專利名稱：用作顯影劑的微囊包封的氟化氣體的制作方法
背景技術：
本發(fā)明主要涉及診斷顯影劑領域，具體涉及微囊包封的超聲成像造影劑。
當用超聲得到人或動物體內器官和結構的圖像時，頻率在人耳可分辨頻率以上的聲能量波，即超聲波在其穿過身體時被反射。不同類型的身體組織對超聲波的反射不同，檢測由不同內部結構反射超聲波而產生的回聲并將其電信號轉變成可視顯示。
對于某些醫(yī)學疾病來說，得到所關注的器官或結構的有用圖像是特別困難的，因為在沒有對比增強(contrast-enhancing)劑的情況下，通過超聲波反射產生的超聲圖像不足以鑒別結構的詳細情況和周圍組織。通過將一種試劑注入所關注的器官或其它結構，增強超聲圖像中的對比，可以從根本上改進特定生理和病理學疾病的檢測和觀察。在其它情況下，對比增強劑本身運動的檢測是特別重要的。例如，已知是因特定心血管失常而導致的特殊血流式樣只有通過將造影劑注入血液中并觀測血流動態(tài)才能分辨出。
當超聲波穿過身體并被反射產生了用于醫(yī)學診斷的圖像時，用作超聲造影劑的材料因對超聲波有作用而得以發(fā)揮作用。不同類型的物質以不同的方式影響超聲波，而且影響程度不同。此外，由對比增強劑引起的特定作用比其他方式更容易檢測觀察。在選擇用于對比增強劑的理想組合物時，人們更愿意選擇那些在超聲波穿過身體時對超聲波有最大影響的物質。另外，對超聲波的影響應很容易檢測。在超聲波成像中可觀察到三種主要的對比增強作用反散射，束衰減和聲速差。
反散射當通過身體的超聲波碰到結構如器官或其它身體組織時，結構反射一部分超聲波。體內不同結構以不同方式和不同強度反射超聲波能。這種反射的能量可以被檢測并用于產生超聲波所穿過之結構的圖像。術語“反散射”指超聲波被具有特定物理特性的物質散射回其源頭的現象。
長時間來已經認識到，已知的能引起大量反散射的物質的存在，可以增強在超聲波圖像中所觀察到的對比。將這種物質施用于身體的不同部分時，這部分身體的超聲波圖像與不含所述物質的周圍組織的超聲波圖像之間的對比被增大。很容易理解的是，由于物理特性不同，所以不同的物質引起反散射的程度不同。因此，有關對比增強劑的研究集中在穩(wěn)定無毒并有最大反散射的物質上。
物質引起超聲波能量反散射的能力取決于該物質的特性，如其被壓縮的能力。在試驗不同的物質時，需要比較物質引起反散射之能力(稱為“散射截面”)的特定測量值。特定物質的散射截面與散射物半徑成正比，并取決于超聲波能量的波長和所述物質的其他物理特性。J.Ophir and K.J.Parker,Contrast Agents in Diagnostic Ultrasound,Ultrasoundin Medicine&Biology,vol.IS,n.4,p319,323(1989)。
在評估不同物質作為成像造影劑的實用性時，人們計算哪種試劑有較大的散射截面和因此哪種試劑在超聲成像中可提供最大的對比。可以設想固體顆粒的可壓縮性比周圍介質的要小得多，并且顆粒的密度大得多。利用該假設，固體顆粒對比增強劑的散射截面估計是1.75。Ophirand Parker，同上文，325頁。對于純液體散射物來說，散射物和周圍介質的絕熱壓縮性和密度可能基本相同，這樣可能會產生液體散射截面為零的結果。但是，如果存在大量的液體試劑，液體也可以有某些反散射。例如，如果液體試劑從一個很小的容器穿過進入一個液體基本上占有了所有容器的很大容器，則所述液體就可檢測到反散射。然而，本領域技術人員可以理解，與游離氣體微泡相比，純液體是相對無效的散射物。
束衰減在特定固體對比增強劑存在下，可觀察到的另一種作用是超聲波的衰減。由于特定類型組織之間的定位的衰減差，在傳統(tǒng)成像中觀察到了圖像對比。K.J.Parker and R.C.Wang,“Measurement ofUltrasonic Attenuation Within regions selected from B-Scan Images”,IEEETrans.Biomed.Enar.BME30(8),p431-37(1983)；K.J.Parker,R.C.Wang,and R.M.Lerner,“Attenuation of Ultrasound Magnitude andFrequency Dependence for Tissue Characterization,”Radiology,153(3),p.785-88(1984)。已經假設在注入試劑前后所進行的組織區(qū)域衰減的測量可產生增強的圖像。但是，以衰減對比為基礎的作為檢測液體試劑對比增強的方法的技術并未得到很大的發(fā)展，即使成功地發(fā)展了，可能也受該技術可應用的內部器官或結構的限制。例如，在心血管系統(tǒng)的成像中，不可能觀察到因液體造影劑而引起的衰減損失，因為在檢測到衰減的實質性差異前，在特定的脈管中需要存在大量的液體造影劑。
由顆粒引起的能量吸收是通過稱為“相對運動”的機制發(fā)生的。因相對運動引起的衰減的變化隨顆粒濃度線性增加而且是顆粒和周圍介質之間密度差的平方。K.J.Parker等，“A Particulate Contrast Agentwith Potential for Ultrasound Imaging of Liver,”Ultrasound in Medicine&Biology,vol.13,No.9,p555,561(1987)。因此，在固體顆粒顯著積累的情況下，衰減對比對于觀察圖像對比增強來說是一種可行的機制，盡管效果比反散射現象差很多，而且在心血管診斷中沒有太大的用途。
聲速差另一種增強超聲成像的對比技術是基于聲速隨它所通過的介質而變化的事實提出的。因此，如果將足夠大量的試劑注入到靶區(qū)內(穿過試劑的聲速與穿過周圍組織的聲速不同)，可就測量到穿過靶區(qū)的聲速差。
總之，診斷超聲波是一種能用于得到身體內部器官的信息的有效的非侵入性工具?；译A成像和彩色多普勒的出現大大提高了該技術的范圍和分辨率。盡管用于完成診斷超聲波以及制備和使用造影劑的技術已有顯著的改進，但是仍需要提高心灌注、心腔成像、實體器官、腎灌注、實體器官灌注的成像分辨率以及在實時成像中血液速度和流動方向的多普勒信號。
各種天然和合成的聚合物已被用于包封成像造影劑，如空氣。Schneider等人在Invest.Radiol.,vol.27,pp.134-139(1992)中描述了3微米空氣填充的聚合物顆粒。報道這些顆粒在血漿和應用壓力下是穩(wěn)定的。但是，在2.5MHz，它們的回聲很低。另一類微泡懸浮液是從聲處理的白蛋白得到的。Feinstein等，J.Am.Coll.Cardiol.,vol.11,pp.59-65(1988)。Feinstein描述了微泡的制備，所述微泡按照跨肺通道制成適宜的大小并有極好的體外穩(wěn)定性。但是，這些微泡由于其在壓力下的不穩(wěn)定性，所以在體內壽命很短，半衰期約為幾秒(近似等于一個循環(huán))。Gottlieb,S.等,J.Am.Soc.Echo.,Vol.3,p.328(1990)，摘要；以及Shapiro,J.R.等人，J.Am.Coll.Cardiol.,Vol.16,pp.1603-1607(1990)。Carroll等(Carroll,B.A.等，Invest.Radiol.,Vol.15,pp.260-266(1980)和Carroll,B.A.等，Radiology,Vol.143,pp.747-750(1982))描述了明膠-包囊的空氣泡，但由于它們尺寸大(12和80μm)，它們不可能通過肺毛細血管。Rasor Associates,Inc在PCT/US80/00502中已描述了明膠包囊的微泡。這些是通過“結合”明膠而形成的。
Fritzsch等已報道了用半乳糖微晶(SHU454和SHU508)穩(wěn)定的微泡。Fritzsch,T.等，Invest.Radiol.Vol.23(Suppl1),pp.302-305(1988)和Fritzsch,T.等，Invest.Radiol.Vol.25(Suppl1),pp.160-166(1990)。所述微泡在體外持續(xù)達15分鐘，但在體內不到20秒。Rovai,D.等，J.Am.Coll.Cardiol.,Vol.10,pp.125-134(1987)和Smith,M.等J.Am.Coll.Cardiol.,Vol.13,pp.1622-1628(1989)。
Schering Aktiengesellschaft的歐洲專利申請90901933.5公開了用于超聲成像的微囊包封的氣體或揮發(fā)性液體的制備和用途，其中所述微囊是由合成聚合物或多糖形成的。Sintetica S.A.的歐洲專利申請91810366.4(0458745A1)公開了用界面間沉積的聚合物膜結合的空氣或氣體微球，其可被分散在含水載體中以注射到宿主動物中或用于經口、直腸或尿道給藥，以達到治療或診斷目的。Deka BiotechnologyLimited的WO92/18164描述了微粒的制備方法，即在嚴格控制溫度、噴霧速率、顆粒大小和干燥條件的條件下，通過噴霧干燥蛋白質水溶液以形成其中封有氣體的用于成像的中空球。WO93/25242描述了用于超聲成像的微粒的合成，所述微粒由聚氰基丙烯酸酯或聚酯殼內包含的氣體組成。WO92/21382公開了包括含氣體的共價結合的基質的微粒造影劑的制備，其中所述基質是碳水化合物。Unger的美國專利5334381、5123414和5352435描述了用作超聲波造影劑的脂質體，其包括氣體、氣體前體，如pH激活或光激活的氣體前體，以及其它的液體或固體對比增強劑。
Quay的美國專利5393524公開了包括碳氟化合物的試劑用于增強超聲波圖像中的對比的用途。所述試劑由所選氣體的極小泡或微泡組成，它們在溶液中有較長的壽命并且很小足以通過肺，從而可用于心血管系統(tǒng)和其他重要器官的超聲波成像中。Nycomed的WO95/23615公開了用于成像的微囊，所述微囊是通過含全氟化碳的溶液如蛋白質溶液的凝聚而形成的。Nycomed Imaging A/S的WO95/06518公開了聚合物基的造影劑，其中將氣體微泡用非聚合的壁形成的阻斷或接枝共聚物表面活性劑包封。制備時將氣體摻入造影劑中。沒有認識到用氟化氣體代替空氣可增強微粒的回聲性。Glajch等的美國專利5147631描述了用于成像的摻入了氣體(可以是氟化氣體)的無機多孔顆粒。當然，這些不是合成的聚合物微粒。Massachusetts Institute of Technology的PCT/US94/08416公開了由聚乙二醇-聚(丙交酯-共-乙交酯)嵌段聚合物形成的微粒，其中包封了顯影劑，包括氣體如空氣和全氟化碳。如在Sonus Pharmaceuticals,Inc.的WO94/16739中所描述的，盡管固體和液體對聲波的反射程度相似，但是已知氣體是更有效的而且對于用作超聲波造影劑來說是優(yōu)選的介質。事實上，如Sonus PCT申請的實施例12所表明的，當施用給迷你豬時，與乳化液或膠體懸浮液相比，由于涉及安全性(以及效率問題)，已經不再使用蛋白質微囊。
在這些情況下，都需要增強成像劑的回聲性，并提高或保持顯影劑的穩(wěn)定性和制備的容易性。
因此，本發(fā)明的目的是提供由具有顯著增強的回聲性的合成聚合物制備的微粒。
本發(fā)明概述現已發(fā)現與包封空氣的微球相比，將氟化氣體，特別是全氟化碳如八氟丙烷摻入到合成的聚合物微粒，特別是多孔海綿樣微球中能顯著提高回聲性。微囊包封的氟化氣體制備成適合于待成像的靶組織的直徑，如為用于血管內施用而使直徑在0.5-8微米之間，為經口施用用于胃腸系統(tǒng)或其它腔的成像而使直徑在0.5-5毫米之間。本發(fā)明的詳細說明本發(fā)明提供了由含有氟化氣體，特別是含有全氟化碳的合成的聚合物微粒組成的聚合物運載體系的合成方法。在許多診斷超聲成像應用中，尤其是在例如血管成像和超聲心電圖檢查的超聲診斷方法中所述微粒是有用的。與摻入空氣的相同合成聚合物微粒相比，氟化氣體的摻入大大增強了回聲。制備微粒的方法和試劑除非另有說明，本發(fā)明所用術語“微?！卑ㄎ⑶蝮w、微囊以及微粒。微粒可以是或不是球形。微囊定義為具有包封另一種物質核心的聚合物外殼的微粒，本發(fā)明中另一種物質核心是氣體。如下所述，微球體一般是固體聚合物球體，其包括由穿過充滿了成像用氣體的聚合物的孔所形成的蜂窩狀構造。聚合物不能生物降解的和可生物降解的基質均能用于氟化氣體的運載，不過尤其是對于靜脈注射而言，優(yōu)選使用可生物降解基質。不易腐蝕的聚合物可用于口服給藥。優(yōu)選合成聚合物，因其更易于重復合成和生物降解。根據體內穩(wěn)定所需時間，即根據分散到需成像部位所需時間以及成像所需時間來選擇聚合物。在一個實施方案中，可以制備體內穩(wěn)定時間為約20-30分鐘或更長時間的微粒，其可用于例如超聲心動圖檢查、neurosonography、子宮輸卵管照相術以及對實體器官的診斷方法的應用中。在制備過程中通過使用聚合物，例如，聚(丙交酯-共-乙交酯)與聚乙二醇(PEG)的共聚物能調節(jié)包封的造影劑微粒的體內穩(wěn)定時間。由于PEG是高度親水的，所以如果PEG暴露于外表面則可延長這些物質的循環(huán)時間。
具代表性的合成聚合物是聚羥基酸如聚乳酸、聚乙醇酸和聚(乳酸-共-乙醇酸)，聚乙交酯，聚丙交酯，丙交酯與乙交酯的共聚物和摻混物，聚酐，聚原酸酯，聚酰胺，聚碳酸酯，聚烯烴如聚乙烯和聚丙烯，聚亞烷基二醇如聚乙二醇，聚烯化氧如聚環(huán)氧乙烷，聚對苯二甲酸亞烷基二酯如聚對苯二甲酸乙二酯，聚乙烯基醇，聚乙烯基醚，聚乙烯基酯，聚鹵乙烯如聚氯乙烯，聚乙烯吡咯烷酮，聚硅氧烷，聚乙烯醇，聚乙酸乙烯酯，聚苯乙烯，聚氨酯及其共聚物，衍生的纖維素如烷基纖維素、羥烷基纖維素、纖維素醚、纖維素酯、硝基纖維素、甲基纖維素、乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥丁基甲基纖維素、乙酸纖維素、丙酸纖維素、乙酸丁酸纖維素、乙酸鄰苯二甲酸纖維素、羧乙基纖維素、三乙酸纖維素和硫酸纖維素鈉鹽(本發(fā)明中統(tǒng)稱為“合成纖維素”)，丙烯酸、甲基丙烯酸的聚合物或其共聚物或衍生物，包括酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯、聚甲基丙烯酸丁酯、聚甲基丙烯酸異丁酯、聚甲基丙烯酸己酯、聚甲基丙烯酸異葵酯、聚甲基丙烯酸十二酯、聚甲基丙烯酸苯酯、聚丙烯酸甲酯、聚丙烯酸異丙酯、聚丙烯酸異丁酯和聚丙烯酸十八醇酯(本發(fā)明中統(tǒng)稱為“聚丙烯酸”)，聚丁酸，聚戊酸和聚(丙交酯-共-己內酯)，其共聚物和混合物。本發(fā)明中所用術語“衍生物”包括經過了取代作用、化學基團，例如，烷基、亞烷基的加成作用、羥基化作用、氧化作用和本領域技術人員按常規(guī)進行的其它修飾作用的聚合物。
優(yōu)選的非生物降解的聚合物實例包括乙烯乙酸乙烯酯、聚(甲)丙烯酸、聚酰胺及其共聚物和混合物。
優(yōu)選的可生物降解的聚合物實例包括羥基酸，例如，乳酸和乙醇酸的聚合物、聚丙交酯、聚乙交酯、聚(丙交酯-共-乙交酯)及其與PEG的共聚物、聚酐、聚原酸酯、聚氨酯、聚丁酸、聚戊酸和聚(丙交酯-共-己內酯)。通常，這些物質通過非酶催和酶催水解并通過表面和整體腐蝕在體內降解。
如在胃腸系統(tǒng)中的粘膜表面成像中，人們尤其愿意使用的生物粘合劑聚合物包括聚酐、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯、聚甲基丙烯酸丁酯、聚甲基丙烯酸異丁酯、聚甲基丙烯酸己酯、聚甲基丙烯酸異葵酯、聚甲基丙烯酸十二酯、聚甲基丙烯酸苯酯、聚丙烯酸甲酯、聚丙烯酸異丙酯、聚丙烯酸異丁酯和聚丙烯酸十八醇酯。溶劑如本發(fā)明所定義，聚合物溶劑是揮發(fā)性的或具有相對低沸點或能在真空條件下去除且以痕量對人體進行給藥是可接受的有機溶劑，例如，二氯甲烷。也可使用其它溶劑，例如，乙酸乙酯、丙酮、乙腈、四氫呋喃(THF)、乙酸、DMSO、氯仿或其混合物。通常，將聚合物溶解在溶劑中以形成重量對體積濃度為0.1-60％(w/v)，更優(yōu)選為0.5-30％的聚合物溶液。氟化氣體任何生物相容的或藥理上可接受的氟化氣體均能被摻入微粒中。術語“氣體”是指任何是氣體或在成像溫度下能形成氣體的化合物。氣體可以由單一化合物或化合物的混合物組成。優(yōu)選全氟化碳氣體。氣體的實例包括CF4、C2F6、C3F8、C4F8、SF6、C2F4和C3F6。特別優(yōu)選全氟丙烷，因為它是一種在使用溫度下不冷凝且藥理上可接受的不溶氣體。微粒及其制備方法在最優(yōu)選的實施方案中，通過噴霧干燥制備微粒。如下所述，制備微粒也可使用其它技術，例如，溶劑萃取、熱融包封和溶劑蒸發(fā)。
在優(yōu)選的實施方案中，然后通過使所需氣流與微球體相接觸或對微球體抽真空除去包封的氣體后填充所需氣體，從而完成氣體的替換。
a．溶劑蒸發(fā)法。在該方法中，將聚合物溶解在揮發(fā)性有機溶劑，如二氯甲烷中。將固態(tài)的或在水溶液中的造孔劑加入該溶液中。聲處理或均化混合物，所得分散液或乳化液加入含有表面活性劑，例如，TWEENTM20、TWEENTM80、PEG或聚乙烯醇的水溶液中并均化以形成乳化液。攪拌所得乳化液直至大部分有機溶劑蒸發(fā)，得到微球體?？墒褂靡恍┎煌木酆衔餄舛?0.05-0.60g/ml)。用該方法能得到不同大小(1-1000微米)和形態(tài)的微球體。該方法對相對穩(wěn)定的聚合物如聚酯和聚苯乙烯是有效的。
E.Mathiowitz等人在J.Scanning Microscopy,4,329(1990)中，L.R.Beck等人在Fertil.Steril.,31,545(1979)中以及S.Benita等人在J.Pharm.Sci.,73,1721(1984)中均描述了溶劑蒸發(fā)的方法。
然而，由于水的存在，所以在制備過程中不穩(wěn)定的聚合物如，聚酐是可降解的。對于這些聚合物，下述兩種在完全的有機溶劑中進行的方法是有效的。
b．熱融微囊包封法。在該方法中，首先熔化聚合物，然后與造孔劑的固體顆粒相混合?；旌衔飸腋≡诓蝗芑斓娜軇?如硅油)中，在連續(xù)攪拌的同時，將其加熱至聚合物熔點以上5℃。一旦乳化液穩(wěn)定，則將其冷卻直至聚合物顆粒固化。通過用聚合物非溶劑，如石油醚進行潷析來洗滌所得微球體以得到自由流動的粉末。用該方法能得到大小為1-1000微米的微球體。用該技術制得的球體外表面一般是光滑和致密的。該方法用于制備由聚酯和聚酐制得的微球體。然而，該方法僅適用于分子量為1000-50,000的聚合物。
E.Mathiowitz等人在Reactive Polymers,6,275(1987)中描述了熱融微囊包封方法。用熱融微囊包封方法能制備，例如，由羧基苯氧基丙烷和癸二酸按20∶80的摩爾比(P(CPP-SA)20∶80)(分子量20,000)制成的聚酐或可制備聚(富馬酸-共-葵二酸)(20∶80)(分子量15,000)空心微球體。
c．溶劑去除法。該技術主要適用于聚酐。在該方法中，將造孔劑分散或溶解在含有所選聚合物的揮發(fā)性有機溶劑如二氯甲烷中。通過攪拌將該混合物懸浮在有機油(如硅油)中以得到乳化液。與溶劑蒸發(fā)方法不同，該方法能用于由具有高熔點和不同分子量的聚合物制備微球體。用該技術制得的球體的外形很大程度上取決于所用聚合物的類型。
d．微粒的噴霧干燥法。通過噴霧干燥法能制備微粒，即將生物相容的聚合物溶解在適當的溶劑中，將造孔劑分散在聚合物溶液中，然后噴霧干燥聚合物溶液以形成微粒。如本發(fā)明所定義，“噴霧干燥”聚合物與造孔劑的溶液的過程是指將溶液霧化以形成細霧并通過與熱載運氣體的直接接觸進行干燥的過程。使用現有的噴霧干燥器，聚合物溶液由噴霧干燥器的入口部分引進，流過干燥器中的導管，然后霧化通過出口部分。溫度隨所用氣體或聚合物而改變?？煽刂迫肟诤统隹诓糠值臏囟葋碇苽渌璁a物。
聚合物溶液的微粒大小隨噴霧聚合物溶液所用的噴嘴、噴嘴壓力、流速、所用聚合物、聚合物濃度、溶劑類型、噴霧溫度(入口和出口溫度)以及分子量而改變。一般，假設濃度相同，那么分子量越高，包囊體積越大。噴霧干燥的典型操作參數如下聚合物濃度=0.005-0.10g/ml，入口溫度=30-200℃，出口溫度=20-100℃，聚合物流速=5-200ml/min，噴嘴直徑=0.2-4mm(內徑)。能得到具有一定形態(tài)的直徑為1-10微米的微球體，其形態(tài)取決于所選擇的聚合物、濃度、分子量和霧狀流動。
e．水凝膠微球體。通過下述步驟可制備由凝膠型聚合物，例如，聚磷腈或聚甲基丙烯酸甲酯制成的微球體將聚合物溶解在水溶液中，將造孔劑懸浮在該混合物中并經微滴形成裝置擠出，形成的微滴流入由電荷相反離子或聚電解質溶液組成的緩慢攪拌的硬化浴中。該方法的優(yōu)點在于在制備完成后，通過用聚陽離子聚合物，如多熔素覆蓋產物的表面可以進一步修飾微球體表面。通過使用不同大小的擠出機來控制微球體顆粒。促進微粒形成的添加劑在含造影劑的微粒合成過程中可加入各種表面活性劑。可使用的典型乳化劑或表面活性劑(0.1-5重量％)包括大多數生理上可接受的乳化劑，例如，蛋卵磷脂，大豆卵磷脂或合成卵磷脂，如飽和合成卵磷脂，例如，二肉豆蔻酰卵磷脂、二棕櫚酰卵磷脂或二硬脂酰卵磷脂或不飽和合成卵磷脂，例如，二油酰卵磷脂或二亞油酰卵磷脂。乳化劑還包括表面活性劑，例如，游離脂肪酸，脂肪酸與聚氧化烯化合物的酯，如聚氧亞丙基二醇和聚氧亞乙基二醇，脂肪醇與聚氧亞烷基二醇的醚，脂肪酸與聚氧亞烷基化脫水山梨糖醇的酯，皂，甘油聚烯烴硬脂酸酯，甘油聚氧乙烯蓖麻醇酯，聚亞烷基二醇的均聚物和共聚物，聚乙氧基化的豆油和蓖麻油及其加氫衍生物，蔗糖或其它碳水化合物與脂肪酸、脂肪醇的醚和酯(可任選被聚氧化烷基化)，飽和或不飽和脂肪酸、甘油酯或豆油的單、雙或三甘油酯以及蔗糖。
其它乳化劑包括與氨基酸相連或不相連的天然或合成的膽汁鹽或膽汁酸，例如，?；敲撗跄懰猁}和膽酸。所列乳化劑能穩(wěn)定噴霧干燥前產生的微泡。
用量為0.01％-75％(重量對體積)之間的造孔劑能促進孔的形成。例如，在溶劑蒸發(fā)方法中首先將造孔劑，如揮發(fā)性鹽，例如，碳酸氫銨、乙酸銨、氯化銨或苯甲酸銨或其它凍干的鹽溶解在水中。將含造孔劑的溶液與聚合物溶液一起乳化以便在聚合物中形成造孔劑液滴。然后噴霧干燥該乳化液或將其進行溶劑蒸發(fā)/萃取。在聚合物沉淀后，冷凍和凍干硬化的微粒以除去造孔劑。微粒大小在優(yōu)選的實施方案中，為了制備能透過肺狀毛細血管床的可注射微粒，所制微粒應具有約1-10微米的直徑。較大的微粒會堵塞肺狀床，而較小的微粒不能提供足夠的回聲。較大的微粒對于注射以外的給藥途徑是有效的，注射之外的給藥途徑可以是，例如，口服(用于胃腸系統(tǒng)的評估)，經其它粘膜表面(直腸、陰道、口、鼻)的給藥途徑或經吸入法。口服給藥的優(yōu)選顆粒大小為約0.5微米和5毫米。有效的藥理上可接受的載體包括含甘油和TWEENTM20的鹽水以及含TWEENTM20的等滲壓甘露糖醇。用光顯微鏡、掃描電鏡、透射電鏡在庫耳特顆粒計數器上可進行顆粒大小的分析。靶向通過選擇形成微粒的聚合物、微粒的大小和/或配體對微粒的結合或附著，可使微粒被特定或非特定靶向。例如，可將生理活性分子或能影響微粒的電荷、親油性或親水性的分子結合到微粒的表面。另外，可將那些能最小化組織粘合或能利于體內微球體的特定靶向的分子與微粒相結合。有代表性的靶向分子包括抗體、外源凝集素以及其它的能被特定類型的細胞表面的受體特定結合的分子。對網狀內皮系統(tǒng)的攝入的抑制通過選擇聚合物和/或選擇能使粘合或攝入最小化的分子的結合或偶合，也能使微粒的攝入和去除最小化。例如，通過聚亞烷基二醇部分與微粒表面的共價結合能使由微粒引起的組織粘合最小化。微粒表面的聚亞烷基二醇部分對水具有高親和力，從而降低了顆粒表面對蛋白質的吸附作用。因而也就降低了網狀內皮系統(tǒng)(RES)對微粒的識別和攝入。
例如，聚亞烷基二醇的末端羥基能使生理活性分子或能影響微粒電荷、親油性或親水性的分子共價結合到微粒的表面。本領域現有方法可用來使很寬范圍內的任何配體結合到微粒上以提高微粒在體內的運載特性、穩(wěn)定性或其它的性質。診斷應用微粒一般與藥理上可接受的載體，例如，磷酸鹽緩沖鹽水或鹽水或甘露糖醇相結合，然后經適當途徑，一般是經血管注射(靜脈注射)或經口服對患者進行有效量給藥。含包封顯影劑的微?？捎糜诿}管成像、肝腎疾病的檢測應用、心臟病學的應用、腫瘤塊和組織的檢測和表征以及外圍血流速度的檢測中。如下所述，微粒還能與那些能最小化組織粘連或能將微粒靶向體內特定區(qū)域的配體相結合。
參照下述非限制性實施例進一步說明上述方法和組合物。實施例1充有空氣的PEG-PLGA微球體的制備將6.0克PEG-PLGA(75∶25)(120,000 Da mw)溶解在400ml二氯甲烷中。向聚合物中加入6.7ml水，并且用Virtis均化器以10,000RPM均化聚合物/水混合物1分鐘。用蠕動泵以20ml/min的流速泵送溶液并用Bucchi Lab噴霧干燥器進行噴霧干燥。入口溫度是50℃，出口溫度是30℃。收集微球體粉末并在室溫下凍干48小時。在數均值為2.0微米和體積平均值為4.5微米的庫耳特顆粒計數器上測得顆粒直徑為1-10微米。掃描電鏡表明具有光滑表面和不規(guī)則表面細褶皺的顆粒一般是球形的。透射電鏡表明顆粒是包囊狀顆粒與海綿狀顆粒的混合物。實施例2充有空氣的PEG-PLGA微球體的制備將7.1克PEG-PLGA(75∶25)(120,000 Da mw)溶解在320ml二氯甲烷中。向聚合物中加入11ml濃度為0.74g/ml的乙酸銨，并且用Virtis均化器以16,000RPM均化聚合物/乙酸銨混合物1分鐘。用蠕動泵以20ml/min的流速泵送溶液并用Bucchi Lab噴霧干燥器進行噴霧干燥。入口溫度是32℃，出口溫度是19℃。收集微球體粉末并在室溫下凍干48小時。在數均值為1.8微米和體積平均值為5.1微米的庫耳特顆粒計數器上測得顆粒直徑為1-10微米。掃描電鏡表明具有光滑表面和不規(guī)則表面細褶皺的顆粒一般是球形的。實施例3充有八氟丙烷的PEG-PLGA微球體的制備將實施例2中制備的微球體分散在54mg甘露糖醇/ml和0.5％PLURONICTMF127的溶液中。將分散液等分到5ml管瓶中。在-80℃下冷凍管瓶并凍干過夜。實施例4充有八氟丙烷的PLGA微球體的制備將7.4克PLGA(75∶25)(120,000 Da mw)溶解在360ml二氯甲烷中。向聚合物中加入7.3ml濃度為0.74g/ml的乙酸銨，，并且用Virtis均化器以16,000RPM均化聚合物/乙酸銨的溶液1分鐘。用蠕動泵以20ml/min的流速泵送溶液并用Bucchi Lab噴霧干燥器進行噴霧干燥。入口溫度是32℃，出口溫度是20℃。收集微球體粉末并在室溫下凍干48小時。在數均值為2.0微米和體積平均值為5.2微米的庫耳特顆粒計數器上測得顆粒直徑為1-10微米。掃描電鏡表明具有光滑表面和不規(guī)則表面細褶皺的顆粒一般是球形的。將實施例2中制備的微球體分散在54mg甘露糖醇/ml和0.5％PLURONICTMF127的溶液中。將分散液等分到5ml管瓶中。在-80℃下冷凍管瓶并凍干過夜。在10pisg壓力下向管瓶中填充八氟丙烷并在氣體中連續(xù)吹洗3分鐘。此后在-20℃下保存管瓶24小時然后在4℃保存直至被使用。實施例5微囊包封空氣顆粒的體內評估將雄性新西蘭兔(2-2.5kg)固定過夜。用鹽酸氯胺酮(100mg/ml,0.7ml)和tompum(20mg/ml,0.5ml)麻醉動物。通過位于左耳靜脈中的導液管以一定的劑型經大約5秒進行靜脈注射給藥。給藥后，用1ml普通鹽水沖洗導液管。重構之前將所有管瓶平衡至室溫。在注射前不超過2分鐘的時間內進行劑型重構。重構過程是將1ml水加入管瓶中，同時通過拉出5ml注射器上的活塞使得管瓶中的氣壓平衡至大氣壓，抽出注射針并回蕩管瓶直至親液物全部溶解從而可。用裝備有C7-4高分辨換能器的ATL HDI3000臨床超聲成像儀進行心臟超聲成像。發(fā)射強度應使Tls為0.3和MI為0.8。幀速為39Hz，深度設為9.7cm，以Map6和55dB的動態(tài)范圍進行成像。在進行給藥之前、給藥之間和給藥之后進行成像。用B-型進行心臟成像，并調節(jié)儀器設置以使心腔盡可能無回聲。將成像的所有設置記錄在VHS帶上，同時繼續(xù)成像直至檢測不到信號。
以26.2mg/kg的劑量用實施例1制備的微球體(Lot943-110-1)對兔(#13)實施給藥。在10秒內，觀察到大量可產生回聲的物流流入并裝滿右心房。該物流流入右心房并裝滿右心室。實際上，兩個心腔中的強度是相等的。流入左心室時觀察不到回聲。右心房和右心室的增強持續(xù)大約30秒。實施例6微囊包封全氟化碳顆粒的體內評估以24mg/kg的劑量用實施例3制備的微球體(Lot952-7-3)對兔(#18)實施給藥。右心室強度增強，隨后左心室強度增強。觀察到極好的心腔不透光性。2.5分鐘后，心腔強度恢復到基線。
以22mg/kg的劑量用實施例4制備的微球體(Lot952-49-1)對兔(#19)實施給藥。右心室強度增強，隨后左心室強度增強。觀察到極好的心腔不透光性。2分鐘后，心腔強度恢復到基線。
這些實施例顯示了極好的心腔不透光性。
用不同的氟化氣體、六氟化硫和六氟環(huán)丁烷進行了類似試驗。
權利要求
1．一種增強超聲成像的方法，包括用氟化氣體代替空氣摻入合成聚合物微粒中，來增強包括空氣的合成聚合物微粒的回聲性，所述用于替代空氣的氟化氣體的量在對患者給藥后對微粒成像應是有效的。
2．根據權利要求1的方法，其中氣體是全氟化碳。
3．根據權利要求2的方法，其中氣體選自CF4、C2F6、C3F8、C4F8、SF6、C2F4和C3F6。
4．根據權利要求3的方法，其中氣體是八氟丙烷。
5．根據權利要求1的方法，其中微粒是微囊。
6．根據權利要求1的方法，其中微粒是其內具有孔隙的微球體。
7．根據權利要求1的方法，其中微粒由生物粘合的合成聚合物形成。
8．根據權利要求1的方法，其中微粒由選自聚羥基酸、聚酐、聚原酸酯、聚酰胺、聚碳酸酯、聚烯烴、聚亞烷基二醇、聚烯化氧、聚對苯二甲酸亞烷基二酯、聚乙烯基醇、聚乙烯基醚、聚乙烯基酯、聚鹵乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚硅氧烷、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、聚苯乙烯、聚氨酯及其共聚物、合成纖維素、聚丙烯酸、聚丁酸、聚戊酸和聚(丙交酯-共-己內酯)、乙烯乙酸乙烯酯及其共聚物和摻混物的合成聚合物形成。
9．用于對患者實施給藥以進行超聲成像的組合物，包括其內摻入有效量氟化氣體的合成生理相容聚合物微粒以及用微粒對患者實施給藥時藥理上可接受的載體，與其內摻入等體積空氣的微粒相比，在對患者實施給藥后，所述摻入有效量氟化氣體的微粒能增強超聲成像。
10．根據權利要求8的組合物，其中氣體是全氟化碳。
11．根據權利要求10的組合物，其中氣體選自CF4、C2F6、C3F8、C4F8、SF6、C2F4和C3F6。
12．根據權利要求11的組合物，其中全氟化碳是八氟丙烷。
13．根據權利要求8的組合物，其中微粒是微囊。
14．根據權利要求8的組合物，其中微粒是內具孔隙的微球體。
15．根據權利要求8的組合物，其中微粒由生物粘合的合成聚合物形成。
16．根據權利要求8的組合物，其中微粒由選自除聚乙二醇和聚(丙交酯-共-乙交酯)之外的聚羥基酸、聚酐、聚原酸酯、聚酰胺、聚碳酸酯、聚烯烴、聚亞烷基二醇、聚烯化氧、聚對苯二甲酸亞烷基二酯、聚乙烯基醇、聚乙烯基醚、聚乙烯基酯、聚鹵乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚硅氧烷、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、聚苯乙烯、聚氨酯及其共聚物、合成纖維素、聚丙烯酸、聚丁酸、聚戊酸和聚(丙交酯-共-己內酯)、乙烯乙酸乙烯酯及其共聚物和摻混物的合成聚合物形成。
17．一種由具有增強的回聲性的生理相容聚合物形成的微粒的制備方法，其中微粒的制備是通過向生理相容聚合物的溶液中混入有效量揮發(fā)性鹽，然后除去聚合物溶劑和揮發(fā)性鹽以形成多孔微粒。
18．根據權利要求17的方法，其中微粒是微囊。
19．根據權利要求17的方法，其中微粒是內具孔隙的微球體。
20．根據權利要求17的方法，其中微粒由生物粘連的合成聚合物形成。
21．根據權利要求17的方法，其中微粒由選自聚羥基酸、聚酐、聚原酸酯、聚酰胺、聚碳酸酯、聚烯烴、聚亞烷基二醇、聚烯化氧、聚對苯二甲酸亞烷基二酯、聚乙烯基醇、聚乙烯基醚、聚乙烯基酯、聚鹵乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚硅氧烷、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、聚苯乙烯、聚氨酯及其共聚物、合成纖維素、聚丙烯酸、聚丁酸、聚戊酸和聚(丙交酯-共-己內酯)、乙烯乙酸乙烯酯及其共聚物和摻混物的合成聚合物形成。
22．根據權利要求17的方法，其中揮發(fā)性鹽選自碳酸氫銨、乙酸銨、氯化銨、苯甲酸銨及其混合物。
23．根據權利要求17的方法，其中按0.01-75％的重量對體積比將揮發(fā)性鹽混入聚合物溶液中。
24．根據權利要求17的方法，其中將揮發(fā)性鹽溶解在水溶液中，與聚合物溶液一起乳化以便在聚合物中形成造孔劑的液滴，然后噴霧干燥。
25．根據權利要求24的方法，進一步包括下述步驟在聚合物沉淀后，冷凍和凍干沉淀的聚合物以除去造孔劑。
26．根據權利要求17的方法，進一步包括向多孔微粒中摻入氟化氣體。
全文摘要
本發(fā)明公開了與內摻入空氣的微粒相比,向合成聚合物微粒中摻入氟化氣體,尤其是全氟化碳,例如,八氟丙烷,可以顯著增強回聲性。例如,對于經靜脈或經口給藥而言,制備了具有利于目標組織成像的直徑的微囊包封全氟化碳。在一個實施方案中,為了粘膜表明成像的增強,制備了生物粘連微粒。
文檔編號A61K49/22GK1222860SQ97192870
公開日1999年7月14日 申請日期1997年2月27日 優(yōu)先權日1996年3月5日
發(fā)明者霍華德·伯恩斯坦, 朱莉·安·斯特勞布, 伊迪絲·馬蒂奧維茨, 亨利·T·布魯什, 理查德·E·溫 申請人:阿庫斯菲爾公司