專利名稱：對(duì)映艾里莫芬烷酸及其抑制乙肝表面抗原的醫(yī)藥用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及從黑紫橐吾中分 離得到的兩個(gè)對(duì)映艾里莫芬垸酸組成的混合物及其可藥用鹽以及藥物 組合物。該天然產(chǎn)物具有抑制乙肝表面抗原活性，可預(yù)期制備治療乙肝 病毒感染疾病和抗乙肝病毒藥物中的藥物用途。技術(shù)背景乙型肝炎是由乙型肝炎病毒引起的傳染病。通過(guò)血液與體液傳播， 具有慢性攜帶狀態(tài)。本病在我國(guó)廣泛流行，人群感染率高，在某些地區(qū)感染率達(dá)到35%以上。據(jù)有關(guān)資料，肝炎檢測(cè)陽(yáng)性的患者已經(jīng)達(dá)到1.89 億，而應(yīng)就診未就診人數(shù)(攜帶者)將近4億。是當(dāng)前危害人民健康最嚴(yán) 重的傳染病之一。乙肝臨床表現(xiàn)多樣化，易發(fā)展為慢性肝炎和肝硬化， 少數(shù)病人可轉(zhuǎn)變?yōu)樵l(fā)性肝癌?，F(xiàn)在乙型肝炎的治療主要有核苷類藥 物、保肝類藥物和免疫制劑等，但均不能完全控制病情的進(jìn)展。目前核 苷類藥物中最常用也是最有效的是拉米夫啶，但其長(zhǎng)期使用可導(dǎo)致耐藥 性，停藥后易反跳，這嚴(yán)重影響了藥物的療效。目前使用的抗病毒藥物其實(shí)只是病毒復(fù)制的抑制劑，并不能直接殺 滅病毒和破壞病毒體，否則就會(huì)損傷宿主細(xì)胞。這些抗病毒藥物還存在 毒副作用大、易引起病毒基因突變、停藥后易反跳等缺點(diǎn)，因此開(kāi)發(fā)新 型抗病毒藥是當(dāng)今藥物研發(fā)領(lǐng)域的當(dāng)務(wù)之急。橐吾屬(Ligularia genus)是菊科的一個(gè)小屬，全屬約130種，絕 大多數(shù)種類產(chǎn)于亞洲，僅2種分布于歐洲，另有齒葉橐吾[Ligularia dentate (A. Gray) Hara]在英國(guó)有栽培或逸生。我國(guó)有111種，大部分種類集中于西南地區(qū)。本屬一些種類的根含橐吾醚、橐吾醚醇、橐吾 醇、艾里橐吾醇、橐吾酮、橐吾內(nèi)酯等化學(xué)成分，并以紫苑或山紫苑之 名入藥。主治支氣管炎、哮喘、肺結(jié)核、咯血、肝炎等癥[S. W. Liu， 中國(guó)植物志?？茖W(xué)出版社，1989，第4頁(yè)]。在橐吾屬植物中倍半祐的含 量較高。人們從該屬植物中分得了多種新的倍半萜類化合物，其中不少具有各種各樣的生物活性，這對(duì)我們進(jìn)一步尋找新骨架倍半萜以及新的 活性靶點(diǎn)，提供了雄厚的物質(zhì)基礎(chǔ)。黑紫橐吾[Ligularia atroviolacea (Franch.) Hand.-Mazz.]為多 年生草本植物。根肉質(zhì)，多數(shù)。莖直立，不分枝，高25-60厘米，被密 的黑紫色有節(jié)長(zhǎng)柔毛，上部近花序處混生白色蛛絲狀毛，基部直徑3-5 毫米，被枯存葉柄纖維包圍。小花全部管狀，多數(shù)，黃色，長(zhǎng)6-7毫米， 管部長(zhǎng)約3毫米，冠毛淡黃色，與花冠近等長(zhǎng)。瘦果圓柱形，長(zhǎng)約5毫 米，光滑?；ü?-12月。產(chǎn)于云南西北部。生于海拔3000-4000米 的冷杉林下、高山草地[S. W. Liu，中國(guó)植物志?？茖W(xué)出版社，1989，77 頁(yè)，41頁(yè)]。云南民間用于清熱解毒及治療感冒、咳嗽用。本發(fā)明人在對(duì) 菊科橐吾屬植物和菊科千里光屬的提取及化學(xué)成分研究中，曾經(jīng)發(fā)現(xiàn)其 中含有大量的艾里莫芬烷內(nèi)酯，如近年來(lái)發(fā)明人發(fā)現(xiàn)巖生千里光中的艾 里莫芬烷內(nèi)酯具有對(duì)腫瘤細(xì)胞HL-60， A549和KB株均有一定的細(xì)胞毒 性(趙昱等，Chinese Chemical Letters, 2002年，13巻第4期，333-334 頁(yè))。此外，本發(fā)明人還報(bào)道了雞足千里光的幾個(gè)艾里莫芬烷內(nèi)酯也對(duì) KB腫瘤細(xì)胞株和A549細(xì)胞株有一定的細(xì)胞毒性(趙昱等，Chinese Chemical Letters, 2002年，13巻第8期，754-757頁(yè);趙昱等，Chinese Chemical Letters, 2005年，16巻第3期，362-364頁(yè))。但是，對(duì)于 黑紫橐吾的化學(xué)成分研究和生物活性研究尚少見(jiàn)報(bào)道。黑紫橐吾的化學(xué) 成分研究至今只有一篇文獻(xiàn)報(bào)道[R. Hanai等，Chemical and genetic study of Ligularia tongolensis， Ligulaxia cymbulifera and Ligularia atroviolacea in the Hengduan mountains of China. Bulletin Chemical Society of Japan, 2005， 78， 1302—1308],作者 使用薄層層析TLC檢出其中主要成分為Ehrlich反應(yīng)呈陽(yáng)性的化合物， 而這些化合物由于穩(wěn)定性差而難于分離，所以作者采用液相層析與質(zhì)譜 聯(lián)用(LC-MS)以及液相層析與核磁共振波譜聯(lián)用(LC-畫(huà)R)等技術(shù)結(jié) 合1H-1HC0SY以及HSQC等二維波譜技術(shù)手段鑒定出其中三個(gè)主要成分 為呋喃雅檻藍(lán)烷倍半萜3 e -當(dāng)歸酰基-呋喃并艾里莫芬烷-15， 6 a -內(nèi) 酯、3P,6e-二當(dāng)歸?；?呋喃并艾里莫芬垸-15酸和3P-當(dāng)歸酰基 -60-(3-甲基丁?；?呋喃并艾里莫芬垸-15酸。而迄今，尚未見(jiàn)科研人 員對(duì)該植物進(jìn)行深入以及系統(tǒng)的化學(xué)和藥理活性研究，因此選用該植物 進(jìn)行化學(xué)成分和有關(guān)的藥理活性研究，是一種比較理想的選擇，不僅可以填補(bǔ)歷史空白，還可以為以后更進(jìn)一步的研究提供事實(shí)依據(jù)。本發(fā)明人在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上作了進(jìn)一步的研究，發(fā)現(xiàn)從橐吾屬藥 用植物黑紫橐吾中提取的兩種艾里莫芬型倍半萜酸異構(gòu)體具有顯著的 抑制乙肝表面抗原乙肝病毒作用，并經(jīng)文獻(xiàn)查閱，到目前為止，尚沒(méi)有 有關(guān)該化合物治療乙肝病毒感染性疾病和制備抗乙肝病毒藥物的報(bào)道。 據(jù)此完成本發(fā)明。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供了由式(卜a)和式(l-b)所示的兩個(gè)對(duì)映艾 里莫芬垸酸組成的混合物及其可藥用鹽，以及含有該二化合物的藥物組 合物或其溶劑化物，具體地說(shuō)是該兩個(gè)對(duì)映艾里莫芬烷酸在治療乙肝病 毒感染性疾病和制備抗乙肝病毒藥物中的應(yīng)用。<formula>formula see original document page 5</formula>式(l-a)式(1-b)其中式(1-a)化合物為10 0-氫-8-酮-艾里莫芬烷-3(4)，6(7)-二烯 -12，15-二酸；式(1-b)化合物為lOci-氫-8-酮-艾里莫芬垸 -3 (4) ， 6 (7) -二烯-12, 15-二酸。本發(fā)明中式(l-a)和式(1-b)所示對(duì)映艾里莫芬烷酸優(yōu)選從菊科 橐吾屬植物中分離純化得到。本發(fā)明的又一目的是提供了式(1)化合物用于制備降低乙肝表面 抗原、防治乙型病毒性肝炎的藥物用途；本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供了一種用于降低乙肝表面抗原、防治乙 型病毒性肝炎的藥物組合物或者它的可藥用鹽和可藥用輔料及溶劑化 物，其特征為含有治療有效量的作為活性成分的由式(1-a)和式(l-b) 化合物組成的混合物。其藥物劑型可以是片劑、膠囊劑、注射劑、氣霧 劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、貼片劑、皮下植埋劑、外用搽劑、口服液或 軟膏劑，還可以采用現(xiàn)代制藥界所公知的控釋或緩釋劑型或納米制劑。本發(fā)明中式(1-a)和式(l-b)化合物來(lái)源可以是黑紫橐吾Ligularia atroviblacea (Franch.) Hand. -Mazz.的任一部位，即可以是其根、莖、 葉、種子、皮、果實(shí)，也可以是它們的混合物。優(yōu)選其地下部分。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明人對(duì)該植物提取物通過(guò)多種正、反相層析手段得到該有效抑 制乙肝表面抗原(HBsAg)的分泌活性的一個(gè)活性化合物，又經(jīng)紅外、 質(zhì)譜、紫外和核磁共振波譜等綜合解析推導(dǎo)出其化學(xué)結(jié)構(gòu)為前人未報(bào)道 過(guò)的兩個(gè)結(jié)構(gòu)新穎的艾里莫芬垸酸倍半萜對(duì)映體。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，采用 MTT法測(cè)定式(l-a)和式(l-b)化合物對(duì)H印G2. 2. 15細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制 作用，從黑紫橐吾中提取的式(l-a)和式(l-b)化合物對(duì)H印G2.2.15 細(xì)胞生長(zhǎng)的無(wú)明顯抑制作用，而對(duì)H印G2. 2. 15細(xì)胞分泌的乙肝表面抗 原(HBsAg)的分泌具有顯著的抑制作用，提示式(1-a)和式(l-b) 化合物具有用藥安全、降低乙肝病毒表面抗原高效的特點(diǎn)。因此，根據(jù) 本發(fā)明人的研究，從黑紫橐吾中提取的式(l-a)和式(1-b)化合物可 以用于治療乙肝病毒感染性疾病和用于制備治療乙肝病毒感染性疾病 的藥物。為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面分別用式(卜a)和式(l-b) 化合物對(duì)H印G2. 2. 15細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用以及對(duì)H印G2. 2. 15細(xì)胞分泌的 HBsAg之抑制作用試驗(yàn)的結(jié)果，說(shuō)明其在制藥領(lǐng)域中的新用途。其中Me 代表甲基(CH3) ， 0Et代表乙氧基(0CH2CH3)。實(shí)施例給出了式(l-a) 和式(l-b)化合物的部分活性數(shù)據(jù)。必須說(shuō)明，本發(fā)明的實(shí)施例是用 于說(shuō)明本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行 的簡(jiǎn)單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。實(shí)施例1:式(卜a)化合物10e-氫-8-酮-艾里莫芬烷-3(4)，6(7)-二 烯-12，15-二酸以及式(1-b)化合物lOa-氫-8-酮-艾里莫芬烷 -3 (4) ， 6 (7) -二烯-12， 15-二酸的制備1. 1儀器與試劑熔點(diǎn)用顯微熔點(diǎn)儀(北京泰克公司生產(chǎn))測(cè)定，溫度未校正；旋光在 日本產(chǎn)Polax-2L型自動(dòng)旋光儀上測(cè)定；紅外光譜IR由BrukerVector-22紅外光譜儀測(cè)定，經(jīng)KBr壓片；紫外光譜用Shimadzu UV-240 紫外分光光度計(jì)測(cè)定；核磁共振氫譜1H-麗R，核磁共振碳譜13C-麗R 和2D麗R由IN0VA型超導(dǎo)核磁共振波譜儀(VARIAN INOVA-400 MHz) 測(cè)定(四甲基硅醚TMS為內(nèi)標(biāo))；電噴霧質(zhì)譜ESI-MS由Bruker Esquire 3000+質(zhì)譜儀測(cè)定，柱層析用硅膠(100-200， 200-300和300-400目)以 及薄層層析用硅膠GF254(10-40目)均由青島海洋化工廠生產(chǎn)；所用試 劑均為分析純，其中石油醚沸程為60-90°C;薄層制備層析(PTLC)用 Merck公司的鋁箔硅膠板；柱色譜用聚酰胺(14-30和100-200目)采用 浙江省臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠產(chǎn)品；葡聚糖凝膠S印hadex LH-20 采用瑞典Amersham Pharmacia Biotech AB公司產(chǎn)品；反相硅膠RP-18 采用日本Fuji Silysia Chemical公司的Chromatorex產(chǎn)品；MCI為日 本三菱化工公司產(chǎn)品，薄板(TLC)檢測(cè)用254mn和365nm的紫外燈；顯 色劑用碘蒸氣、10%硫酸-乙醇以及磷鉬酸溶液。1.2提取與分離供提取用黑紫橐吾藥材地下部分于2001年8月采自于云南麗江境 內(nèi)。取5. 0公斤干燥的黑紫橐吾Ligularia atroviblacea (Franch.) Hand. -Mazz.地下部分粉碎成粉末，加50升95%乙醇浸泡。在室溫下浸 泡3次，每次7天。乙醇提取液合并，減壓回收溶劑至干得到462克浸 膏，用3公升水分散，再依次用60—90。石油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃 取。減壓回收醋酸乙酯提取液得到89.0克浸膏。該浸膏用800克100 一200目硅膠柱層析，氯仿一甲醇(50: 0—0: 1)梯度洗脫。薄層層析 檢測(cè)合并相同流份，含有式(1)化合物的部分浸膏再經(jīng)制備薄層(60 一90°，石油醚一醋酸乙酯4: 1)繼以葡聚糖凝膠S印hadexLH-20柱層 析純化(甲醇洗脫)，最終得到45毫克式(1)化合物。丄3結(jié)構(gòu)鑒定化合物(1-a)為白色粉末狀固體，ESI-MS顯示分子離子峰m/z 279 [M+H]+，結(jié)合13C-腿R譜和1H-匪R譜顯示的碳以及氫的個(gè)數(shù)，推算出化 合物(1-a)的分子式為"H1805，氫譜中顯示兩個(gè)甲基，從化學(xué)位移以及 裂分情況顯示化合物(l-a)為一艾里莫芬烷類倍半萜。在薄層TLC板上 溴甲酚綠顯藍(lán)色，說(shuō)明化合物中具有羧基。1H-腿R譜的低場(chǎng)區(qū)顯示兩個(gè)烯氫[S 7.37 (1H,單峰)，H-6; 7.17 (1H,三重峰，J".0Hz)， H-3] 的信號(hào)，表明與此兩烯碳相鄰的碳原子分別為季碳和叔碳，結(jié)合13C-NMR 譜中低場(chǎng)區(qū)出現(xiàn)的幾對(duì)碳信號(hào)[S 142.9 (CH)， 135.9 (C) ， 17L 9 (C) 和S 152.8 (CH)， 132.9 (C)， 197.3 (C)]顯示化合物中具有3 (4)-烯 -15酸和6(7)-烯-8-酮基團(tuán)。此外，13C-畫(huà)R譜還顯示結(jié)構(gòu)中存在飽和 羧基(S 180.5)。從1H-麗R譜中H-11的化學(xué)位移向低場(chǎng)移動(dòng)[S 3.85 (四重峰，J = 7. 2 Hz)]，可推測(cè)12位甲基被氧化成羧基?？紤]到1H-麗R 譜中兩個(gè)甲基信號(hào)分別出現(xiàn)在5 1.27 (雙峰，J二7.2Hz)和S 1.51(單 峰)，初步判斷化合物(1-7)的骨架是含8-酮-3(4)，6(7)-二烯-12, 15-二酸[8-oxo-3(4)，6(7)-dien-12， 15-dioic acid]結(jié)構(gòu)的艾里莫芬烷類 化合物?；衔锝Y(jié)構(gòu)確定的難點(diǎn)是10-H構(gòu)型的確定，化合物(1-a)的譜 圖數(shù)據(jù)與化合物10 e -H-3 P -angeloyloxy-8-0X0-eremophi 1-6 (7)-en-12 oic acid的數(shù)據(jù)非常相似僅有的區(qū)別在于化合物(1-a)中3位脫 去當(dāng)歸?；呻p鍵且15位的甲基被氧化成羧基。通過(guò)與10位氫構(gòu)型 不同的已知化合物的1H-麗R譜和13C-麗R譜進(jìn)行對(duì)照，確定IO位為3 _ 構(gòu)型。因此，化合物(1-a)的結(jié)構(gòu)最終被確定為10 P -氫-8-酮-艾里莫芬 烷-3(4)，6(7)- 二烯-12， 15- 二酸H-8-0X0-eremophi1-3(4)， 6(7)_dien-12， 15-dioic acid]。化合物(1-b)的1H-麗R和13C-麗R譜與化合物(1-a)的非常相似， 根據(jù)13C-麗R和DEPT譜可得出化合物(l-b)中共有15個(gè)碳，包括2 X CH3， 3XCH2， 4XCH(含兩個(gè)烯氫)，6XC(含兩個(gè)羧基和一個(gè)酮基)，也與化合 物(1-a)的元素構(gòu)成相同，這表明化合物(1-b)可能是化合物(l-a)的的 一個(gè)對(duì)映異構(gòu)體。進(jìn)一步比較化合物(1-b)和化合物(l-a)的1H-麗R和 13C-麗R譜數(shù)據(jù)，也驗(yàn)證了這一推測(cè)。二者在薄層TLC板上在不同的體 系下均為一個(gè)斑點(diǎn)存在，難以分離，因此是和化合物(l-a)以混合物的 形式存在(從1H-麗R和13C-麗R譜上信號(hào)峰的強(qiáng)度可以初步推斷出質(zhì)量 比約為2: 3)。化合物(1-b)和(l-a)在HPLC上也很難達(dá)到基線分離，且 紫外UV掃描圖譜十分相似，因此也可以推斷出兩化合物為結(jié)構(gòu)非常相 似可能為一對(duì)映異構(gòu)體。二者13C-匪R譜數(shù)據(jù)最顯著的差別是化合物 (1-b)中C-IO的次甲基的信號(hào)由S 36.4向低場(chǎng)位移至S 39.4，而C-14 (S 15, 6)和C-13 ( S 26. 6)較(1-a)的(5 16. 9和S 27. 2)略向高場(chǎng)位移。 另外，在1H-麗R譜中，化合物(1-b)的Me-14信號(hào)由于A/B環(huán)稠合方式的改變而向低場(chǎng)位移。其它C和H的化學(xué)位移也或多或少的發(fā)生了變化。 所有這些數(shù)據(jù)表明，化合物(l-b)的10-H應(yīng)是ci-構(gòu)型。因此，化合物(卜b)的結(jié)構(gòu)被鑒定為10(1-氫-8-酮-艾里莫芬烷 -3 (4) ， 6 (7) - 二烯-12， 15- 二酸[10 a 8-oxo-eremophi 1-3 (4) ， 6 (7) -dien-12， 15-dioic acid]。10 P -氫-8-酮-艾里莫芬垸-3 (4) ， 6 (7) -二烯-12， 15-二酸[10 e -H-8-oxo-eremophil-3 (4), 6 (7) -dien-12， 15-dioic acid (I-a)]:白色粉 末；C15H1805;紫外光譜UV A max (CHC13) : 216， 240 (肩峰)nm;電 噴霧質(zhì)譜ESI-MSm/z: 279 [M+H] + ;紅外IR v盟;(cm-1) : 3184， 1741， 1728， 1663:核磁共振氫譜1H-NMR (CDC13, 400 MHz) S 1.27 (3H,雙 峰，J 二 7. 2 Hz, H-13)， 1.51 (3H，單峰，H-14), 1.28 (1H，多重峰，H-la)， 1.52 (1H，多重峰，H-lb)， 1.97 (1H，多重峰，H-10P)， 2.24 (1H，多 重峰，H-2a)， 2.31 (IH，多重峰，H-2b)， 2.31 (1H，雙雙峰，J = 16.4， 4.8HzH-9a)， 2.50 (1H，雙雙峰，J = 16. 4， 4. 8 Hz， H—9b)， 3.85 (1H, 四重峰，J二7.2Hz， H-ll)， 7.17 (1H，三重峰，J 二 4. 0 Hz， H_3)， 7.37 (1H，單峰，H-6);核磁共振碳譜13C-應(yīng)R (CDC13， 100 MHz) S 17. 0 (q， C-13)， 22.3 (t， C-l)， 22.7 (t， C-2) ， 27.2 (q, C-14), 36.4 (d， C-10)， 38.1 (C—5, s), 39.3 (t， C—9)， 40.2 (d， C一ll)， 132.9 (s， C—7)， 135.9 (d， C一4)， 142.9 (t， C一3)， 152.8 (t， C—6)， 171.9 (s, C-15)， 180.5 (s， C-12), 197.3 (s, C-8)。10 ci -氫-8-酮-艾里莫芬烷-3 (4) ， 6 (7) -二烯-12， 15-二酸[10 a -H-8-oxo-eremophil-3 (4) ， 6 (7) -dien—12, 15-dioic acid (I-b) ] 白色粉 末；C15H1805;紫外光譜UV入max (CHC13) : 220， 240 (肩峰)nm;電 噴霧質(zhì)譜ESI-MS m/z: 279 [M+H] + ;核磁共振氫譜1H-麗R (CDC13, 400 MHz) S 1.31 (3H，雙峰，J = 7.2Hz， H-13)， 1.52 (3H，單峰，H-14)， 1.36 (1H，多重峰，H-la)， 1.59 (1H,多重峰，H-lb)， 1.89 (1H，多重 峰，H-10ci)， 2.26 (1H，多重峰，H-2a)， 2.32 (1H，多重峰，H-2b)， 2.32 (1H,雙雙峰，J=16.4， 4.8Hz， H-9a)， 2.51 (1H，雙雙峰，J 二 16.4， 4.8 Hz, H-9b)， 3.49 (1H，四重峰，J = 7. 2 Hz, H—11), 7.37 (1H，三 重峰，J二4.0Hz, H-3)， 7.24 (1H，單峰，H-6) ; 13C-應(yīng)R (CDC13, 100 MHz) S 15.6 (q, C—13)， 22.7 (t， C-l)， 23.5 (t， C—2)， 26.6 (q， C-14), 39.7 (d， C-10)， 38,5 (C-5， s), 39.4 (t， C-9)， 40.5 (d， C-11)133.2 (s， C-7)， 135.2 (d， C一4), 143,8 (t， C—3)， 152.8 (t， C—6)， 171.2 (s， C—15)， 179.4 (s， C—12)， 198.3 (s， C一8)。實(shí)施例2:由化合物(l-a)和(l-b)組成的混合物對(duì)H印G2. 2. 15細(xì)胞分泌 的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的抑制作用。1) 細(xì)胞培養(yǎng)將H印G2. 2. 15細(xì)胞培養(yǎng)于含10%滅活胎牛血清，100U/ml青霉素和 100 u g/ml鏈霉素，100 u g/mlG418的DMEM培養(yǎng)基中，置37°C， 5%C02， 100 %相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2) 采用MTT法測(cè)定由式(l-a)和式(l-b)化合物組成的混合物對(duì) H印G2. 2. 15細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H印G2.2.15細(xì)胞，用培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋成IX 105/ml,接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100ul，在37i:， 5% C02， 100 %相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后加入用培養(yǎng)基稀釋的由化合物 (l-a)和U-b)組成的混合物，濃度分別為誦ug/ml， 200ug/ml， 40ug/ml和8ug/ml，每孔200ul，每個(gè)濃度設(shè)三個(gè)復(fù)孔，置于37。C， 5%C02, 100%相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)72小時(shí)后，每孔加入 5mg/mgMTT試劑10ul，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，棄去培養(yǎng)基，每孔加入DMS0 200ul，用振蕩器振蕩20分鐘，在570nm波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀測(cè)定0D值。 以只加培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔為對(duì)照孔。抑制率(%)=對(duì)照孔0D值-實(shí)驗(yàn)組0D 值)/對(duì)照孔0D值X10(m。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。測(cè)定上述混合物對(duì)乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的抑制作用。取對(duì) 數(shù)生長(zhǎng)期的H印G2.2. 15細(xì)胞，用培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋成lX105/ml，接種 于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100ul，在37。C， 5%C02， 100%相對(duì)濕度 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后加入用培養(yǎng)基稀釋的樣品，濃度分別為 100 u g/ml， 20 u g/ml和40 u g/ml，每孔200 u 1，每個(gè)濃度設(shè)三個(gè)復(fù)孔， 置于37。C, 5% C02， 100%相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每4天換含相同 濃度樣品的培養(yǎng)基，將同 一樣品同 一濃度的換出的培養(yǎng)基等體積混勻， 作為待測(cè)樣品。用ELISA試劑盒測(cè)定培養(yǎng)基中乙型肝炎表面抗原(HBsAg) 濃度，以P/N表示；以拉米呋啶(3-TC)為陽(yáng)性對(duì)照。3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，從黑紫橐吾中提取得到的由式(1-a)和式 (l-b)化合物組成的混合物有顯著的抑制乙型肝炎表面抗原(HBsAg) 的作用。其對(duì)H印G2. 2. 15細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)明顯抑制作用，但對(duì)H印G2. 2. 15 細(xì)胞分泌的乙型肝炎表面抗原HBsAg在第八天時(shí)高、中、低劑量下抑制 活性都高于拉米呋啶。表l.樣品對(duì)他 02.2.15分泌的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)懶摔(％)樣品濃度Ug/mL)HBsAg卿庫(kù)(％)第四天第八天式(1-a)和式(l-b) 化合物組成的混合物10020442. 51 25. 5748. 52 33.59 9.23拉米呋啶(3TC)100 20417. 28/ /10. 54該實(shí)施例結(jié)果說(shuō)明式(l-a)和式(1-b)化合物組成的混合物對(duì) H印G2.2.15細(xì)胞分泌的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)具有顯著的抑制作 用，可預(yù)期發(fā)展為降低乙型肝炎表面抗原、控制病毒性乙型肝炎癥狀的 藥物。
權(quán)利要求
1.由式(1-a)和式(1-b)所示的兩個(gè)對(duì)映艾里莫芬烷酸組成的混合物及其可藥用鹽，其特征為式(1-a)化合物的名稱為10β-氫-8-酮-艾里莫芬烷-3(4)，6(7)-二烯-12，15-二酸；式(1-b)化合物的名稱為10α-氫-8-酮-艾里莫芬烷-3(4)，6(7)-二烯-12，15-二酸。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述之對(duì)映艾里莫芬烷酸及其可藥用鹽或其溶劑化 物，其用于制備治療乙型病毒性肝炎藥物之用途。
3. —種用于制備治療乙型病毒性肝炎病毒感染的相關(guān)癥狀或疾病的藥 物組合物，其含有作為活性成分的治療有效量的權(quán)利要求1所述之 對(duì)映艾里莫芬烷酸及其可藥用鹽或其溶劑化物和可藥用載體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3的藥物組合物，其可以是片劑、顆粒劑、膠囊、口 服液、洗劑、栓劑、擦劑、注射劑、透皮貼劑或氣霧劑，還可以采 用現(xiàn)代制藥界所公知的控釋或緩釋劑型或納米制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及從黑紫橐吾中分離得到的由兩個(gè)對(duì)映艾里莫芬烷酸組成的混合物及其可藥用鹽以及藥物組合物。由于該對(duì)映艾里莫芬烷酸具有抑制乙肝病毒表面抗原活性，可預(yù)期用于制備治療乙型肝炎病毒感染疾病的藥物用途。
文檔編號(hào)A61K31/194GK101239054SQ20081006004
公開(kāi)日2008年8月13日 申請(qǐng)日期2008年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月5日
發(fā)明者艷 徐, 施樹(shù)云, 李校堃, 王彩芳, 王曉雨, 約阿施·史托克希特, 昱 趙, 黃可新 申請(qǐng)人:溫州醫(yī)學(xué)院