和病毒空斑分析。免疫后第14和21天取小鼠血以獲得血清。
動物的病毒感染以及組織、血清的收集最后一次免疫后第16天，小鼠鼻內(nèi)感染1×106pfu的體積為50μl的人RSV A2株(ATCC，Rockville，MD)。感染后(p.i.)第5天，處死小鼠并無菌取出肺臟和脾臟進(jìn)行RT-PCR、組織病理研究、細(xì)胞因子和病毒空斑分析。末次免疫后第14和21天收集鼠血清。
RSV滴度和肺臟中抗原的定量為定量小鼠肺中的RSV滴度，首先取出整個肺臟稱重，然后立即放入含10％FBS的EMEM培養(yǎng)基中。將肺勻漿化，之后于4℃10,000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘。收集清澈的上清并通過0.45μm的甲基纖維素濾器(GelmanSciences，Ann Arbor，MI)。樣本系列稀釋用于空斑試驗(yàn)。生長在24孔中蓋玻片上的Hep-2細(xì)胞(60-70％匯片)用不同稀釋度的肺勻漿覆蓋并1,000轉(zhuǎn)/分鐘離心1小時。這可使病毒快速吸附入細(xì)胞。將細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱中37℃孵育24小時。孵育過后，吸出組織培養(yǎng)基并用PBS洗滌兩次。用冰冷的無水乙醇固定細(xì)胞，干燥，然后在濕盒中與FITC-標(biāo)記的抗-RSV多克隆抗體(Light Diagnostics，Tennecula，CA)孵育30分鐘。用洗滌緩沖液(PBSTPBS+0.05％吐溫-20，pH 7.4)洗滌細(xì)胞兩次并應(yīng)用fluoromount G(Southern Biotechnology Associates，Birmingham，AL)將蓋玻片放置在載玻片上。在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)RSV空斑。
RNA提取和RT-PCR分析根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明應(yīng)用TRIZOL試劑(Life Technologies，Gaithersburg，MD)從肺組織中分離總細(xì)胞RNA。向50-100mg的肺組織加入1ml的Trizol試劑并磨成勻漿。通過吹打?qū)⒎蝿驖{懸浮并置室溫5分鐘進(jìn)行裂解。每管加入氯仿(200μl)并徹底混合。5分鐘后，于15-20℃以12,000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘沉淀細(xì)胞。將清澈的液體上清轉(zhuǎn)移到新管并加入等體積的異丙醇，充分混合，并在15-20℃以12,000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘。用70％的乙醇洗滌RNA沉淀，空氣干燥并溶解在經(jīng)焦碳酸二乙酯處理的水中。對不同的RSV基因進(jìn)行RT-PCR，如以下所描述的Behera，A.K.等，2001，阻斷人上皮細(xì)胞細(xì)胞間的粘附分子1降低呼吸道合胞病毒感染，Biochem Biophys Res Comm 280188。
肺功能為評估免疫組和對照組的肺功能，用GXV免疫小鼠。三天后，用全身體積描記器(Buxco Electronics，Troy，NY)非侵入性評價清醒、自由小鼠的呼吸道反應(yīng)性(即支氣管狹窄)，按以下所描述的進(jìn)行Matsuo K.等，2000，變態(tài)反應(yīng)原致敏的小鼠中復(fù)發(fā)性呼吸道合胞病毒感染導(dǎo)致持續(xù)的呼吸道感染和高反應(yīng)性，J.Immunol 1646583。用此系統(tǒng)，在正常呼吸周期中發(fā)生的體積改變被記錄為含動物的盒和呼吸參照盒間的壓力差異。產(chǎn)生的信號用于計(jì)算呼吸頻率、分鐘體積、潮氣量和暫停增加(Penh)。Penh用于測量支氣管收縮，且由以下的公式計(jì)算Penh＝暫停(pause)×(呼氣壓的峰值/吸氣壓的峰值)，其中暫停為呼出至少30％潮氣量所需時間與呼氣總時間的比值。將小鼠放置在體積描記器內(nèi)并將容器平衡10分鐘。小鼠暴露于霧化的PBS(以建立基線)，之后暴露于逐漸加大劑量(6、12.5、25和50mg/ml)的乙酰甲基膽堿(Sigma Chemicals，St.Louis，MO)中。每一劑量的乙酰甲基膽堿霧化5分鐘，之后記錄5分鐘的呼吸測量值。測量期間，每一變量的平均值來自每30次呼吸(或30秒種，不管哪一個首先發(fā)生)。每一劑量后的最高Penh值用于測量支氣管收縮的程度。
支氣管肺泡灌洗(BAL)、脾細(xì)胞培養(yǎng)和IFN-γ試驗(yàn)對免疫和對照小鼠進(jìn)行支氣管肺泡灌洗。感染后第5天過量注射((0.6g/kg)i.p)戊巴比妥(Nembutal(Abbot Laboratories，North Chicago，IL))處死小鼠，并打開胸腔。用2到3ml的冰冷鹽水沖洗肺血管床。暴露氣管并插入與結(jié)核菌素注射器連接的26G針。然后用0.5ml的PBS灌洗肺三次并收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)。回收的BAL液的體積在灌注的PBS液的75到85％之間。對照和實(shí)驗(yàn)組回收的BAL液的體積不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著差異。離心BAL后收集上清并保存于-70℃，以用于測試細(xì)胞因子。
用于脾細(xì)胞培養(yǎng)時，從BALB/c小鼠的脾臟制備單細(xì)胞懸液，并在包被以抗-CD3 Abs(1μg/ml；克隆17A2，PharMingen，San Diego，CA)的孔內(nèi)培養(yǎng)。應(yīng)用ELISA試劑盒(R & D Systems，Minneapolis，MN)從BALF和24-h培養(yǎng)上清中測試IFN-γ。
總IgA抗體試驗(yàn)從鼻洗液中收集IgA抗體，按如下所述進(jìn)行Matsuo K，等2000，流感疫苗與佐劑(霍亂毒素)聯(lián)合經(jīng)鼻施用誘導(dǎo)天然免疫，疫苗(Vaccine)，182713。將注射針插入鼻咽部較晚的開口，并將總量為1ml的含0.1％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸鹽緩沖液(PBS)注入開口三次；收集流出液作為鼻洗液。離心鼻洗液以移除細(xì)胞殘?jiān)⒂糜贏b試驗(yàn)。進(jìn)行總IgA抗體測試時，將ELISA平板用200ng/孔的抗小鼠IgA抗體(02271D，Pharmingen，San Diego，CA)4℃過夜包被。洗滌三次后，加入樣本并于室溫孵育2小時。再次洗滌后，加入生物素標(biāo)記的抗小鼠IgA(556978，Pharmingen，SanDiego，CA)抗體并將平板繼續(xù)孵育2小時。三次洗滌后，加入抗生物素蛋白過氧化物酶共軛物(1∶10,000，Sigma Chemicals，St.Louis，MO)，并將平板繼續(xù)孵育1小時。加入底物四甲基聯(lián)苯胺(Phariningen，San Diego，CA)顯色后，應(yīng)用自動-ELISA讀數(shù)儀在450nm處讀取吸光度。
抗-RSV抗體試驗(yàn)為定量抗RSV抗體的滴度，用純化的RSV(200ng/孔)4℃過夜包被ELISA平板。洗滌平板并用封閉緩沖液(含1％BSA的PBS，pH 7.4)于37℃封閉1小時。將樣本加到平板并于37℃孵育2小時。再次洗滌平板并加入1∶10,000稀釋的抗小鼠IgG過氧化物酶共軛物(Boehringer Manheim，Germany)，并孵育1小時。三次洗滌后，加入底物，且進(jìn)行20-30分鐘的顯色。應(yīng)用自動-ELISA讀數(shù)儀在450nm處讀取吸光度。
病毒中和試驗(yàn)在第14天獲得的不同稀釋度的血清與100μl的RSV接種物混合，并于37℃孵育1小時?；旌衔镉糜诟腥驹?8孔培養(yǎng)板培養(yǎng)的HEp-2培養(yǎng)物。測定RSV滴度。
免疫印跡將30微克的經(jīng)RSV感染的HEp-2細(xì)胞的提取物在4-20％梯度的SDS-PAGE進(jìn)行分級，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用封閉緩沖液(含5％w/v脫脂奶粉的TBS-0.1％吐溫20，pH 7.6)封閉膜并與從不同免疫組小鼠收集的1∶250稀釋度的血清于4℃過夜孵育。在洗滌緩沖液(TBS-0.1％吐溫-20，pH 7.6)中洗滌膜四次并與抗小鼠IgG過氧化物酶共軛物于室溫孵育1小時。繼續(xù)洗滌四次后，加入ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑(0.125ml/cm2)進(jìn)行印跡染色，前述操作根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明(Amersham Life Sciences，ArlingtonHeights，IL)進(jìn)行。
組織學(xué)觀察及呼吸道感染評分氣管內(nèi)注射PBS后注射10％中性緩沖福爾馬林溶液(Sigma Chemicals，St.Louis，MO)使肺臟膨脹，以將肺部結(jié)構(gòu)保存于膨脹狀態(tài)。肺臟轉(zhuǎn)移到80％乙醇溶液1小時，然后包埋在石蠟中。用蘇木素和伊紅對切片染色。對肺切片中的炎性細(xì)胞進(jìn)行半定量評估，所述肺切片包括肺泡間質(zhì)、支氣管肺泡束和間質(zhì)組織。通過形態(tài)學(xué)評估炎性浸潤的部位、厚度和細(xì)胞成分。
CTL研究在完全RPMI中孵育PBS、GXV和裸DNA免疫的小鼠脾細(xì)胞(2.5×106細(xì)胞/mL)，所述完全RPMI含10U/mL的IL-2和2.5×106細(xì)胞/mL的RSV持續(xù)感染的經(jīng)絲裂霉素(Sigma，St Louis，MO)處理的纖維母細(xì)胞(BCH4細(xì)胞)。在第6天向51Cr-標(biāo)記的RSV-持續(xù)感染(BCH4)或未感染(BC)靶細(xì)胞(1×104)的同源纖維母細(xì)胞中加入不同數(shù)量的效應(yīng)細(xì)胞測試培養(yǎng)物的抗原特異性裂解。37℃孵育5小時后，收獲細(xì)胞上清，在γ計(jì)數(shù)器中測定51Cr。特異裂解百分?jǐn)?shù)按以下計(jì)算[(實(shí)驗(yàn)cpm-自發(fā)cpm)/(總cpm-自發(fā)cpm)]×100。靶細(xì)胞僅與培養(yǎng)基孵育或在加入2.5％Triton X-100孵育后測定的值分別為自發(fā)釋放和總釋放。
結(jié)果粘膜GXV免疫安全且有效為測定鼻內(nèi)施用質(zhì)?；旌衔锖驲SV抗原在肺臟中的表達(dá)，通過RT-PCR在mRNA水平測定所有cDNA的表達(dá)。9個質(zhì)粒中的7個可測出mRNA的表達(dá)，包括NS1、NS2、M、SH、F、M2和N。所有mRNA均為預(yù)期大小。不同mRNA間的表達(dá)存在數(shù)量差異。這些結(jié)果表明鼻內(nèi)施用質(zhì)?？扇菀椎卦诜渭?xì)胞中表達(dá)編碼抗原。
RSV疫苗的最主要的擔(dān)心是炎癥增強(qiáng)。為測試鼻內(nèi)施用GXV疫苗是否可引起呼吸道高反應(yīng)性，在三組動物中測定基線暫停增加百分比(Penh)，三組動物包括PBS對照、裸質(zhì)粒混合物免疫動物或GXV疫苗免疫動物。與接受裸DNA或僅接受PBS(對照)的動物相比，接受GXV疫苗的動物對乙酰甲基膽堿攻擊呈現(xiàn)出類似的反應(yīng)。這些結(jié)果提示GXV疫苗并不引起呼吸道高反應(yīng)性。
為檢測疫苗的效果，BALB/c小鼠鼻內(nèi)施用GXV疫苗或裸DNA。動物在第16天感染RSV且在4天后(第21天)處死。移出肺臟并將肺臟的勻漿用于RSV空斑試驗(yàn)。與PBS對照和裸DNA混合物相比，GXV疫苗免疫小鼠的RSV滴度顯著降低(2到3倍)。肺臟病毒滴度的降低被認(rèn)為是評判疫苗有效性的金標(biāo)準(zhǔn)。這些結(jié)果表明脫乙酰殼多糖提高了pDNA疫苗的功效且GXV為抗RSV感染提供了有效疫苗。
GXV降低了RSV感染誘發(fā)的肺部炎癥在接受GXV疫苗及裸質(zhì)粒DNA混合物的小鼠組中檢測肺部炎癥，并與用生理鹽水處理的對照小鼠進(jìn)行比較。與裸質(zhì)粒免疫組和對照相比，接受GXV疫苗的小鼠組上皮損傷較輕，間質(zhì)和支氣管血管周區(qū)的單核細(xì)胞(MNC)和多形核白細(xì)胞(PMNC)浸潤減少。PBS組與正常未感染小鼠的肺臟組織學(xué)類似，裸DNA免疫出現(xiàn)上皮細(xì)胞破壞，而GXV免疫小鼠顯示出與正常小鼠相當(dāng)?shù)姆闻K表型。這些結(jié)果表明GXV疫苗保護(hù)小鼠免受RSV感染所誘發(fā)的肺部炎癥。
GXV誘發(fā)抗RSV抗體反應(yīng)為確定經(jīng)粘膜施用GXV疫苗是否可在小鼠中誘導(dǎo)產(chǎn)生特異抗體，測定了施用裸質(zhì)?；旌衔锘騁XV疫苗的小鼠中RSV特異抗體滴度。用GXV疫苗免疫的動物的抗體滴度顯著高于對照動物。由于鼻是RSV的主要侵入部位，因此認(rèn)為分泌型IgA抗體對粘膜病原感染起到保護(hù)作用。測量鼻洗液中總IgA抗體水平以證實(shí)該類抗體水平的變化是否是由于疫苗接種的結(jié)果。用GXV疫苗免疫的動物的IgA抗體滴度顯著高于對照動物。這些結(jié)果表明GXV疫苗誘導(dǎo)血清中抗體特別是IgA的分泌。
GXV誘導(dǎo)IFN-γ在肺臟和脾臟中的表達(dá)IFN-γ為主要的抗病毒細(xì)胞因子，因此疫苗必須誘導(dǎo)IFN-γ表達(dá)才能發(fā)揮效應(yīng)。為確定GXV疫苗是否誘導(dǎo)IFN-γ的表達(dá)，用GXV疫苗免疫小鼠，然后在第16天感染RSV。在第21天處死動物，進(jìn)行支氣管肺泡灌洗并體外培養(yǎng)其脾細(xì)胞。GXV免疫的小鼠在其BAL液中產(chǎn)生的IFN-γ顯著高于對照組。此外，用抗-CD3抗體刺激培養(yǎng)的脾細(xì)胞時，GXV免疫的小鼠產(chǎn)生的IFN-γ多于對照組小鼠。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用學(xué)生t檢驗(yàn)對兩組間進(jìn)行比較。p＜0.05時即認(rèn)為組間差異顯著。所有檢測數(shù)值以平均值±SD表述。數(shù)據(jù)在表1中顯示。表1中的每一數(shù)值代表一組(n＝4)中每只鼠的6個單獨(dú)肺切片中5個視野的平均值±SD。小鼠組的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，免疫小鼠的抗原載量(77％)顯著低于PBS對照組，圖2B。這些結(jié)果表明，脫乙酰殼多糖提高了pDNA疫苗的功效，且GXV提供了抗RSV感染的有效疫苗。為檢測鼻內(nèi)施用GXV是否引起呼吸道高反應(yīng)性，在所有的三組動物中測定％基線暫停增加(Penh)。與接受裸DNA或僅接受PBS(對照)的動物相比，接受GXV的動物表現(xiàn)出類似的對乙酰甲基膽堿攻擊的反應(yīng)，圖2C。這些結(jié)果提示，GXV處理本身并不引起呼吸道高反應(yīng)性的任何顯著變化。
血清和粘膜反應(yīng)均為疫苗有效性的重要組分。由于鼻通路是RSV的主要侵入部位，因此認(rèn)為分泌型IgA抗體對粘膜病原感染起到保護(hù)作用。鼻內(nèi)施用的GXV在小鼠中誘導(dǎo)產(chǎn)生特異抗體，測定施用裸質(zhì)?；旌衔锘騁XV的小鼠的RSV特異抗體的滴度。GXV免疫動物的血清抗體滴度顯著高于對照組動物，圖3A。將RSV與從免疫小鼠獲得的血清孵育可降低病毒對HEp-2細(xì)胞的感染，表明免疫后產(chǎn)生了中和抗體，圖3B。與接受裸DNA的小鼠相比，GXV小鼠的中和抗體滴度顯著升高，上述兩組均與對照組存在顯著差異。鼻洗液中檢測出的總IgA抗體的水平證實(shí)此類抗體的變化是由于GXV免疫的結(jié)果。GXV免疫動物的IgA抗體滴度顯著高于對照動物，圖3C。這些結(jié)果表明GXV使血清和鼻IgA中的中和抗體產(chǎn)量提高。差異表述為與PBS對照相比a；P＜0.05，aa；P＜0.01以及aaa；P＜0.001；b；與裸DNA相比P＜0.05。
表1半定量分析病理學(xué)PBS 裸DNAGXV上皮損傷 2.53±0.17 2.25±0.30 1.4±0.52aab間質(zhì)-肺泡浸潤 2.66±0.21 2.36±0.33 1.76±0.35aaa支氣管血管周浸潤 2.01±0.20 1.81±0.57 1.46±0.23a鼻內(nèi)施用GXV導(dǎo)致組成型RSV抗原的有效表達(dá)，應(yīng)用RT-PCR和western印跡分析檢測小鼠的肺組織。特定GXV的肺mRNA的RT-PCR分析結(jié)果顯示，GXV編碼的所有mRNA在肺組織中均可檢測到，圖1A。這些mRNAs翻譯并產(chǎn)生足夠免疫原的證據(jù)通過從這些鼠收集的合并血清(n＝4)中獲得，前述血清在western印跡分析中可與RSV感染的Hep-2細(xì)胞上清中存在的多種RSV抗原進(jìn)行反應(yīng)，圖1B。這些結(jié)果表明GXV誘導(dǎo)產(chǎn)生引起抗體反應(yīng)的RSV抗原。
小鼠施用單劑GXV(DNA總量為25μg)或生理鹽水溶解的裸DNA(對照)。急性活病毒感染后肺病毒滴度分析顯示，與PBS對照相比GXV小鼠中的RSV滴度顯著降低(100倍)，圖2A。施用裸DNA的小鼠的滴度與PBS對照類似，提示經(jīng)鼻內(nèi)途徑施用時裸DNA并不有效。檢測免疫及對照小鼠的總RSV抗原載量，GXV免疫的小鼠用于分析脾中RSV特異的CTL的存在，所述檢測應(yīng)用持續(xù)RSV感染的BCH4作為靶細(xì)胞且應(yīng)用RSV陰性的BC細(xì)胞作為對照。PBS或裸DNA對照并不引起可檢測的CTL反應(yīng)。相反，用GXV免疫的小鼠產(chǎn)生CTL反應(yīng)，圖4A，且這些CTL顯示為CD8+和MHC I類限制性的(數(shù)據(jù)未顯示)。IFN-γ被認(rèn)為是主要的抗病毒細(xì)胞因子。因此，有效的疫苗必須能夠誘導(dǎo)IFN-γ的表達(dá)。從GXV免疫和對照組小鼠的培養(yǎng)脾細(xì)胞和支氣管肺泡灌洗(BAL)中測試IFN-γ。GXV免疫小鼠在其BAL液中產(chǎn)生的IFN-γ明顯多于對照小鼠，圖4B。GXV免疫小鼠的培養(yǎng)脾細(xì)胞用抗CD3抗體刺激后產(chǎn)生的IFN-γ多于對照小鼠，圖4C。
在不同組的小鼠中檢測肺炎癥。代表性病理特征在圖5A中顯示。接受GXV疫苗組的小鼠與對照相比，其上皮損傷較輕，單核細(xì)胞(MNC)和多形核細(xì)胞(PMNC)在間隙和支氣管血管周區(qū)的浸潤減少，圖5。PBS組和裸DNA組的上皮細(xì)胞出現(xiàn)損壞，而GXV免疫小鼠顯示與正常小鼠相當(dāng)?shù)姆伪硇?數(shù)據(jù)未顯示)。這些結(jié)果表明，GXV疫苗保護(hù)小鼠免受RSV感染誘發(fā)的肺部炎癥。應(yīng)用用于肺部炎癥評分系統(tǒng)的半定量分析在表1中顯示。接受GXV疫苗組的小鼠上皮損傷減輕(與PBS組相比P＜0.01，且與裸DNA組相比P＜0.05)且與裸DNA和PBS對照相比肺部炎癥減弱。與PBS對照相比，接受GXV組的小鼠間質(zhì)肺泡浸潤(P＜0.01)和支氣管血管周浸潤(P＜0.05)減輕。用裸DNA對照組未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。這些結(jié)果顯示，GXV可保護(hù)小鼠免受RSV感染誘發(fā)的肺部炎癥。
在此申請中，涉及多種出版物。這些出版物全部引用作為參考并入本申請，以更完整地描述屬于本發(fā)明的領(lǐng)域。
以上描述的實(shí)施例僅用于示例的目的，且并不意在限定本發(fā)明的范圍或?qū)嵤┓桨?。并未特別描述的其他實(shí)施方案為領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員所熟知。由此應(yīng)認(rèn)為這些實(shí)施方案位于本發(fā)明的范圍和精神之內(nèi)。因此，本發(fā)明僅由以下的權(quán)利要求所正確限定。
權(quán)利要求
1.用于保護(hù)宿主免受由呼吸道合胞病毒(RSV)所導(dǎo)致疾病的免疫原性組合物，其包含F(xiàn) RSV抗原；G RSV抗原；以及至少一種M、M2、SH、NS1、NS2、N或P RSV抗原。
2.權(quán)利要求1的免疫原性組合物，其中所述組合物為粘膜疫苗。
3.用于保護(hù)宿主免受由呼吸道合胞病毒(RSV)所導(dǎo)致疾病的免疫原性組合物，其包含M2 RSV抗原；以及至少一種F、G、M、SH、NS1、NS2、N或P RSV抗原。
4.權(quán)利要求3的免疫原性組合物，其中所述組合物為粘膜疫苗。
5.用于保護(hù)宿主免受由呼吸道合胞病毒(RSV)所導(dǎo)致疾病的免疫原性組合物，其包含F(xiàn) RSV抗原；G RSV抗原；M2 RSV抗原；以及至少一種M、SH、NS1、NS2、N或P RSV抗原。
6.權(quán)利要求5的免疫原性組合物，其中所述組合物為粘膜疫苗。
7.用于保護(hù)宿主免受由呼吸道合胞病毒(RSV)所導(dǎo)致疾病的基因表達(dá)疫苗，其包含含有至少兩種RSV抗原的組合的質(zhì)粒DNA混合物，所述RSV抗原選自F、G、M、M2、SH、NS1、NS2、N和P；其中所述質(zhì)粒DNA混合物與脫乙酰殼多糖團(tuán)聚以形成納球。
8.權(quán)利要求7的基因表達(dá)疫苗，其中疫苗施用并不引起呼吸道高反應(yīng)性。
9.權(quán)利要求7的基因表達(dá)疫苗，其中所述疫苗為粘膜疫苗。
10.權(quán)利要求9的基因表達(dá)疫苗，其中所述粘膜疫苗有利于經(jīng)口施用。
11.權(quán)利要求9的基因表達(dá)疫苗，其中所述粘膜疫苗有利于鼻內(nèi)施用。
12.權(quán)利要求7的基因表達(dá)疫苗，其中所述疫苗的施用誘導(dǎo)IFN-γ的表達(dá)。
13.免疫宿主以使其免受呼吸道合胞病毒(RSV)感染所引起疾病的方法，其包括向所述宿主施用免疫有效量的組合物，所述組合物包含含有至少兩種RSV抗原的組合的質(zhì)粒DNA混合物，所述RSV抗原選自F、G、M、M2、SH、NS1、NS2、N和P；其中所述質(zhì)粒DNA混合物與脫乙酰殼多糖團(tuán)聚以形成納球。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述施用為經(jīng)口或鼻內(nèi)施用。
15.權(quán)利要求13的方法，其中所述施用并不誘發(fā)呼吸道高反應(yīng)性。
16.權(quán)利要求13的方法，其中所述免疫有效量以單劑量施用。
17.權(quán)利要求13的方法，其中所述免疫有效量為約1mg/kg宿主重量。
18.制備基因表達(dá)疫苗的方法，其包括在pVAX質(zhì)粒中克隆入至少兩種呼吸道合胞病毒抗原的cDNA以形成質(zhì)粒DNA混合物；以及將質(zhì)粒DNA混合物與脫乙酰殼多糖團(tuán)聚。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述團(tuán)聚步驟導(dǎo)致形成納球。
20.權(quán)利要求18的方法，其中呼吸道合胞病毒抗原選自F、G、M、M2、SH、NS1、NS2、N和P。
全文摘要
一種有效的預(yù)防性粘膜基因表達(dá)疫苗(GXV)，由編碼相應(yīng)RSV抗原的至少4種不同的質(zhì)粒DNA混合物組成，與脫乙酰殼多糖團(tuán)聚以形成納球。在RSV感染的鼠模型中，鼻內(nèi)施用GXV導(dǎo)致顯著地誘導(dǎo)產(chǎn)生RSV特異抗體、鼻IgA抗體、細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞以及顯著增加肺和脾細(xì)胞中IFN－γ的產(chǎn)生。單劑量的GXV使病毒滴度顯著降低。
文檔編號A61P17/02GK1578672SQ02821492
公開日2005年2月9日 申請日期2002年2月12日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月28日
發(fā)明者S·S·莫哈普特拉, M·庫馬爾, S-K·黃, K·W·萊翁 申請人:南佛羅里達(dá)大學(xué), 約翰斯·霍普金斯大學(xué)