專利名稱：干擾素配制品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及諸如藥用干擾素組合物的干擾素組合物及其制備方法。具體地說它涉及含有干擾素多肽和磺基烷基醚環(huán)糊精衍生物(sulfoalkyl ethercyclodextrin derivative)的穩(wěn)定組合物。
背景技術(shù)：
干擾素是重要的細(xì)胞因子，其特征在于具有抗病毒，抗增生，和免疫調(diào)節(jié)活性。這些活性形成了在包括肝炎，各種癌癥和多發(fā)性硬化的許多疾病中觀察到的臨床療效的基礎(chǔ)。I型干擾素包括干擾素α，β，τ和ω，而干擾素γ是不同類型的II型中唯一已知的成員。干擾素的綜述參見Aggarwall和Gutterman，在Human Cytokines，第I卷，Blackwell Science，Inc.1996中。
干擾素β及其變體和偶聯(lián)物在WO01/15736和PCT/DK02/00128中進(jìn)行了描述，本文引用其內(nèi)容以供參考。
干擾素γ是由T-淋巴細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子且作為兩個(gè)非共價(jià)結(jié)合的多肽亞基的同型二聚體存在。各單體的成熟形式包含143個(gè)氨基酸殘基(以SEQ ID NO2表示)且包含信號序列的其前體形式含有166個(gè)氨基酸殘基(以SEQ ID NO3表示)。
各亞基在位置25和97具有兩個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)(Aggarwal等，Human Cytokines，Blackwell Scientific Publications，1992)。根據(jù)糖基化程度，二聚體形式的干擾素γ的分子量是34-50kDa(Farrar等，Ann.Rev.Immunol，1993，11571-611)。
野生型人干擾素的一級序列由Gray等(Nature 298859-863，1982)，Taya等(EMBO J.1953-958，1982)，Devos等(Nucleic Acids Res.102487-2501，1982)和Rinderknecht等(J.Biol.Chem.2596790-6797，1984)，和在EP 77670，EP 89676和EP 110044中進(jìn)行了報(bào)導(dǎo)。
干擾素γ變體及其偶聯(lián)物在WO01/36001中描述，本文引用其內(nèi)容以供參考。
通過X-射線晶體學(xué)測定的野生型人干擾素γ的實(shí)驗(yàn)三維結(jié)構(gòu)已由Ealick等，Science 252698-702(1991)報(bào)導(dǎo)，他們報(bào)導(dǎo)了干擾素γ同型二聚體的C-α痕跡。Walter等，Nature 376230-235(1995)公開了與兩分子的干擾素γ受體可溶形式復(fù)合的干擾素γ同型二聚體的結(jié)構(gòu)。然而，該結(jié)構(gòu)的坐標(biāo)不能公開獲得。Thiel等，Structure 8927-936(2000)表明與兩分子的干擾素γ受體可溶形式復(fù)合的干擾素γ同型二聚體的結(jié)構(gòu)具有在結(jié)構(gòu)上不與干擾素γ同型二聚體發(fā)生相互作用的第三個(gè)受體分子。
作為藥用化合物，使用重組人干擾素γ取得了某些成功，尤其是對某些病毒感染和腫瘤。重組人干擾素γ通常適用于通過腸胃外，優(yōu)選通過皮下，進(jìn)行注射。
與干擾素配制成藥用產(chǎn)品相聯(lián)系認(rèn)識到的一個(gè)問題是干擾素多肽的聚集。已嘗試通過使用各種穩(wěn)定劑來解決這一問題，例如，在WO98/28007，WO99/15193和WO01/24814中所述。商業(yè)上可得到的干擾素β產(chǎn)品已經(jīng)通過使用人血清白蛋白來穩(wěn)定。
發(fā)明簡述根據(jù)本發(fā)明，提供了新的含有干擾素的藥用組合物，該組合物包含磺基烷基醚環(huán)糊精衍生物作為穩(wěn)定劑。
因此，本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及含有干擾素多肽和磺基烷基醚環(huán)糊精衍生物的穩(wěn)定的藥用組合物。
術(shù)語“干擾素多肽”試圖表示表現(xiàn)出干擾素活性，例如由Aggarwel和Gutterman，出處同上限定的活性的多肽。
干擾素多肽一般選自由干擾素α，干擾素β，干擾素ω，干擾素τ，干擾素ε和干擾素γ組成的組中。
本發(fā)明的另一方面涉及含有干擾素多肽和磺基烷基醚環(huán)糊精衍生物的第一產(chǎn)品容器。
本發(fā)明的另一方面涉及增加配制成藥用組合物的干擾素多肽的穩(wěn)定性的方法，所述的方法包含在所述的組合物中摻入磺基烷基醚環(huán)糊精衍生物和任選的一種緩沖劑。
本發(fā)明的另一方面涉及對哺乳動物進(jìn)行干擾素治療的方法，該方法包括施用治療上有效量的含有干擾素多肽和磺基烷基醚環(huán)糊精衍生物的組合物。
本發(fā)明的另一方面涉及含有干擾素多肽和磺基烷基醚環(huán)糊精衍生物的藥用組合物。
本發(fā)明的另一方面涉及含有干擾素多肽和磺基烷基醚環(huán)糊精衍生物的組合物在制備用于治療疾病或紊亂的藥物中的用途。
當(dāng)干擾素多肽是干擾素α，或干擾素β，或其變體或偶聯(lián)物時(shí)，本發(fā)明提供了用于治療大多數(shù)類型的病毒感染，癌癥或腫瘤或腫瘤血管形成，Chrohn′s疾病，潰瘍性結(jié)腸炎，Guillain-Barré綜合征，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，原發(fā)性肺纖維變性，異常細(xì)胞生長，或者用于任何合適的動物，優(yōu)選哺乳動物，且特別是人類的免疫調(diào)節(jié)的組合物和方法。例如，本發(fā)明的組合物可用于治療骨肉瘤，基層細(xì)胞癌，卵巢癌，頸發(fā)育異常，頸癌，喉乳頭瘤病，真菌類霉菌病，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，急性骨髓白血病，多發(fā)性骨髓瘤，何杰金氏病，黑素瘤，乳腺癌，非小細(xì)胞肺癌，惡性黑素瘤(輔藥，晚期，以及預(yù)防劑)，類癌瘤，B-細(xì)胞淋巴瘤，T-細(xì)胞淋巴瘤，濾泡性淋巴瘤，卡波西肉瘤，慢性骨髓性白血病，腎細(xì)胞癌，復(fù)發(fā)性表面膀胱癌，結(jié)腸直腸癌，多毛細(xì)胞白血病，和病毒性感染，例如乳頭瘤病毒，病毒性肝炎，生殖器皰疹，帶狀皰疹，皰疹性角膜炎，單純皰疹，病毒性腦炎，巨細(xì)胞病毒性肺炎，鼻病毒慢性頑固性肝炎，慢性病期HCV(I型)，慢性病期HCV(II型)和慢性乙肝。具體地說，本發(fā)明的多肽或組合物可用于多發(fā)性硬化(MS)的治療，例如公認(rèn)的4種類型的MS(良性，復(fù)發(fā)減輕型MS(RRMS)，原發(fā)型進(jìn)行性MS(PPMS)和繼發(fā)型進(jìn)行性MS(SPMS))中的任一種和用于單癥狀MS，癌癥或腫瘤，肝炎，例如乙肝和丙肝，或者皰疹感染的治療(后一種治療任選與IL-10治療結(jié)合)。
當(dāng)干擾素多肽是干擾素γ或其變體或偶聯(lián)物時(shí)，本發(fā)明的組合物可用于治療WO01/36001中描述的任一醫(yī)學(xué)適應(yīng)征，特別是間質(zhì)肺疾病，最具體地說是原發(fā)性肺纖維變性。已有建議將干擾素γ用于治療間質(zhì)肺疾病(IPF)，為了該目的，干擾素γ可與強(qiáng)的松龍結(jié)合使用。除了IPF外，肉芽腫疾病，某些分枝桿菌感染，腎癌，骨硬化病，硬皮病，乙肝，丙肝，膿毒性休克，和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎可用干擾素γ治療。
在另一方面，本發(fā)明涉及含有根據(jù)本發(fā)明的組合物的試劑盒。
發(fā)明詳述術(shù)語“穩(wěn)定”試圖表示該組合物與不含磺基烷基醚環(huán)糊精衍生物的組合物相比具有增加的貯存穩(wěn)定性。例如，在以液體配制品本身貯存或者以冷凍狀態(tài)貯存且使用前融化的液體配制品中，在以后使用前重新組成液體形式的干燥形式，例如凍干，噴霧干燥或空氣干燥形式中，在例如，打算用于肺或鼻給藥的固體形式中，和/或在例如，制備用于特殊給藥系統(tǒng)的任何其它形式(例如微球體等等)中觀察到增加的貯存穩(wěn)定性。該增加的貯存穩(wěn)定性一般根據(jù)在相同貯存條件下與對照組合物相比增加的生物活性來測量。該增加的貯存穩(wěn)定性試圖包含物理和/或化學(xué)穩(wěn)定性。
術(shù)語“生物活性”試圖表示通過任何合適的試驗(yàn)測定的體外和/或體內(nèi)生物活性。例如，生物活性可根據(jù)與目的干擾素多肽相關(guān)的本領(lǐng)域已知的方法以抗病毒活性，抗增殖活性，免疫調(diào)節(jié)活性，受體結(jié)合/活化活性等進(jìn)行測量。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)磺基烷基醚環(huán)糊精衍生物對在貯存期間形成聚集的干擾素多肽具有極大的穩(wěn)定活性。因此，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了用于穩(wěn)定該干擾素多肽的具體用途。另外，根據(jù)本發(fā)明可穩(wěn)定在貯存期間由于其它原因，例如在貯存期間由于化學(xué)或其它物理降解而喪失活性的干擾素多肽。
術(shù)語“聚集體形成”試圖表示導(dǎo)致形成低聚物的干擾素多肽之間的物理相互作用。聚集體形成是不受歡迎的，因?yàn)樵诖蠖鄶?shù)情況下它導(dǎo)致減小或者甚至喪失生物活性和/或增加免疫原性。當(dāng)本發(fā)明的組合物是液體組合物時(shí)，聚集體可保持可溶或者以大型可見聚集體的形式從溶液中沉淀出來。當(dāng)該組合物是干燥形式時(shí)，在其制備期間可形成聚集體導(dǎo)致得到次等配制品。該聚集體形成可通過視覺檢查來測量，或者以任何合適的分光光度裝置測量。
干擾素多肽本發(fā)明一般適用于所有類型的干擾素，包括從天然來源(例如，人白細(xì)胞或成纖維細(xì)胞)分離的干擾素，重組產(chǎn)生的天然存在的或變體干擾素，以及化學(xué)合成的干擾素。例如，干擾素多肽可以是，但不限于是I型干擾素或II型干擾素，例如選自由干擾素α，干擾素β，干擾素ω，干擾素τ，干擾素ε和干擾素γ組成的組中。
干擾素多肽可具有天然發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列(野生型干擾素)或者可以是該野生型干擾素的變體。
更具體地說，干擾素多肽可以是含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾，即，缺失，插入或取代，且表現(xiàn)出干擾素活性的野生型干擾素的變體。該修飾可以位點(diǎn)特異性方式(例如，通過使用定點(diǎn)誘變)或以隨機(jī)或半隨機(jī)方式，例如，通過使用隨機(jī)或局部隨機(jī)誘變，例如在WO01/04287中限定的誘變，或者通過使用定向進(jìn)化技術(shù)，例如，按Stemmer，Bio/Technology 13549-553(1995)，US 5,605,793，US 5,830,721，US 5,811,238等所述的技術(shù)進(jìn)行。一般來說，該變體包含最多15個(gè)氨基酸的修飾，例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15個(gè)修飾。最優(yōu)選的是，該干擾素多肽是人干擾素(具有天然存在的人干擾素的氨基酸序列)或其變體。
術(shù)語“偶聯(lián)物”(或者可互換的“偶聯(lián)多肽”)試圖表示通過一個(gè)或多個(gè)干擾素多肽與一個(gè)或多個(gè)非多肽半分子的共價(jià)連接形成的雜合(以復(fù)合或嵌合的含義)分子。術(shù)語共價(jià)連接是指干擾素多肽和非多肽半分子互相之間直接共價(jià)連接，或者通過諸如橋接，間隔，或一個(gè)或多個(gè)連接半分子的一個(gè)或多個(gè)間插半分子在互相之間的間接共價(jià)連接。優(yōu)選的是，偶聯(lián)的干擾素多肽在有關(guān)濃度和條件下是可溶的，即，在諸如血液的生理學(xué)液體中是可溶的。偶聯(lián)的干擾素多肽的例子包括糖基化和/或PEG化的干擾素多肽。術(shù)語“非偶聯(lián)的多肽”可用于偶聯(lián)的干擾素多肽的多肽部分。
與特定修飾相聯(lián)系使用的術(shù)語“區(qū)別”或“不同”打算允許存在除了該特定氨基酸區(qū)別外的其它區(qū)別。因此，除了導(dǎo)入本文公開的特定修飾外，如果需要，該干擾素多肽可包含其它修飾。例如，它們可包括在N-末端添加一個(gè)或多個(gè)額外的殘基，例如在N-末端添加一個(gè)Met殘基和/截短一個(gè)或多個(gè)C-末端殘基以及“保守氨基酸取代”，即在具有相似特征，例如，小氨基酸，酸性氨基酸，極性氨基酸，堿性氨基酸，疏水氨基酸和芳香氨基酸的氨基酸組內(nèi)進(jìn)行的取代。具體地說，保守取代的例子可選自下表所列的組中。

術(shù)語“隨機(jī)誘變”是指對于受試核酸內(nèi)的突變位點(diǎn)是隨機(jī)的且對于導(dǎo)入的突變是隨機(jī)的誘變方法，例如，化學(xué)誘變，紫外或γ照射，通過修復(fù)缺陷細(xì)胞的傳代等。術(shù)語“局部誘變”用于表示誘變方法優(yōu)先在受試核酸的預(yù)定部分或子序列中發(fā)生。在本發(fā)明上下文中，“定點(diǎn)誘變”是指在一個(gè)或多個(gè)預(yù)定的核苷酸位置的改變，通常以改變編碼的氨基酸序列內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基為目的。定點(diǎn)誘變通常根據(jù)待修飾的多肽的一級或三級(例如模型)結(jié)構(gòu)的分析進(jìn)行設(shè)計(jì)。
術(shù)語“連接基團(tuán)”試圖表示能與諸如多聚體分子或糖類半分子的有關(guān)非多肽半分子偶聯(lián)的氨基酸殘基基團(tuán)。有用的連接基團(tuán)及其匹配的非多肽半分子從下表中是顯而易見的。

對于體內(nèi)N-糖基化，術(shù)語“連接基團(tuán)”以非常規(guī)方式用于表示組成N-糖基化位點(diǎn)的氨基酸殘基(具有序列N-X’-S/T/C-X”，其中X’是除脯氨酸外的任一氨基酸殘基，X”是與X’相同或不同的任一氨基酸殘基且優(yōu)選不同于脯氨酸，N是天冬酰胺，S/T/C是絲氨酸，蘇氨酸或半胱氨酸之一，優(yōu)選是絲氨酸或蘇氨酸，且最優(yōu)選是蘇氨酸)。盡管N-糖基化位點(diǎn)的天冬酰胺殘基是糖基化期間連接糖類半分子的殘基，但是除非存在N-糖基化位點(diǎn)的其它氨基酸殘基，否則不能完成該連接。因此，當(dāng)該非多肽半分子是糖類半分子且該連接通過N-糖基化完成時(shí)，術(shù)語“含有非多肽半分子的連接基團(tuán)的氨基酸殘基”與親本多肽的氨基酸序列的改變相聯(lián)系使用時(shí)應(yīng)理解為構(gòu)成N-糖基化位點(diǎn)的一個(gè)，兩個(gè)或所有氨基酸殘基以這樣的方式改變，即將功能性N-糖基化位點(diǎn)導(dǎo)入氨基酸序列中或者從所述的序列中去掉。
顯然，當(dāng)干擾素多肽是具有一個(gè)或多個(gè)連接的非多肽半分子的偶聯(lián)物形式時(shí)，去掉和/或?qū)牒蟹嵌嚯陌敕肿拥倪B接基團(tuán)的氨基酸殘基是首選的。通過去掉和/或?qū)牒蟹嵌嚯陌敕肿拥倪B接基團(tuán)的氨基酸殘基，可優(yōu)化與干擾素多肽偶聯(lián)的非多肽半分子的數(shù)目和分布(例如，確保非多肽半分子在干擾素多肽表面的最佳分布，從而，例如，有效屏蔽多肽的表位和其它表面部分而不明顯減小其功能)，正如在WO01/15736，和在PCT/DK02/00128中的詳細(xì)解釋。例如，通過導(dǎo)入連接基團(tuán)，可提高或者改變相關(guān)非多肽半分子結(jié)合的特異性氨基酸殘基的含量，從而實(shí)現(xiàn)更有效，更特異和/或更廣泛的偶聯(lián)。通過去掉一個(gè)或多個(gè)連接基團(tuán)，可避免在部分多肽中與非多肽半分子的偶聯(lián)，其中該偶聯(lián)對于例如，位于或者靠近該多肽功能性位點(diǎn)的氨基酸殘基是不利的(因?yàn)樵谠撐稽c(diǎn)的偶聯(lián)由于損害了受體識別導(dǎo)致所得的偶聯(lián)物的干擾素活性失活或者降低)。另外，去掉緊靠另一連接基團(tuán)的一個(gè)連接基團(tuán)以避免與該基團(tuán)的不均一偶聯(lián)是有利的。
應(yīng)明白去掉的或?qū)氲暮蟹嵌嚯陌敕肿舆B接基團(tuán)的氨基酸殘基可根據(jù)非多肽半分子的特性，且在大多數(shù)情況下，根據(jù)使用的偶聯(lián)方法來選擇。例如，當(dāng)該非多肽半分子是諸如聚乙二醇或聚環(huán)氧烷衍生分子的多聚體分子時(shí)，能作為連接基團(tuán)起作用的氨基酸殘基可選自由賴氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸，谷氨酸和精氨酸組成的組中。當(dāng)該非多肽半分子是糖類半分子時(shí)，連接基團(tuán)是體內(nèi)糖基化位點(diǎn)，優(yōu)選是N-糖基化位點(diǎn)。
導(dǎo)入或去掉的氨基酸殘基一般位于干擾素多肽的表面暴露位置，優(yōu)選在被這樣的氨基酸殘基占據(jù)的位置，即該氨基酸殘基具有超過25％的其側(cè)鏈與溶劑接觸，優(yōu)選超過50％的其側(cè)鏈與溶劑接觸。而且，它與去掉占據(jù)干擾素多肽中位于受體結(jié)合位點(diǎn)的位置的連接基團(tuán)相關(guān)。另外，它與將連接基團(tuán)導(dǎo)入位于干擾素多肽中的位置或其表位相關(guān)。該位置可根據(jù)對干擾素多肽的三維結(jié)構(gòu)的分析或者通過任一其它合適的方法，例如在使用干擾素β作為例子的WO01/15736中所述的方法進(jìn)行鑒定。
導(dǎo)致在暴露于干擾素β多肽表面且被具有超過25％的側(cè)鏈暴露于表面的氨基酸殘基占據(jù)的位置導(dǎo)入另一N-糖基化位點(diǎn)的取代包括S2N+N4S/T，L6S/T，L5N+G7S/T，F(xiàn)8N+Q10S/T，L9N+R11S/T，R11N，R11N+S13T，S12N+N14S/T，F(xiàn)15N+C17S/T，Q16N+Q18S/T，Q18N+L20S/T，K19N+L21S/T，W22N+L24S/T，Q23N+H25S/T，G26N+L28S/T，R27N+E29S/T，L28S+Y30S/T，Y30N+L32S/T，L32N+D34S/T，K33N+R35S/T，R35N+N37S/T，M36N+F38S/T，D39S/T，D39N+P41S/T，E42N+I44S/T，Q43N+K45S/T，K45N+L47S/T，Q46N+Q48S/T，L47N+Q49T/S，Q48N+F50S/T，Q49N+Q51S/T，Q51N+E53S/T，K52N+D54S/T，L57N+I59S/T，Q64N+I66S/T，A68N+F70S/T，R71N+D73S/T，Q72N，Q72N+S74T，D73N，D73N+S75T，S75N+T77S，S75N，S76N+G78S/T，E81N+I83S/T，T82N+V84S/T，E85N+L87S/T，L88S/T，A89N+V91S/T，Y92S/T，Y92N+Q94S/T，H93N+I95S/T，L98S/T，H97N+K99S/T，K99N+V101S/T，T100N+L102S/T，E103N+K105S/T，E104N+L106S/T，K105N+E107S/T，E107N+E109S/T，K108N+D110S/T，E109N+F111S/T，D110N+T112S，D110N，F(xiàn)111N+R113S/T，R113N+K115S/T，G114N+L116S/T，K115N+M117S/T，L116N，L116N+S118T，S119N+H212S/T，L120N+L122S/T，H121N+K123S/T，K123N+Y125S/T，R124N+Y126S/T，G127N+I129S/T，R128N+L130S/T，L130N+Y132S/T，H131N+L133S/T，K134N+K136S/T，A135N+E137S/T，K136N+Y138S/T，E137N，Y138N+H140S/T，H140N+A142S/T，V148N+I150S/T，R152N+F154S/T，Y155N+I157S/T，L160S/T，R159N+T161S，R159N，G162N+L164S/T，和Y163N+R165S/T，該取代相對于SEQ ID NO 1所示的野生型人干擾素β的氨基酸序列表示。
導(dǎo)致在具有超過50％的側(cè)鏈暴露于表面的暴露于干擾素β多肽表面的位置導(dǎo)入另一N-糖基化位點(diǎn)的取代包括L6S/T，L5N+G7S/T，F(xiàn)8N+Q10S/T，L9N+R11S/T，S12N+N14S/T，F(xiàn)15N+C17S/T，Q16N+Q18S/T，K19N+L21S/T，W22N+L24S/T，Q23N+H25S/T，G26N+L28S/T，R27N+E29S/T，Y30N+L32S/T，K33N+R35S/T，R35N+N37S/T，M36N+F38S/T，D39S/T，D39N+P41S/T，E42N+I44S/T，Q46N+Q48S/T，Q48N+F50S/T，Q49N+Q51S/T，Q51N+E53S/T，K52N+D54S/T，L57N+I59S/T，R71N+D73S/T，D73N，D73N+S75T，S75N+T77S，S75N，S76N+G78S/T，E81N+I83S/T，T82N+V84S/T，E85N+L87S/T，A89N+V91S/T，Y92S/T，Y92N+Q94S/T，H93N+I95S/T，T100N+L102S/T，E103N+K105S/T，E104N+L106S/T，E107N+E109S/T，K108N+D110S/T，D110N+T112S，D110N，F(xiàn)111N+R113S/T，R113N+K115S/T，L116N，L116N+S118T，K123N+Y125S/T，R124N+Y126S/T，G127N+I129S/T，H131N+L133S/T，K134N+K136S/T，A135N+E137S/T，E137N，V148N+I150S/T，和Y155N+I157S/T，該取代相對于SEQ ID NO 1所示的野生型人干擾素β的氨基酸序列表示。
在上述取代中，優(yōu)選的是在141 N-末端氨基酸殘基中，特別是在116 N-末端氨基酸殘基中具有導(dǎo)入的N殘基的取代。
通過唯一一個(gè)氨基酸的取代導(dǎo)致導(dǎo)入一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)的取代包括L6S/T，R11N，D39S/T，Q72N，D73N，S75N，L88S/T，Y92S/T，L98S/T，D110N，L116N，E137N，R159N和L160S/T，該取代相對于SEQ ID NO 1所示的野生型人干擾素β的氨基酸序列表示。其中，優(yōu)選的取代選自由L6S/T，R11N，D39S/T，Q72N，D73N，S75N，L88S/T，Y92S/T，L98S/T，D110N和L116N組成的組中，更優(yōu)選的是選自由L6S/T，D39S/T，D73N，S75N，L88S/T，D110N，L116N和E137N組成的組中；且最優(yōu)選的是選自由L6S/T，D39S/T，D73N，S75N，L88S/T，D110N和L116N組成的組中。
優(yōu)選的是，導(dǎo)入的含有非多肽半分子的連接基團(tuán)的氨基酸殘基產(chǎn)生新的N-糖基化位點(diǎn)或新的PEG化位點(diǎn)。
另外，當(dāng)干擾素多肽包含糖基化位點(diǎn)時(shí)，可優(yōu)化該位點(diǎn)的利用。通過修飾緊靠所述糖基化位點(diǎn)的氨基酸殘基可實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，該修飾屬于導(dǎo)致增加糖基化的類型。一般來說，體內(nèi)糖基化位點(diǎn)是N-糖基化位點(diǎn)，但它也可以是O-糖基化位點(diǎn)。
在本發(fā)明上下文中，術(shù)語“增加的糖基化”試圖表示連接的糖類分子水平提高，一般由于一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)的利用提高(或更好)而獲得。通過用于分析連接的糖類結(jié)構(gòu)的本領(lǐng)域已知的任何合適方法可測定增加的糖基化。
在本發(fā)明上下文中術(shù)語“體內(nèi)N-糖基化程度增加”或“N-糖基化程度增加”試圖表示連接的糖類分子水平提高，一般由于一個(gè)或多個(gè)N-糖基化位點(diǎn)的利用提高(或更好)而獲得。對于干擾素γ，熟知的是(Hooker等，1998，J.Interferon and Cytokine Res.18，287-295和Sarenva等，1995，Biochem J.，308，9-14)當(dāng)野生型人干擾素γ在CHO細(xì)胞中表達(dá)時(shí)只有大約50％的干擾素γ多肽利用了兩個(gè)糖基化位點(diǎn)，大約40％利用了一個(gè)糖基化位點(diǎn)(1N)，且大約10％沒有被糖基化(ON)。通過本領(lǐng)域已知的任何合適的方法，例如，通過SDS-PAGE可測定體內(nèi)N-糖基化程度的增加。
術(shù)語“表現(xiàn)出干擾素γ活性”試圖表示該干擾素γ多肽具有天然人干擾素γ或重組人干擾素γ的一種或多種功能，包括與干擾素γ受體結(jié)合并引起轉(zhuǎn)導(dǎo)體外或體內(nèi)測定的人干擾素γ結(jié)合其受體時(shí)轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號的能力(即體外或體內(nèi)生物活性)。Aguet等(Cell 55273-280，1988)和Calderon等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 854837-4841，1988)描述了該干擾素γ受體。檢測干擾素γ活性的合適的試驗(yàn)是本文公開的題為“一級試驗(yàn)”的試驗(yàn)。
“干擾素γ多肽”是表現(xiàn)出干擾素γ活性的多肽，且合適時(shí)，本文用于以單體或二聚體形式的干擾素γ多肽。例如，當(dāng)表示具體取代時(shí)，它們一般相對于干擾素γ多肽單體表示。應(yīng)明白術(shù)語“干擾素γ多肽”也包含野生型干擾素γ多肽的C-末端截短的和變體形式。該變體的具體例子包括具有諸如S99T，E38N+S40T的修飾的變體及其C-末端截短形式。合適的修飾的更多例子在下文給出。
一般來說，干擾素γ多肽的變體形式與人干擾素γ相比(或者如果需要其截短形式，與相應(yīng)截短的人干擾素γ相比)有1-15個(gè)氨基酸殘基的區(qū)別(例如有1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，1 3，14或15個(gè)氨基酸殘基的區(qū)別)，例如有1-10個(gè)氨基酸殘基，1-5個(gè)氨基酸殘基或1-3個(gè)氨基酸殘基的區(qū)別。
如上所述，已知可從C-末端缺失1-15個(gè)氨基酸殘基而不消除該多肽的干擾素γ的活性。因此，術(shù)語“干擾素γ多肽”也包含這樣的干擾素γ多肽(具有人野生型序列或其變體)，其中1-15的干擾素γ多肽是C-末端截短1-15個(gè)氨基酸殘基。一個(gè)具體的例子包括C-末端截短3個(gè)氨基酸殘基的干擾素γ多肽。
術(shù)語“人干擾素γ”試圖表示具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的野生型人干擾素γ的成熟形式。
術(shù)語“重組人干擾素γ”試圖包含以重組方式產(chǎn)生的具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的野生型人干擾素γ的成熟形式。
本文使用的術(shù)語“Actimmune”是指通過發(fā)酵遺傳改造的大腸桿菌細(xì)菌獲得的干擾素γ的140個(gè)氨基酸的形式(以SEQ ID NO4公開)。Actimmune的其它信息可在www.actimmune.com.上獲得。
氨基酸殘基“位于靠近”糖基化位點(diǎn)通常是位于相對于糖類連接的糖基化位點(diǎn)的氨基酸殘基的-4，-3，-2，-1，+1，+2，+3或+4位。該位置可選自-1，+1，或+3位，特別是在+1或+3位。因此，位于靠近N-糖基化位點(diǎn)(具有序列N-X’-S/T/C-X”)的氨基酸殘基相對于N殘基位于-4，-3，-2，-1位，在X’或X”位(在這種情況下導(dǎo)入的氨基酸殘基優(yōu)選不同于脯氨酸)，或在相對于X”殘基的+1位。氨基酸修飾一般是取代，取代用與未修飾的多肽相比導(dǎo)致干擾素多肽糖基化增加的任一其它氨基酸殘基進(jìn)行。這一其它氨基酸殘基可通過試驗(yàn)和差錯(cuò)型實(shí)驗(yàn)來測定(即，通過將有關(guān)位置的氨基酸殘基取代成任一其它氨基酸殘基，并測定所得變體的所得糖基化)。
當(dāng)修飾相對于N-殘基的+2位時(shí)，應(yīng)明白只有有限數(shù)目的修飾是可能的，因?yàn)闉榱吮Ａ?導(dǎo)入體內(nèi)N-糖基化位點(diǎn)，所述位置的氨基酸殘基可以是Ser，Thr或Cys之一。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，相對于體內(nèi)N-糖基化位點(diǎn)的+2位的氨基酸殘基的修飾是所述氨基酸殘基被Thr殘基取代的取代。另一方面，如果所述的氨基酸殘基已經(jīng)是Thr殘基，一般在該位置不優(yōu)選或者不必進(jìn)行任何取代。當(dāng)修飾X’時(shí)，X’應(yīng)不是Pro且優(yōu)選不是Trp，Asp，Glu和Leu。如果修飾X’，需導(dǎo)入的氨基酸殘基優(yōu)選選自由Phe，Asn，Gln，Tyr，Val，Ala，Met，Ile，Lys，Gly，Arg，Thr，His，Cys和Ser組成的組中，更優(yōu)選Ala，Met，Ile，Lys，Gly，Arg，Thr，His，Cys和Ser，特別是Ala或Ser。當(dāng)修飾相對于N-殘基的+3位置時(shí)，需導(dǎo)入的氨基酸殘基優(yōu)選選自由His，Asp，Ala，Met，Asn，Thr，Arg，Ser和Cys組成的組中，更優(yōu)選Thr，Arg，Ser和Cys。如果X’殘基是Ser殘基，該修飾特別適當(dāng)。
另外，可通過例如，用諸如中性氨基酸殘基，例如Gly，Val，Ala，Leu，Ile，Tyr，Phe，His，Trp，Ser，Thr或Met的另一氨基酸殘基，優(yōu)選用Ser或Thr取代可去掉干擾素多肽的游離半胱氨酸(即，不形成半胱氨酸橋鍵的一部分的半胱氨酸殘基)，例如，按US 4,959,314或EP 192,811中所述。
干擾素多肽可用非多肽半分子，例如，諸如聚乙二醇的多聚體分子或糖類半分子(當(dāng)干擾素多肽被糖基化時(shí))進(jìn)行衍生化。
術(shù)語“非多肽半分子”試圖表示能與本發(fā)明的多肽的連接基團(tuán)偶聯(lián)的分子。該分子的優(yōu)選例子包括多聚體分子，糖類半分子，親脂性化合物，或有機(jī)衍生劑。在本發(fā)明的偶聯(lián)物的上下文中使用時(shí)，應(yīng)明白非多肽半分子通過該多肽的連接基團(tuán)與偶聯(lián)物的多肽部分連接。
術(shù)語“多聚體分子”定義為由兩個(gè)或多個(gè)單體共價(jià)連接形成的分子，其中單體中沒有一個(gè)是氨基酸殘基，除非該多聚體是人白蛋白或另一高豐度血漿蛋白質(zhì)。術(shù)語“多聚體”與術(shù)語“多聚體分子”可互換使用。該術(shù)語試圖包含經(jīng)體外糖基化，即，正常情況下涉及任選使用交聯(lián)劑將糖類分子共價(jià)連接到多肽的連接基團(tuán)上的體外進(jìn)行的合成糖基化，連接的糖類分子。通過諸如N-或O-糖基化的體內(nèi)糖基化連接的糖類分子(如下面的進(jìn)一步描述)本文稱為“糖類半分子”。除了特意表明偶聯(lián)物中諸如多聚體分子或糖類半分子的非多肽半分子的數(shù)目的情況外，每次提及偶聯(lián)物中所含的或者本發(fā)明中使用的“一個(gè)非多肽半分子”應(yīng)當(dāng)是指偶聯(lián)物中的一個(gè)或多個(gè)諸如多聚體分子或糖類半分子的非多肽半分子。
當(dāng)干擾素多肽包含導(dǎo)入的含有非多肽半分子的連接基團(tuán)的氨基酸殘基時(shí)，該非多肽半分子優(yōu)選與該氨基酸殘基連接。
在第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及含有干擾素多肽和磺基烷基醚環(huán)糊精衍生物的穩(wěn)定化組合物。
在第二個(gè)方面，本發(fā)明涉及含有干擾素多肽和磺基烷基醚環(huán)糊精衍生物的穩(wěn)定化藥用組合物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該磺基烷基醚環(huán)糊精衍生物以從1mg/ml到150mg/ml，例如從5mg/ml到100mg/ml的濃度存在。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該干擾素多肽包含至少一個(gè)導(dǎo)入的和/或至少一個(gè)去掉的含有非多肽半分子連接基團(tuán)的氨基酸殘基。在另一實(shí)施方案中，該干擾素多肽包含至少一個(gè)導(dǎo)入的和至少一個(gè)去掉的含有非多肽半分子連接基團(tuán)的氨基酸殘基。在另一實(shí)施方案中，該干擾素多肽包含至少一個(gè)導(dǎo)入的含有非多肽半分子連接基團(tuán)的氨基酸殘基。在另一實(shí)施方案中，該干擾素多肽包含至少一個(gè)去掉的含有非多肽半分子連接基團(tuán)的氨基酸殘基。
在另一實(shí)施方案中，該非多肽半分子包含諸如聚乙二醇的多聚體分子，或糖類半分子。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，該多聚體分子包含聚乙二醇。在另一具體實(shí)施方案中，該非多肽半分子包含糖類半分子，特別是在哺乳動物細(xì)胞，優(yōu)選CHO細(xì)胞中表達(dá)干擾素多肽獲得的糖類半分子。
在另一實(shí)施方案中，該干擾素多肽包含至少一個(gè)導(dǎo)入的糖基化位點(diǎn)，和至少一個(gè)與導(dǎo)入的糖基化位點(diǎn)連接的糖類半分子。在另一實(shí)施方案中，該干擾素多肽包含至少一個(gè)導(dǎo)入的糖基化位點(diǎn)，和至少一個(gè)與導(dǎo)入的糖基化位點(diǎn)連接的糖類半分子，和一個(gè)諸如聚乙二醇的多聚體分子。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，該干擾素多肽包含3個(gè)糖類半分子，每個(gè)糖類半分子與N-糖基化位點(diǎn)相連。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，干擾素多肽被糖基化和/或PEG化。在另一實(shí)施方案中，干擾素多肽被糖基化和PEG化。在另一實(shí)施方案中，干擾素多肽被糖基化。在另一實(shí)施方案中，干擾素多肽被PEG化。當(dāng)干擾素多肽被糖基化時(shí)，優(yōu)選被N-糖基化。當(dāng)干擾素多肽被糖基化時(shí)，它通常含有1-5個(gè)糖類半分子，例如1-3個(gè)糖類半分子。在另一實(shí)施方案中，干擾素多肽被N-糖基化，且包含1-5個(gè)糖類半分子，例如1-3個(gè)糖類半分子。當(dāng)干擾素多肽被PEG化時(shí)，它通常含有1-5個(gè)聚乙二醇(PEG)分子。在另一實(shí)施方案中，干擾素多肽包含1-5個(gè)PEG分子，例如1，2或3個(gè)PEG分子。在另一實(shí)施方案中，各PEG分子具有大約5kDa(千道爾頓)至100kDa的分子量。在另一實(shí)施方案中，各PEG分子具有大約10kDa至40kDa的分子量。在另一實(shí)施方案中，各PEG分子具有大約12kDa的分子量。在另一實(shí)施方案中，各PEG分子具有大約20kDa的分子量。優(yōu)選的干擾素多肽包含1-3個(gè)分別具有大約12kDa分子量的PEG分子，或具有大約20kDa分子量的1個(gè)PEG分子。合適的PEG分子可從Shearwater Polymers公司和Enzon公司獲得且可選自SS-PEG，NPC-PEG，醛基-PEG，mPEG-SPA，mPEG-SCM，mPEG-BTC，SC-PEG，tresylated mPEG(US 5,880,255)，或氧羰基-氧-N-二羧酰亞胺-PEG(US 5,122,614)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，干擾素多肽是干擾素β多肽，例如，野生型人干擾素β或其變體，任選與非多肽半分子連接。
例如，干擾素β多肽可以是野生型人干擾素β的變體，其中在位置17的半胱氨酸殘基缺失或者被諸如上述中性氨基酸殘基的另一氨基酸殘基取代。例如，該干擾素β多肽包含C17S突變，取代用相對于SEQ ID NO 1所示的野生型人干擾素β的氨基酸序列表示。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該干擾素β多肽是WO01/15736中所述的任一多肽。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，干擾素β多肽是在PCT/DK02/00128中所述的任一多肽。優(yōu)選的變體包括在例如，S2，Q49，Q51，或F111位置具有至少一個(gè)導(dǎo)入的糖基化位點(diǎn)的變體；和在例如，K19，K33，K45或K123位置具有至少一個(gè)去掉的PEG化位點(diǎn)的變體。
在另一實(shí)施方案中，干擾素β多肽是包含與干擾素β多肽共價(jià)連接的至少一個(gè)第一非多肽半分子的偶聯(lián)物，該多肽的氨基酸序列與野生型人干擾素β區(qū)別在于導(dǎo)入了至少一個(gè)并去掉了至少一個(gè)含有所述第一非多肽半分子連接基團(tuán)的氨基酸殘基。
在另一實(shí)施方案中，干擾素β多肽是包含與干擾素β多肽的至少一個(gè)賴氨酸殘基結(jié)合的至少一個(gè)第一非多肽半分子的偶聯(lián)物，該多肽的氨基酸序列與野生型人干擾素β區(qū)別在于導(dǎo)入了至少一個(gè)和/或去掉了至少一個(gè)賴氨酸殘基。
在另一實(shí)施方案中，干擾素β多肽是包含與干擾素β多肽的至少一個(gè)半胱氨酸殘基結(jié)合的至少一個(gè)第一非多肽半分子的偶聯(lián)物，該多肽的氨基酸序列區(qū)別在于在野生型人干擾素β被表面暴露的氨基酸殘基占據(jù)的位置導(dǎo)入了至少一個(gè)半胱氨酸殘基。
在另一實(shí)施方案中，干擾素β多肽是包含具有酸性基團(tuán)作為連接基團(tuán)的至少一個(gè)第一非多肽半分子的偶聯(lián)物，該半分子與干擾素β多肽的至少一個(gè)天冬氨酸或谷氨酸殘基結(jié)合，該多肽的氨基酸序列與野生型人干擾素β區(qū)別在于導(dǎo)入了至少一個(gè)和/或去掉了至少一個(gè)天冬氨酸或谷氨酸殘基。
在另一實(shí)施方案中，第一非多肽半分子包含諸如聚乙二醇的多聚體分子，或糖類半分子。
在另一實(shí)施方案中，干擾素β多肽是包含與干擾素β多肽共價(jià)連接的至少一個(gè)多聚體分子和至少一個(gè)糖類半分子的偶聯(lián)物，該多肽的氨基酸序列與野生型人干擾素β區(qū)別在于a)導(dǎo)入了至少一個(gè)和/或去掉了至少一個(gè)含有該多聚體分子的連接基團(tuán)的氨基酸殘基，和b)導(dǎo)入了至少一個(gè)和/或去掉了至少一個(gè)含有該糖類半分子的連接基團(tuán)的氨基酸殘基，前提是當(dāng)該多聚體分子的連接基團(tuán)是半胱氨酸殘基，且該糖類半分子是N-連接的糖類半分子時(shí)，不以破壞N-糖基化位點(diǎn)的方式插入半胱氨酸殘基。
在另一實(shí)施方案中，干擾素β多肽是包含干擾素β多肽的偶聯(lián)物，該多肽的氨基酸序列與野生型人干擾素β的區(qū)別在于導(dǎo)入了至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)，該偶聯(lián)物還含有與導(dǎo)入的糖基化位點(diǎn)連接的至少一個(gè)un-PEG化的糖類半分子。
在另一實(shí)施方案中，干擾素β多肽是包含干擾素β多肽的偶聯(lián)物，該多肽的氨基酸序列與野生型人干擾素β的區(qū)別在于導(dǎo)入了至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)，該偶聯(lián)物還含有與導(dǎo)入的糖基化位點(diǎn)連接的至少一個(gè)糖類半分子。
因此，在一個(gè)具體方面，本發(fā)明涉及穩(wěn)定化的組合物，包括a)含有干擾素β多肽的偶聯(lián)物，該多肽的氨基酸序列與野生型人干擾素β的區(qū)別在于導(dǎo)入了至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)，該偶聯(lián)物還含有與導(dǎo)入的糖基化位點(diǎn)連接的至少一個(gè)糖類半分子，和b)磺基烷基醚環(huán)糊精衍生物。
在另一實(shí)施方案中，干擾素β多肽是包含干擾素β多肽的偶聯(lián)物，該多肽的氨基酸序列與野生型人干擾素β的區(qū)別在于通過在野生型人干擾素β被表面暴露的氨基酸殘基占據(jù)的位置導(dǎo)入或去掉構(gòu)成糖基化位點(diǎn)一部分的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的方式導(dǎo)入或去掉了一個(gè)糖基化位點(diǎn)。
在另一實(shí)施方案中，干擾素β多肽是包含干擾素β多肽的偶聯(lián)物，該多肽的氨基酸序列與野生型人干擾素β的區(qū)別在于通過在野生型人干擾素β被表面暴露的氨基酸殘基占據(jù)的位置導(dǎo)入構(gòu)成糖基化位點(diǎn)一部分的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的方式導(dǎo)入了一個(gè)糖基化位點(diǎn)。
在還有另一實(shí)施方案中，干擾素β多肽是包含與干擾素β多肽共價(jià)連接的糖類半分子的偶聯(lián)物，該多肽的氨基酸序列與野生型人干擾素β的區(qū)別在于去掉了至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)。
在還有另一個(gè)實(shí)施方案中，干擾素β多肽是含有至少一個(gè)體內(nèi)糖基化位點(diǎn)的親本干擾素β多肽的糖基化變體，其中修飾了位于靠近所述糖基化位點(diǎn)的所述親本多肽的氨基酸殘基以獲得與親本干擾素β多肽的糖基化相比糖基化增加的變體多肽。
在另一實(shí)施方案中，干擾素β多肽包含選自由如下組成的組中的氨基酸取代K19R+K45R+K123R；K19Q+K45R+K123R；K19R+K45Q+K123R；K19R+K45R+K123Q；K19Q+K45Q+K123R；K19R+K45Q+K123Q；K19Q+K45R+K123Q；K19Q+K45Q+K123Q；K45R+K123R；K45Q+K123R；K45Q+K123Q；K45R+K123Q；K19R+K123R；K19Q+K123R；K19R+K123Q；K19Q+K123Q；K19R+K45R；K19Q+K45R；K19R+K45Q；K19Q+K45Q；K52R+K134R；K99R+K136R；K33R+K105R+K136R；K52R+K108R+K134R；K99R+K115R+K136R；K19R+K33R+K45R+K123R；K19R+K45R+K52R+K123R；K19R+K33R+K45R+K52R+K123R；K19R+K45R+K52R+K99R+K123R；K19R+K45R+Q49N+Q51T+F111N+R113T+K123R；K19R+K45R+Q49N+Q51T+F111N+R113T；K19R+K45R+Q49N+Q51T+K123R；S2N+N4T/S；L9N+R11T/S；R11N；S12N+N14T/S；F15N+C17S/T；Q16N+Q18T/S；K19N+L21T/S；Q23N+H25T/S；G26N+L28T/S；R27N+E29T/S；L28N+Y30T/S；D39T/S；K45N+L47T/S；Q46N+Q48T/S；Q48N+F50T/S；Q49N+Q51T/S；Q51N+E53T/S；R71N+D73T/S；Q72N；D73N；S75N；S76N+G78T/S；L88T/S；Y92T/S；N93N+I95T/S；L98T/S；E103N+K105T/S；E104N+L106T/S；E107N+E109T/S；K108N+D110T/S；D110N；F111N+R113T/S；L116N；S2N+N4T；L9N+R11T；49N+Q51T；F111N+R113T；R71N+D73T；49N+Q51T；F111N+R113T；R71N+D73T；Q49N+Q51T+F111N+R113T；Q49N+Q51T+R71N+D73T+F111N+R113T；S2N+N4T+F111N+R113T；S2N+N4T+Q49N+Q51T；S2N+N4T+Q49N+Q51T+F111N+R113T；S2N+N4T+L9N+R11T+Q49N+Q51T；S2N+N4T+L9N+R11T+F111N+R113T；S2N+N4T+L9N+R11T+Q49N+Q51T+F111N+R113T；L9N+R11T+Q49N+Q51T；L9N+R11T+Q49N+Q51T+F111N+R113T；L9N+R11T+F111N+R113T；R27K+R159K；R27K+K45R+R159K；R27K+Q49K+E85K+A89K；R27K+K45R+Q49K+E85K+A89K；R27K+D39K+Q49K+E85K+A89K；R27K+D39K+K45R+Q49K+E85K+A89K；N4K+R27K+D39K+Q49K+E85K+A89K；N4K+R27K+D39K+K45R+Q49K+E85K+A89K；R27K+K123R+R159K；R27K+K45R+K123R+]R159K；R27K+Q49K+E85K+A89K+K123R；R27K+K45R+Q49K+E85K+A89K+K123R；R27K+D39K+Q49K+E85K+A89K+K123R；R27K+D39K+K45R+Q49K+E85K+A89K+K123R；N4K+R27K+D39K+Q49K+E85K+A89K+K123R；N4K+R27K+D39K+K45R+Q49K+E85K+A89K+K123R；K19R+K45R+F111K+K123R；K19R+K45R+Q49K+F111K+K123R；K19R+K45R+Q49K+K123R；K19R+K45R+F111K；K19R+K45R+Q49K+F111K；K19R+Q49K+K123R；K19R+Q49K+F111K+K123R；K45Q+F111K+K123Q；K45R+Q49K+K123R；或K45R+Q49K+F111K+K123R；該取代相對于SEQ ID NO 1所示的野生型人干擾素β的氨基酸序列表示。各具體變體被認(rèn)為是干擾素β變體的一個(gè)實(shí)施方案。
本發(fā)明感興趣的具體干擾素β變體包括選自由如下組成的組中的氨基酸取代Q49N+Q51T；Q49N+Q51T+F111N+R113T；F111N+R113T；C17S+Q49N+Q51T+L980+F111N+R113T；S2N+N4T+C17S+Q51N+E53T；S2N+N4T+C17S+Q51N+E53T+F111N+R113T；C17S+Q49N+Q51T+F111N+R113T；C17S+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T；C17S+Q48F+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T；C17S+Q48Y+Q49N+Q51T+D110Y+F111N+R113T；K19R+K45R+K123R；K19R+K45R+Q49N+Q51T+F111N+R113T+K123R；C17S+K19R+K45R+Q49N+Q51T+F111N+R113T+K123R；C17S+K19R+K45R+Q49N+Q51T+F111N+R113T+K123R；C17S+K19R+Q49N+Q51T+F111N+R113T+K123R；C17S+K19R+K45R+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T+K123R；C17S+K19R+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T+K123R；S2N+N4T+C17S+K19R+K45R+Q51N+E53T+K123R；C17S+K19R+K45R+Q48F+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T+K123R；S2N+N4T+C17S+K19R+K45R+Q51N+E53T+D110F+F111N+R113T+K123R；C17S+K19R+K33R+K45R+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T；C17S+K19R+K33R+K45R+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T+K123R；C17S+K19R+K33R+K45R+Q49N+Q51T+F111N+R113T；和C17S+K19R+K33R+K45R+Q49N+Q51T+F111N+R113T+K123R；該取代相對于SEQ ID NO 1所示的野生型人干擾素β的氨基酸序列表示。各具體變體被認(rèn)為是干擾素β變體的一個(gè)實(shí)施方案。例如，一個(gè)實(shí)施方案是C17S+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T；另一個(gè)實(shí)施方案是C17S+K19R+K33R+K45R+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T。上述具體變體中突變優(yōu)選的實(shí)施方案是其中表示的取代僅僅是相對于SEQ ID NO 1所示的野生型人干擾素β的取代。
這些變體可以是偶聯(lián)物的形式，它還包含一個(gè)或多個(gè)非多肽半分子。例如，該變體被糖基化和/或PEG化。當(dāng)干擾素β多肽被糖基化時(shí)，它優(yōu)選被N-糖基化。當(dāng)干擾素β多肽被糖基化時(shí)，它通常含有1-5個(gè)糖類半分子，例如1-3個(gè)糖類半分子。在另一實(shí)施方案中，干擾素β多肽被N-糖基化，且含有1-5個(gè)糖類半分子，例如1-3個(gè)糖類半分子。
當(dāng)干擾素β多肽含有至少一個(gè)導(dǎo)入的糖基化位點(diǎn)時(shí)，優(yōu)選該多肽還含有與導(dǎo)入的糖基化位點(diǎn)連接的至少一個(gè)糖類半分子。具體地說，該干擾素β多肽含有2-5個(gè)糖類半分子，例如2-3個(gè)糖類半分子。在另一實(shí)施方案中，干擾素β多肽被N-糖基化，且包含2-5個(gè)糖類半分子，例如2-3個(gè)糖類半分子。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，干擾素β多肽包含3個(gè)糖類半分子，每個(gè)糖類半分子與一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)連接。
當(dāng)干擾素β多肽被PEG化時(shí)，它通常包含1-5個(gè)聚乙二醇(PEG)分子。在另一實(shí)施方案中，干擾素β多肽包含1-5個(gè)PEG分子，例如1，2或3個(gè)PEG分子。在另一實(shí)施方案中，各PEG分子具有大約5kDa(千道爾頓)至100kDa的分子量。在另一實(shí)施方案中，各PEG分子具有大約10kDa至40kDa的分子量。在另一實(shí)施方案中，各PEG分子具有大約12kDa的分子量。在另一實(shí)施方案中，各PEG分子具有大約20kDa的分子量。優(yōu)選的干擾素β多肽包含1-3個(gè)分別具有大約12kDa分子量的PEG分子，或1個(gè)具有大約20kDa分子量的PEG分子。更優(yōu)選干擾素β多肽含有至少一個(gè)與導(dǎo)入的糖基化位點(diǎn)連接的糖類半分子和1個(gè)具有大約20Kda分子量的PEG分子。最優(yōu)選干擾素β多肽含有與3個(gè)N-糖基化位點(diǎn)連接的3個(gè)糖類半分子和1個(gè)具有大約20Kda分子量的PEG分子。
干擾素多肽可按照本領(lǐng)域已知的方法生產(chǎn)。優(yōu)選的是，干擾素多肽通過從糖基化宿主細(xì)胞中表達(dá)而重組產(chǎn)生(在WO01/15736，PCT/DK02/00128，和WO01/36001中進(jìn)行了詳細(xì)描述)。表達(dá)宿主細(xì)胞可選自真菌(絲狀真菌或酵母)，昆蟲，哺乳動物細(xì)胞，轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因動物。另外，當(dāng)在基因治療中使用編碼本發(fā)明的偶聯(lián)物的多肽部分或本發(fā)明的多肽的核苷酸序列時(shí)，可在人體中完成糖基化。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞，例如CHO細(xì)胞，BHK或HEK細(xì)胞，例如HEK293，或昆蟲細(xì)胞，例如SF9細(xì)胞，或者酵母細(xì)胞，例如啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)，Pichiia pastoris或者任何其它合適的糖基化宿主。合適的哺乳動物宿主細(xì)胞的例子包括中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系，(例如，CHO-K1；ATCC CCL-61)，綠猴細(xì)胞系(COS)(例如COS1(ATCC CRL-1650)，COS7(ATCC CRL-1651))；小鼠細(xì)胞(例如NS/O)，幼年倉鼠腎(BHK)細(xì)胞系(例如ATCC CRL-1632或ATCC CCL-10)，和人細(xì)胞(例如HEK 293(ATCC CRL-1573))，以及組織培養(yǎng)物中的植物細(xì)胞。任選的是，通過體內(nèi)糖基化與多肽連接的糖類半分子可通過使用糖基轉(zhuǎn)移酶，例如使用Neose，Horsham，PA，USA銷售的glycoAdvanceTM技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步修飾。因此，例如可增加CHO細(xì)胞表達(dá)和體內(nèi)糖基化之后的糖基化多肽的唾液酸化。
可按照本領(lǐng)域已知的方法純化干擾素多肽以獲得足夠純度的干擾素制品以便用作藥物。一般來說，該純化方法包括超濾，滲濾，陽離子交換色譜法(例如，來自Pharmacia的S-Sepharose)，疏水相互作用色譜法，羥基磷灰石色譜法，和/或在聚丙烯酰胺葡聚糖柱上的分離。
在另一實(shí)施方案，干擾素多肽是干擾素γ多肽，例如，野生型人干擾素γ，或其變體，任選與非多肽半分子結(jié)合，例如在WO 01/36001中所述的任一變體或偶聯(lián)物。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，該干擾素γ多肽選自干擾素γ變體，例如在下文“干擾素γ變體”部分公開的任一變體。
干擾素γ變體具有優(yōu)化的N-糖基化位點(diǎn)的干擾素γ變體已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過用蘇氨酸殘基取代位于人干擾素γ99位的絲氨酸殘基可增加位于人干擾素γ97位天然存在的N-糖基化位點(diǎn)的糖基化，即可獲得增加的完全，或者基本上完全糖基化的干擾素γ多肽的成份。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過進(jìn)行取代S99T，在收獲的培養(yǎng)基中存在的大約90％的干擾素γ多肽利用了兩個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，而在收獲的培養(yǎng)基中存在的重組產(chǎn)生的人干擾素γ多肽只有大約60％被完全糖基化。
因此，在極有利的實(shí)施方案中，干擾素γ多肽包含取代S99T。
除了優(yōu)化97位的體內(nèi)N-糖基化位點(diǎn)所需的上述S99T突變外，也可優(yōu)化已經(jīng)導(dǎo)入序列內(nèi)的其它體內(nèi)糖基化位點(diǎn)(參見題為“非多肽半分子是糖類半分子的干擾素γ變體”的部分)。一般來說，體內(nèi)糖基化位點(diǎn)是N-糖基化位點(diǎn)，但是在有關(guān)情況下也包含O-糖基化位點(diǎn)。該優(yōu)化可通過在位于靠近糖基化位點(diǎn)，特別是靠近體內(nèi)N-糖基化位點(diǎn)的位置進(jìn)行修飾，優(yōu)選進(jìn)行取代來完成。可導(dǎo)入體內(nèi)N-糖基化位點(diǎn)的合適的位置的具體例子在WO01/36001中公開。
因此，對于天然存在的體內(nèi)N-糖基化，預(yù)期通過在選自由E93，K94，L95，T96，Y98，V100和T101(即在相對于N97的位置-4，-3，-2，-1，+1，+3或+4)組成的組中的位置進(jìn)行諸如取代的修飾可進(jìn)一步優(yōu)化97位的N-糖基化位點(diǎn)。在98位進(jìn)行取代的具體例子包括Y98F，Y98N，Y98Q，Y98V，Y98A，Y98M，Y98I，Y98K，Y98G，Y98R，Y98T，Y98H，Y98C和Y98S，優(yōu)選Y98A，Y98M，Y98I，Y98K，Y98G，Y98R，Y98T，Y98H，Y98C和Y98S，特別是Y98S。在100位進(jìn)行取代的具體例子包括V100H，V100D，V100A，V100M，V100N，V100T，V100R，V100S，或V100C，特別是V100T，V100R，V100S或V100C。
同樣，對于在25位的體內(nèi)N-糖基化位點(diǎn)，預(yù)期通過在選自由D21，V22，A23，D24，G26，L28和F29(即在相對于N25的位置-4，-3，-2，-1，+1，+3或+4)組成的組中的一個(gè)位置進(jìn)行諸如取代的修飾可進(jìn)一步優(yōu)化該位點(diǎn)。在26位進(jìn)行取代的具體例子包括G26F，G26N，G26Y，G26Q，G26V，G26A，G26M，G26I，G26K，G26R，G26T，G26H，G26C和G26S，優(yōu)選G26A，G26M，G26I，G26K，G26R，G26T，G26H，G26C和G26S，更優(yōu)選G26A和G26S，特別是G26A。在28位進(jìn)行取代的具體例子包括G28H，G28D，G28A，G28M，G28N，G28T，G28R，G28S，或G28S，特別是G28A，G28T，G28R，G28S或G28C。
顯然，與優(yōu)化97位糖基化相聯(lián)系所述的任一修飾可與優(yōu)化25位糖基化相聯(lián)系所述的任一修飾相結(jié)合。
含有非多肽半分子連接基團(tuán)的干擾素γ變體可導(dǎo)入的另一類型的感興趣的修飾包括用于增加皮下給藥時(shí)的AUC和/或靜脈內(nèi)給藥時(shí)的血清半壽期的修飾。
在一個(gè)感興趣的實(shí)施方案中，干擾素γ多肽包含至少一個(gè)導(dǎo)入的和/或至少一個(gè)去掉的含有非多肽連接基團(tuán)的氨基酸殘基。
為了避免過多地破壞干擾素γ多肽的結(jié)構(gòu)和功能，根據(jù)該實(shí)施方案待修飾的氨基酸殘基的總數(shù)一般不超過15個(gè)。通常該氨基酸序列與SEQ ID NO2(或其C-末端截短形式)相比含有1-10個(gè)，例如1-5個(gè)，例如1-3個(gè)修飾。優(yōu)選的是，該修飾是取代。
除了去掉和/或?qū)朐摪被釟埢?，該多肽可包含其它修飾，例如與導(dǎo)入和/或去掉含有非多肽半分子連接基團(tuán)的氨基酸殘基無關(guān)的取代。該修飾的例子包括保守氨基酸取代和/或在N-末端導(dǎo)入Cys-Tyr-Cys或Met。
可用于結(jié)合且在二聚體形式的干擾素γ多肽中存在的連接基團(tuán)的精確數(shù)目依賴于需要通過結(jié)合達(dá)到的效果。需要獲得的效果依賴于例如，結(jié)合的性質(zhì)和程度(例如，非多肽半分子的特性，需要或可能與該多肽結(jié)合的非多肽半分子的數(shù)目，它們應(yīng)結(jié)合的位置或者應(yīng)避免結(jié)合的位置，等)。
應(yīng)明白可去掉或?qū)氲暮蟹嵌嚯陌敕肿拥倪B接基團(tuán)的氨基酸殘基可根據(jù)選定非多肽半分子部分的特性進(jìn)行選擇，且在大多數(shù)情況下，根據(jù)所用的結(jié)合方法選擇。例如，當(dāng)非多肽半分子是諸如聚乙二醇或聚環(huán)氧烷衍生分子的多聚體分子時(shí)，能作為連接基團(tuán)起作用的氨基酸殘基可選自由半胱氨酸，賴氨酸，天冬氨酸，谷氨酸和精氨酸組成的組中。具體地說，優(yōu)選半胱氨酸。當(dāng)該非多肽半分子是糖類半分子時(shí)，連接基團(tuán)是例如，體內(nèi)糖基化位點(diǎn)，優(yōu)選是N-糖基化位點(diǎn)。
無論非多肽半分子的連接基團(tuán)是需要在干擾素γ多肽中導(dǎo)入的還是去掉的，待修飾的多肽的位置可方便地選擇如下該位置優(yōu)選位于干擾素γ多肽的表面，且更優(yōu)選被根據(jù)干擾素γ以其二聚體形式的三維結(jié)構(gòu)或模型測定時(shí)具有超過25％的其側(cè)鏈與溶劑接觸的氨基酸殘基占據(jù)，優(yōu)選超過50％的其側(cè)鏈與溶劑接觸，該結(jié)構(gòu)或模型任選進(jìn)一步含有一個(gè)或兩個(gè)干擾素γ受體分子。該位置在本文實(shí)施例A中列出。
另外，感興趣的可能是修飾位于干擾素γ環(huán)區(qū)域的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，因?yàn)槲挥谶@些環(huán)區(qū)域內(nèi)的大多數(shù)氨基酸殘基暴露于表面且與功能性位點(diǎn)相距足夠遠(yuǎn)使得可導(dǎo)入諸如多聚體分子，特別是PEG分子的非多肽半分子，和/或N-糖基化位點(diǎn)而不會損害該多肽的功能。通過檢查任選與其受體復(fù)合的人干擾素γ的三維結(jié)構(gòu)可鑒定該環(huán)區(qū)域。構(gòu)成所述環(huán)區(qū)域的氨基酸殘基是殘基N16-K37(“A-B環(huán)”)，F(xiàn)60-S65(“B-C環(huán)”)，N83-S84 (“C-D環(huán)”)和Y98-L103(“D-E環(huán)”)。
另外，在干擾素γ多肽中，優(yōu)選已經(jīng)去掉了位于干擾素γ的受體結(jié)合位點(diǎn)的連接基團(tuán)，優(yōu)選通過取代含有該基團(tuán)的氨基酸殘基來去掉。構(gòu)成干擾素γ受體結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸殘基是Q1，D2，Y4，V5，E9，K12，G18，H19，S20，D21，V22，A23，D24，N25，G26，T27，L30，K34，K37，K108，H111，E112，I114，Q115，A118，E119(也參見本文實(shí)施例B)。
為了測定連接基團(tuán)的最佳分布，根據(jù)干擾素γ二聚體多肽的三維結(jié)構(gòu)計(jì)算位于干擾素γ多肽表面的氨基酸殘基之間的距離。更具體地說，測定含有該連接基團(tuán)的氨基酸殘基的CB之間的距離，或者一個(gè)殘基的官能團(tuán)(賴氨酸的NZ，天冬氨酸的CG，谷氨酸的CD，半胱氨酸的SG)和含有連接基團(tuán)的另一氨基酸殘基的CB之間的距離。對于甘氨酸，使用CA代替CB。在干擾素γ多肽部分中，為了避免或減少不均一結(jié)合，任一所述的距離優(yōu)選超過8，特別是超過10。
如上所述，在生理?xiàng)l件下，干擾素γ以二聚體多肽存在。該多肽一般是同型二聚體形式(例如通過締合按本文所述制備的兩個(gè)干擾素γ多肽制備)。然而，如果需要，干擾素γ多肽可以單鏈形式提供，其中兩個(gè)干擾素γ多肽單體通過肽鍵或肽接頭連接。以單鏈形式提供干擾素γ多肽具有的優(yōu)勢是兩個(gè)組分的干擾素γ多肽可以不同，這有利于例如，使得該多肽的不對稱誘變成為可能。例如，可從一個(gè)單體的受體結(jié)合位點(diǎn)去掉PEG化位點(diǎn)，但在另一單體中保留。因此，PEG化后，一個(gè)單體具有一個(gè)完整的受體結(jié)合位點(diǎn)，而另一單體被完全PEG化(且因此提供明顯增加的分子量)。
非多肽半分子是糖類半分子的干擾素γ變體在優(yōu)選的實(shí)施方案中，干擾素γ多肽含有至少一個(gè)導(dǎo)入的和/或至少一個(gè)去掉的糖基化位點(diǎn)，即非多肽半分子是糖類半分子。優(yōu)選的是，糖基化位點(diǎn)是體內(nèi)糖基化位點(diǎn)，即非多肽半分子是糖類半分子，例如O-連接的或N-連接的糖類半分子，優(yōu)選N-連接的糖類半分子。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，干擾素γ多肽含有至少一個(gè)導(dǎo)入的糖基化位點(diǎn)，特別是導(dǎo)入的體內(nèi)N-糖基化位點(diǎn)。優(yōu)選的是，該導(dǎo)入的糖基化位點(diǎn)通過取代導(dǎo)入。
例如，體內(nèi)N-糖基化位點(diǎn)可在含有暴露于表面的氨基酸殘基的干擾素γ多肽的位置導(dǎo)入。優(yōu)選所述的表面暴露的氨基酸殘基具有至少25％的側(cè)鏈暴露于表面，特別是至少50％的其側(cè)鏈暴露于表面。關(guān)于測定該位置的詳情可參見本文實(shí)施例A。
N-糖基化位點(diǎn)以這樣的方式導(dǎo)入，即所述位點(diǎn)的N-殘基位于所述的位置。同樣，可導(dǎo)入O-糖基化位點(diǎn)以便構(gòu)成該位點(diǎn)的S或T殘基位于所述位置。應(yīng)明白當(dāng)術(shù)語“其側(cè)鏈的至少25％(或50％)暴露于表面”與體內(nèi)N-糖基化位點(diǎn)的導(dǎo)入相聯(lián)系使用時(shí)，該術(shù)語是指在糖類半分子實(shí)際連接的位置的氨基酸側(cè)鏈的表面可達(dá)性。在許多情況下必需在相對于糖類半分子實(shí)際連接的天冬氨酸殘基的+2位導(dǎo)入一個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基，且允許包埋導(dǎo)入絲氨酸或蘇氨酸殘基的這些位置，即具有不超過25％(或50％)的其側(cè)鏈暴露于該分子的表面。
另外，為了確保有效糖基化，優(yōu)選體內(nèi)糖基化位點(diǎn)，特別是N-糖基化位點(diǎn)的N殘基或O-糖基化位點(diǎn)的S或T殘基位于干擾素γ多肽的118N-末端氨基酸殘基內(nèi)，更優(yōu)選的是位于97N-末端氨基酸殘基內(nèi)。甚至更優(yōu)選的是，在產(chǎn)生該位點(diǎn)僅需要一個(gè)突變的位置(即，產(chǎn)生功能性糖基化位點(diǎn)所需的任何其它氨基酸殘基已經(jīng)存在于該多肽中的位置)導(dǎo)入體內(nèi)糖基化位點(diǎn)。
例如，導(dǎo)致在暴露于干擾素γ多肽表面且被具有至少25％的側(cè)鏈暴露于表面(在具有受體分子的結(jié)構(gòu)中)的氨基酸殘基占據(jù)的位置導(dǎo)入另一N-糖基化位點(diǎn)的取代包括Q1N+P3S/T，P3N+V5S/T，K6N+A8S/T，E9N+L11S/T，K12S/T，K13N+F15S/T，Y14N+N16S/T，G18S/T，G18N，G18N+S20T，H19N+D21S/T，D21N+A23S/T，G26N+L28S/T，G31N+L33S/T，K34N+W36S/T，K37S/T，K37N+E39S/T，E38N，E38N+S40T，E39N+D41S/T，S40N+R42S/T，K55N+F57S/T，K58N+F60S/T，K61S/T，K61N+D63S/T，D62N+Q64S/T，D63N，D63N+S65T，Q64N+I66S/T，S65N+Q67S/T，Q67N，Q67N+S69T，K68N+V70S/T，E71N+I73S/T，T72N+K74S/T，K74N+D76S/T，E75N+M77S/T，K80S/T，V79N+F81S/T，K80N+F82S/T，N85S/T，S84N+K86S/T，K87S/T，K86N+K88S/T，K87N+R89S/T，D90N+F92S/T，E93N+L95S/T，K94N，K94N+T96S，T101N+L103S/T，D102N+N104S/T，L103N+V105S/T，Q106S/T，E119N，E119N+S121T，P122N+A124S/T，A123N+K125S/T，A124N，A124N+T126S，K125N+G127S/T，T126N+K128S/T，G127N+R129S/T，K128N+K130S/T，R129N+R131S/T和K130N。S/T表示取代成絲氨酸或蘇氨酸殘基，優(yōu)選蘇氨酸殘基。
導(dǎo)致在暴露于干擾素γ多肽表面且具有至少50％的側(cè)鏈暴露于表面(在具有受體分子的結(jié)構(gòu)中)的位置導(dǎo)入另一N-糖基化位點(diǎn)的取代包括P3N+V5S/T，K6N+A8S/T，K12S/T，K13N+F15S/T，G18S/T，D21N+A23S/T，G26N+L28S/T，G31N+L33S/T，K34N+W36S/T，K37N+E39S/T，E38N，E38N+S40S/T，E39N+D41S/T，K55N+F57S/T，K58N+F60S/T，K61S/T，D62N+Q64S/T，Q64N+I66S/T，S65N+Q67S/T，K68N+V70S/T，E71N+I73S/T，E75N+M77S/T，N85S/T，S84N+K86S/T，K86N+K88S/T，K87N+R89S/T，K94N，K94N+T96S，T101N+L103S/T，D102N+N104S/T，L103N+V105S/T，Q106S/T，P122N+A124S/T，A123N+K125S/T，A124N，A124N+T126S，K125N+G127S/T，T126N+K128S/T，G127N+R129S/T，K128N+K130S/T，R129N+R131S/T，K130N和K130N+S132T。S/T表示取代成絲氨酸或蘇氨酸殘基，優(yōu)選蘇氨酸殘基。
導(dǎo)入一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)僅需要一個(gè)氨基酸取代的取代包括K12S/T，G18S/T，G18N，K37S/T，E38N，M45N，I49N，K61S/T，D63N，Q67N，V70N，K80S/T，F(xiàn)82N，N85S/T，K87S/T，K94N，Q106S/T，E119N，A124N，K130N和R140N，特別是K12S/T，G18N，G18S/T，K37S/T，E38N，K61S/T，D63N，Q67N，K80S/T，N85S/T，K94N，Q106S/T，A124N和K130N(在沒有受體分子的結(jié)構(gòu)中具有超過25％的其側(cè)鏈暴露于表面的位置)，或更優(yōu)選G18N，E38N，D63N，Q67N，K94N，A124N和K130N(在沒有受體分子的結(jié)構(gòu)中具有超過50％的其側(cè)鏈暴露于表面的位置)。
通常，優(yōu)選不在構(gòu)成受體結(jié)合位點(diǎn)的區(qū)域?qū)隢-糖基化位點(diǎn)(除了在特殊情況下，參見題為“受體親和力下降的干擾素γ變體”的部分)。因此，一般不應(yīng)進(jìn)行突變Q1N+P3S/T，E9N+L11S/T，G18N，G18N+S20T，H19N+D21S/T，D21N+A23S/T，G26N+L28S/T，K34N+W36S/T，K37N+E39S/T，E119N和E119N+S121T，除非需要降低受體親和力。
特別優(yōu)選的干擾素γ多肽包括至少一個(gè)選擇由K12S，K12T，G18S，G18T，E38N，E38N+S40T，K61S，K61T，N85S，N85T，K94N，Q106S和Q106T組成的組中的取代，更優(yōu)選選自由K12T，G18T，E38N+S40T，K61T，N85T，K94N和Q106T組成的組中，甚至更優(yōu)選選自由K12T，G18T，E38N+S40T，K61T和N85T組成的組中，特別是E38N+S40T。
應(yīng)明白上文確定的取代優(yōu)選與S99T突變結(jié)合。因此，非常優(yōu)選的干擾素γ多肽包括選自由K12S+S99T，K12T+S99T，G18S+S99T，G18T+S99T，E38N+S99T，E38N+S40T+S99T，K61S+S99T，K61T+S99T，N85S+S99T，N85T+S99T，K94N+S99T，S99T+Q106S和S99T+Q106T組成的組中的取代，更優(yōu)選選自由K12T+S99T，G18T+S99T，E38N+S40T+S99T，K61T+S99T，N85T+S99T，K94N+S99T和S99T+Q106T組成的組中，甚至更優(yōu)選選自由K12T+S99T，G18T+S99T，E38N+S40T+S99T，K61T+S99T和N85T+S99T組成的組中，特別是E38N+S40T+S99T。
應(yīng)明白任一上述修飾可與題為“優(yōu)化了N-糖基化位點(diǎn)的干擾素γ變體”的部分公開的任一修飾，特別是與取代S99T，以及與題為“非多肽半分子是以半胱氨酸作為連接基團(tuán)的分子的干擾素γ變體”的部分公開的任一修飾結(jié)合。
非多肽半分子是以半胱氨酸作為連接基團(tuán)的分子的干擾素γ變體在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，干擾素γ多肽包含至少一個(gè)導(dǎo)入的半胱氨酸殘基。優(yōu)選的是，通過取代導(dǎo)入半胱氨酸殘基。
例如，可在含有暴露于表面的氨基酸殘基的干擾素γ多肽的位置導(dǎo)入半胱氨酸殘基。優(yōu)選所述的表面暴露的氨基酸殘基具有至少25％的側(cè)鏈暴露于表面，特別是至少50％的其側(cè)鏈暴露于表面。關(guān)于測定該位置的詳情可參見本文實(shí)施例A。
例如，導(dǎo)致在暴露于干擾素γ多肽表面且被具有至少25％的側(cè)鏈暴露于表面(在具有受體分子的結(jié)構(gòu)中)的氨基酸殘基占據(jù)的位置導(dǎo)入一個(gè)半胱氨酸殘基的取代包括Q1C，D2C，P3C，K6C，E9C，N10C，K13C，Y14C，N16C，G18C，H19C，D21C，N25C，G26C，G31C，K34C，N35C，K37C，E38C，E39C，S40C，K55C，K58C，N59C，K61C，D62C，D63C，Q64C，S65C，Q67C，K68C，E71C，T72C，K74C，E75C，N78C，V79C，K80C，N83C，S84C，N85C，K86C，K87C，D90C，E93C，K94C，T101C，D102C，L103C，N104C和E119C。
導(dǎo)致在暴露于干擾素γ多肽表面且被具有至少50％的側(cè)鏈暴露于表面(在具有受體分子的結(jié)構(gòu)中)的氨基酸殘基占據(jù)的位置導(dǎo)入一個(gè)半胱氨酸殘基的取代包括P3C，K6C，N10C，K13C，N16C，D21C，N25C，G26C，G31C，K34C，K37C，E38C，E39C，K55C，K58C，N59C，D62C，Q64C，S65C，K68C，E71C，E75C，N83C，S84C，K86C，K87C，K94C，T101C，D102C，L103C和N104C。
通常，優(yōu)選不在構(gòu)成受體結(jié)合位點(diǎn)的區(qū)域(除了在特殊情況下，參見題為“受體親和力下降的干擾素γ變體”的部分)導(dǎo)入半胱氨酸殘基(且隨后將這些半胱氨酸殘基與非多肽半分子連接)。因此，一般不應(yīng)進(jìn)行突變Q1C，E9C，G18C，H19C，D21C，G26C，K34C，K37C和E119C，除非需要降低受體親和力。
最優(yōu)選的是，通過選自由N10C，N16C，E38C，N59C，N83C，K94C，N104C和A124C組成的組中的取代導(dǎo)入所述的半胱氨酸殘基。
優(yōu)選的是，任一上述修飾的干擾素γ多肽還含有取代S99T。在上述取代中，特別優(yōu)選下列取代N10C+S99T，N16C+S99T，E38C+S99T，N59C+S99T，N83C+S99T，K94C+S99T，N104C+S99T和A124C+S99T。
應(yīng)明白導(dǎo)入的半胱氨酸殘基優(yōu)選與非多肽半分子，例如PEG或更優(yōu)選mPEG結(jié)合。干擾素γ變體與活化多聚體分子的結(jié)合通過使用任一常規(guī)方法進(jìn)行，例如，按下列參考文獻(xiàn)所述(其中也描述了活化多聚體分子的合適方法)Harris和Zalipsky，eds.，Poly(ethylene glycol)Chemistry and BiologicalApplications，AZC，Washington；R.F.Taylor，(1991)，“Protein immobilisation.Fundamental and applications”，Marcel Dekker，N. Y.；S.S.Wong，(1992)，“Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking”，CRC Press，BocaRaton；G.T.Hermanson等，(1993)，“Immobilized Affinity Ligand Techniques”，Academic Press，N.Y.)。
特別優(yōu)選與半胱氨酸殘基偶聯(lián)的活化PEG多聚體的具體例子包括下列線形PEGs乙烯砜-PEG(VS-PEG)，優(yōu)選乙烯砜-mPEG(VS-mPEG)；順丁烯二酰亞胺-PEG(MAL-PEG)，優(yōu)選順丁烯二酰亞胺-mPEG(MAL-mPEG)和正吡啶基-二硫化物-PEG(OPSS-PEG)，優(yōu)選正吡啶基-二硫化物-mPEG(OPSS-mPEG)。一般來說，該P(yáng)EG或mPEG多聚體具有大約5kDa，大約10kD，大約12kDa或大約20kDa的大小。為了與半胱氨酸殘基PEG化，在PEG化之前通常用諸如二硫蘇糖醇(DTT)的還原劑處理干擾素γ變體。隨后用任何常規(guī)方法，例如通過脫鹽去掉該還原劑。PEG與半胱氨酸殘基的結(jié)合一般在pH6-9的合適緩沖液中在4℃到25℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行長達(dá)16小時(shí)。
應(yīng)明白任一上述修飾可與題為“優(yōu)化了N-糖基化位點(diǎn)的干擾素γ變體”的部分公開的任一修飾，特別是與取代S99T，以及與題為“非多肽半分子是糖類半分子的干擾素γ變體”的部分公開的任一修飾結(jié)合。
第一非多肽半分子是糖類半分子且第二非多肽半分子是以半胱氨酸作為連接基團(tuán)的分子的干擾素γ變體在另一特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，干擾素γ多肽包含至少一個(gè)導(dǎo)入的N-糖基化位點(diǎn)和至少一個(gè)導(dǎo)入的半胱氨酸殘基。優(yōu)選的是通過取代導(dǎo)入半胱氨酸殘基和/或N-糖基化位點(diǎn)。通過選擇在分別描述導(dǎo)入N-糖基化位點(diǎn)和半胱氨酸殘基的合適位置的兩個(gè)前述部分中所述的殘基制備該多肽。因此，在一個(gè)感興趣的實(shí)施方案中，干擾素γ多肽包含選自由K12T+N16C，K12T+E38C，K12T+N59C，K12T+N83C，K12T+K94C，K12T+N104C，K12T+A124C，G18T+N10C，G18T+E38C，G18T+N59C，G18T+N83C，G18T+K94C，G18T+N104C，G18T+A124C，E38N+S40T+N10C，E38N+S40T+N16C，E38N+S40T+N59C，E38N+S40T+N83C，E38N+S40T+K94C，E38N+S40T+N104C，E38N+S40T+A124C，K61T+N10C，K61T+N16C，K61T+E38C，K61T+N83C，K61T+K94C，K61T+N104C，K61T+A124C，N85T+N10C，N85T+N16C，N85T+E38C，N85T+N59C，N85T+K94C，N85T+N104C，N85T+A124C，K94N+N10C，K94N+N16C，K94N+E38C，K94N+N59C，K94N+N83C，K94N+N104C，K94N+A124C，Q106T+N10C，Q106T+N16C，Q106T+E38C，Q106T+N59C，Q106T+N83C，Q106T+K94C和Q106T+A124C組成的組中的取代，更優(yōu)選選自由E38N+S40T+N10C，E38N+S40T+N16C，E38N+S40T+N59C，E38N+S40T+N83C，E38N+S40T+K94C，E38N+S40T+N104C和E38N+S40T+A124C組成的組中。
優(yōu)選的是，任一上述修飾的干擾素γ多肽還包含取代S99T，即干擾素γ多肽包含選自由K12T+N16C+S99T，K12T+E38C+S99T，K12T+N59C+S99T，K12T+N83C+S99T，K12T+K94C+S99T，K12T+N104C+S99T，K12T+A124C+S99T，G18T+N10C+S99T，G18T+E38C+S99T，G18T+N59C+S99T，G18T+N83C+S99T，G18T+K94C+S99T，G18T+N104C+S99T，G18T+A124C+S99T，E38N+S40T+N10C+S99T，E38N+S40T+N16C+S99T，E38N+S40T+N59C+S99T，E38N+S40T+N83C+S99T，E38N+S40T+K94C+S99T，E38N+S40T+N104C+S99T，E38N+S40T+A124C+S99T，K61T+N10C+S99T，K61T+N16C+S99T，K61T+E38C+S99T，K61T+N83C+S99T，K61T+K94C+S99T，K61T+N104C+S99T，K61T+A124C+S99T，N85T+N10C+S99T，N85T+N16C+S99T，N85T+E38C+S99T，N85T+N59C+S99T，N85T+K94C+S99T，N85T+N104C+S99T，N85T+A124C+S99T，K94N+N10C+S99T，K94N+N16C+S99T，K94N+E38C+S99T，K94N+N59C+S99T，K94N+N83C+S99T，K94N+N104C+S99T，K94N+A124C+S99T，Q106T+N10C+S99T，Q106T+N16C+S99T，Q106T+E38C+S99T，Q106T+N59C+S99T，Q106T+N83C+S99T，Q106T+K94C+S99T和Q106T+A124C+S99T組成的組中的取代，更優(yōu)選選自由E38N+S40T+N10C+S99T，E38N+S40T+N16C+S99T，E38N+S40T+N59C+S99T，E38N+S40T+N83C+S99T，E38N+S40T+K94C+S99T，E38N+S40T+N104C+S99T和E38N+S40T+A124C+S99T組成的組中。
應(yīng)明白，導(dǎo)入的半胱氨酸殘基優(yōu)選與非多肽半分子，例如PEG或更優(yōu)選mPEG結(jié)合。含有半胱氨酸的多肽變體與多聚體分子之間的結(jié)合可以任何合適的方式完成，例如按題為“非多肽半分子是以半胱氨酸作為連接基團(tuán)的分子的干擾素γ變體”的部分所述。
應(yīng)明白任一上述修飾可與題為“優(yōu)化了體內(nèi)N-糖基化位點(diǎn)的干擾素γ變體”的部分公開的任一修飾，特別是與取代S99T結(jié)合。
受體親和力降低的干擾素γ變體增加干擾素γ多肽血清半壽期的一種方式是降低受體介導(dǎo)的內(nèi)化且因此減少受體介導(dǎo)的清除。受體介導(dǎo)的內(nèi)化依賴于干擾素γ二聚體對干擾素γ受體復(fù)合物的親和力，因此預(yù)期干擾素γ多肽對干擾素γ受體復(fù)合物的親和力降低會使得內(nèi)化，且因此清除的程度更低。
通過在干擾素γ多肽的受體結(jié)合區(qū)進(jìn)行一種或多種修飾，特別是取代可降低干擾素γ二聚體與其受體復(fù)合物的親和力。構(gòu)成受體結(jié)合區(qū)的氨基酸殘基在本文實(shí)施例B中限定?？蛇M(jìn)行的一類取代是保守氨基酸取代。在另一實(shí)施方案中，進(jìn)行的修飾引起導(dǎo)入N-糖基化位點(diǎn)。
因此，在另一感興趣的實(shí)施方案中，干擾素γ多肽在受體結(jié)合位點(diǎn)(按本文限定)含有至少一個(gè)修飾。更具體的說，干擾素γ多肽在所述的受體結(jié)合區(qū)含有產(chǎn)生體內(nèi)N-糖基化位點(diǎn)的至少一個(gè)修飾，優(yōu)選取代。例如，該取代可選自由Q1N+P3S/T，D2N+Y4S/T，Y4N+K6S/T，V5N+E7S/T，E9N+L11S/T，K12N+Y14S/T，G18N，G18N+S20T，H19N+D21S/T，S20N+V22S/T，D21N+A23S/T，V22N+D24S/T，D24N+G26S/T，G26N+L28S/T，L30N+I32S/T，K34N+W36S/T，K37N+E39S/T，K108N+I110S/T，H111N+L113S/T，E112N+I114S/T，I114N+V116S/T，Q115N+M117S/T，A118N+L120S/T，E119N和E119N+S121T組成的組中，優(yōu)選選自由Q1N+P3S/T，D2N+Y4S/T，E9N+L11S/T，K12N+Y14S/T，G18N，G18N+S20T，H19N+D21S/T，S20N+V22S/T，D21N+A23S/T，K34N+W36S/T，K37N+E39S/T，H111N+L113S/T，Q115N+M117S/T，A118N+L120S/T，E119N和E119N+S121T組成的組中(在含有其側(cè)鏈的至少25％暴露于表面的氨基酸殘基的位置導(dǎo)入N-糖基化位點(diǎn))，更優(yōu)選選自由Q1N+P3S/T，D2N+Y4S/T，E9N+L11S/T，G18N，G18N+S20T，H19N+D21S/T，S20N+V22S/T，D21N+A23S/T，K34N+W36S/T，K37N+E39S/T，Q115N+M117S/T，A118N+L120S/T，E119N和E119N+S121T組成的組中(在含有其側(cè)鏈的至少50％暴露于表面的氨基酸殘基的位置導(dǎo)入N-糖基化位點(diǎn))，甚至更優(yōu)選選自由Q1N+P3T，D2N+Y4T，E9N+L11T，G18N+S20T，H19N+D21T，S20N+V22T，D21N+A23T，K34N+W36T，K37N+E39I，Q115N+M117I，A118N+L120T和E119N+S121T組成的組中，最優(yōu)選選自由G18N+S20T，H19N+D21T，D21N+A23T和E119N+S121T組成的組中，特別是D21N+A23T。
預(yù)期該變體與人干擾素γ或Actimmune相比表現(xiàn)出降低的受體親和力。該受體親和力可通過任何合適的試驗(yàn)來測量且是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。測定受體結(jié)合親和力的合適試驗(yàn)的一個(gè)例子是Michiels等，Int.J.Biochem.Cell Biol.30505-516(1998)所述的BIAcore試驗(yàn)。
一般來說，例如，當(dāng)在本文所述的“一級試驗(yàn)”中檢測時(shí)，受體親和力降低的干擾素γ多肽表現(xiàn)出降低的干擾素γ活性。例如，干擾素γ多肽可表現(xiàn)出Actimunne或人干擾素γ的1-95％的干擾素γ活性，例如1-75％，例如1-50％，例如1-20％或1-10％的Actimunne或以其糖基化形式的人干擾素γ的干擾素γ活性。
顯然，導(dǎo)致受體結(jié)合親和力降低的任一上述修飾可與本文公開的任一其它修飾結(jié)合，特別是在題為“優(yōu)化N-糖基化位點(diǎn)的干擾素γ變體”，“含有非多肽半分子連接基團(tuán)的干擾素γ變體”，“非多肽半分子是糖類半分子的干擾素γ變體”，“非多肽半分子是以半胱氨酸作為連接基團(tuán)的分子的干擾素γ變體”和“第一非多肽半分子是糖類半分子且第二非多肽半分子是以半胱氨酸作為連接基團(tuán)的分子的干擾素γ變體”部分提及的修飾，例如選自由E38N，S40T，S99T及其組合組成的組中的修飾，特別是E38N+S40T+S99T。
在另一實(shí)施方案中，干擾素γ多肽含有至少一個(gè)導(dǎo)入的糖基化位點(diǎn)，和至少一個(gè)與導(dǎo)入的糖基化位點(diǎn)連接的糖類半分子。在另一實(shí)施方案中，干擾素γ多肽包含至少一個(gè)導(dǎo)入的糖基化位點(diǎn)和至少一個(gè)與導(dǎo)入的糖基化位點(diǎn)連接的糖類半分子，和一個(gè)諸如聚乙二醇的多聚體分子。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，干擾素γ多肽含有3個(gè)糖類半分子，每個(gè)糖類半分子與一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)連接。
對干擾素γ多肽的截短分析以許多方式可對干擾素γ多肽純化樣品的C-末端截短進(jìn)行測定。
闡明干擾素γ多肽C-末端截短的一種方式依賴于通過質(zhì)譜法的精確質(zhì)量測定。不幸的是，干擾素γ的糖基化是不均一的，因此使得極難直接測定糖蛋白的精確質(zhì)量。因此，一般使用不同水平的酶促去糖基化與質(zhì)譜法結(jié)合。
在一種方法中，使用內(nèi)切糖苷酶PNGase F裂解干擾素γ多肽的全部聚糖部分，接著使用ESI質(zhì)譜法或MALDI-TOF質(zhì)譜法進(jìn)行精確質(zhì)量測定。比較實(shí)驗(yàn)質(zhì)量與干擾素γ的已知氨基酸序列使得測定C-末端截短的位點(diǎn)成為可能。
在另一有關(guān)方法中，僅裂解干擾素γ多肽的聚糖部分的唾液酸而不是全部聚糖。在某些情況下，將樣品的不均一性降低到這樣的水平是足夠的，即在該水平下使用ESI質(zhì)譜法或MALDI-TOF質(zhì)譜法進(jìn)行精確質(zhì)量測定后可推測出C-末端截短的位點(diǎn)。
闡明干擾素γ多肽C-末端截短的一種更傳統(tǒng)的方式是采用肽圖譜結(jié)合質(zhì)譜法和化學(xué)氨基酸測序。簡單地說，干擾素γ多肽用已知特異性的蛋白酶(Asp-N蛋白酶)降解，接著使用RP-HPLC進(jìn)行肽分離。然后線上使用ESI質(zhì)譜法或離線使用MALDI-TOF質(zhì)譜法對分級分離成份進(jìn)行質(zhì)量分析。比較獲得的肽質(zhì)量與干擾素γ的已知氨基酸序列使得測定C-末端截短的可能位點(diǎn)成為可能。然后通過氨基酸測序得到證實(shí)。
磺基烷基醚環(huán)糊精衍生物在本發(fā)明的組合物中，磺基烷基醚環(huán)糊精衍生物是在US 5,874,418，US5,376,645和US 5,134,127中所述的任一衍生物，本文引用其內(nèi)容以供參考。磺基烷基醚環(huán)糊精衍生物在WO91/11172中也進(jìn)行了描述，本文引用其內(nèi)容以供參考。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，磺基烷基醚環(huán)糊精是具有式(I)的化合物 其中n是4，5或6，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，和R9分別獨(dú)立地是，-O-或-O-(C2-C6亞烷基)-SO3-基團(tuán)，其中R1和R2中至少一個(gè)獨(dú)立地是-O-(C2-C6亞烷基)-SO3-基團(tuán)，且S1，S2，S3，S4，S5，S6，S7，S8和S9分別獨(dú)立地是可藥用的陽離子。
在式(I)的化合物的另一實(shí)施方案中，n是5。
在式(I)的化合物的另一實(shí)施方案中，n是6。
在式(I)的化合物的另一實(shí)施方案中，R1和R2中至少一個(gè)是-O-(CH2)m-SO3，且m是2，3，4，5或6。
在式(I)的化合物的另一實(shí)施方案中，R1和R2獨(dú)立地選自-OCH2CH2CH2SO3-或-OCH2CH2CH2CH2SO3-。
在式(I)的化合物的另一實(shí)施方案中，R4，R6和R8中至少一個(gè)獨(dú)立地是-O-(C2-C6亞烷基)-SO3-；且R5，R7和R9都是-O-。
在式(I)的化合物的另一實(shí)施方案中，S1，S2，S3，S4，S5，S6，S7，S8和S9分別獨(dú)立地是可藥用的陽離子，該陽離子選自H+，堿金屬(例如Li+，Na+，K+)，堿土金屬(例如，Ca+2，Mg+2)，銨離子和諸如(C1-C6)烷基胺，哌啶，吡嗪，(C1-C6)烷醇胺和(C4-C8)環(huán)烷醇胺的陽離子的胺陽離子。
在式(I)的化合物的另一實(shí)施方案中，S1，S2，S3，S4，S5，S6，S7，S8和S9獨(dú)立地選自堿金屬陽離子，堿土金屬陽離子，四價(jià)銨陽離子，三價(jià)銨陽離子，和二價(jià)銨陽離子。
在另一實(shí)施方案中，R4，R6和R8中至少一個(gè)獨(dú)立地是-O-(C2-C6亞烷基)-SO3-；且R5，R7和R9都是-O-。
本文使用的術(shù)語“亞烷基”和“烷基”(例如在-O-(C2-C6亞烷基)-SO3-基團(tuán)或在烷基胺中)分別包括線型，環(huán)狀，和分支，飽和和不飽和(即，含有一個(gè)雙鍵)的二價(jià)亞烷基基團(tuán)和單價(jià)烷基基團(tuán)。本文中的術(shù)語“烷醇”同樣包括線型，環(huán)狀，和分支，飽和和不飽和烷基成份的烷醇基團(tuán)，其中羥基可位于烷基半分子的任一位置。術(shù)語“環(huán)烷醇”包括未取代或取代(例如，用甲基或乙基)的環(huán)醇。
目前優(yōu)選的磺基烷基醚環(huán)糊精衍生物是β環(huán)糊精磺基丁基醚的鹽(特別是以Captisol可獲得的也稱為SBE7-β-CD的其鈉鹽)(Cydex，Overland Park，Kansas 66213，US)。
本發(fā)明組合物的其它實(shí)施方案一般來說，本發(fā)明的組合物的pH范圍為3-8，例如4-8，5-8，6-8，7-8，4-7，4-6，或4-5。對于干擾素β，優(yōu)選的pH范圍是4-8，優(yōu)選5-8，或另選4-7。在另一實(shí)施方案中，該pH范圍為5-6，例如大約5.5。一般通過使用在下文中進(jìn)一步描述的合適量的緩沖劑可獲得該pH。
另外，需要該組合物與血液幾乎等滲，即，具有大約240-360mOsmol/kg的摩爾滲透壓濃度，例如280-320mOsmol/kg，特別是大約300mOsmol/kg。一般通過使用下文進(jìn)一步描述的合適量的張度劑可獲得該摩爾滲透壓濃度。
因此，在廣義的方面，本發(fā)明涉及含有干擾素多肽和磺基烷基醚環(huán)糊精衍生物的穩(wěn)定化組合物。該干擾素多肽一般選自上文和實(shí)施例中提及的任意一種。干擾素多肽的優(yōu)選實(shí)施方案是干擾素β和干擾素γ，特別是干擾素β變體和干擾素γ變體，例如糖基化和/或PEG化的變體，如上文的詳細(xì)描述。
干擾素多肽一般在液體制品中以大約1-100MIU/ml的濃度或者在固體制品中以大約1-100MIU/劑存在。該濃度可選自在液體制品中的大約1-10MIU/ml，1-20MIU/ml，1-30MIU/ml，1-40MIU/ml，1-50MIU/ml，1-60MIU/ml，1-70MIU/ml，1-80MIU/ml，1-90MIU/ml，10-20MIU/ml，20-30MIU/ml，30-40MIU/ml，40-50MIU/ml，50-60MIU/ml，60-70MIU/ml，70-80MIU/ml，80-90MIU/ml，90-100MIU/ml，5-95MIU/ml，15-85MIU/ml，25-75MIU/ml，35-65MIU/ml，和45-55MIU/ml。另外，該濃度可選自在固體制品中的大約1-10MIU/劑，1-20MIU/劑，1-30MIU/劑，1-40MIU/劑，1-50MIU/劑，1-60MIU/劑，1-70MIU/劑，1-80MIU/劑，1-90MIU/劑，10-20MIU/劑，20-30MIU/劑，30-40MIU/劑，40-50MIU/劑，50-60MIU/劑，60-70MIU/劑，70-80MIU/劑，80-90MIU/劑，90-100MIU/劑，5-95MIU/劑，15-85MIU/劑，25-75MIU/劑，35-65MIU/劑，和45-55MIU/劑。
磺基烷基醚環(huán)糊精衍生物一般以大約1-150mg/ml的濃度存在。該濃度可選自大約1-10mg/ml，1-20mglml，1-30mg/ml，1-40mg/ml，1-50mg/ml，1-60mg/ml，1-70mg/ml，1-80mg/ml，1-90mg/ml，1-100mg/ml，1-110mg/ml，1-120mg/ml，1-130mg/ml，1-140mg/ml，10-20mg/ml，20-30mg/ml，30-40mg/ml，40-50mg/ml，50-60mg/ml，60-70mg/ml，70-80mg/ml，80-90mg/ml，90-100mg/ml，100-110mg/ml，110-120mg/ml，120-130mg/ml，130-140mg/ml，140-150mg/ml，5-100mg/ml，5-95mg/ml，5-90mg/ml，5-85mg/ml，5-80mg/ml，5-75mg/ml，5-70mg/ml，5-65mg/ml，5-60mg/ml，5-55mg/ml，5-50mg/ml，5-45mg/ml，5-40mg/ml，5-35mg/ml，5-30mg/ml，5-25mg/ml，5-20mg/ml，5-15mg/ml，和5-10mg/ml。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物的pH范圍為4-8，且摩爾滲透壓濃度為大約240-360mOsmol/kg，例如280-320mOsmol/kg，特別是大約300mOsmol/kg。
在一個(gè)具體方面，本發(fā)明的組合物涉及含有干擾素多肽和磺基烷基醚環(huán)糊精衍生物的液體溶液。
在另一具體方面，本發(fā)明的組合物涉及含有干擾素多肽和磺基烷基醚環(huán)糊精衍生物的水溶液。
磺基烷基醚環(huán)糊精衍生物一般以大約1-150mg/ml的濃度存在。然而，任一上述濃度范圍都認(rèn)為是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案。
干擾素多肽一般在液體溶液中以大約1-100MIU/ml的濃度存在。然而，任一上述濃度范圍都認(rèn)為是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案。
在一個(gè)實(shí)施方案中，液體溶液或水溶液是等滲的且具有大約240-360mOsmol/kg的摩爾滲透壓濃度。在另一實(shí)施方案中，液體溶液或水溶液是等滲的且具有大約240-360mOsmol/kg的摩爾滲透壓濃度，并具有4-8的pH范圍，例如5-8，6-8，7-8，4-7，4-6，或4-5。在還有另一實(shí)施方案中，液體溶液或水溶液還含有提供大約240-360mOsmol/kg的摩爾滲透壓濃度的張度劑。該張度劑可以是任何合適的張度劑，例如在下文“腸胃外制品”部分提及的任一張度劑。在還有另一實(shí)施方案中，該液體溶液或水溶液還含有以高達(dá)100mM的濃度存在的緩沖劑。緩沖劑的濃度可選自在下文“腸胃外制品”部分提及的任一濃度范圍。該緩沖劑可以是任何合適的緩沖劑，例如在下文“腸胃外制品”部分提及的任一緩沖劑。
如上所述，干擾素多肽一般選自上文和實(shí)施例中提及的任一多肽。干擾素多肽的優(yōu)選實(shí)施方案是干擾素β和干擾素γ，特別是任一干擾素β變體和干擾素γ變體，例如任一糖基化和/或PEG化的變體，如上文的詳細(xì)描述。干擾素多肽的其它優(yōu)選的實(shí)施方案是人野生型干擾素β和人野生型干擾素γ，例如糖基化和/或PEG化分子，例如與多聚體，例如包括聚乙二醇的多聚體偶聯(lián)的糖基化干擾素β-1a。
優(yōu)選的是，本發(fā)明的組合物是其中干擾素多肽在37℃的溫度下貯存至少1周，優(yōu)選至少2，3或4周期間基本上保留其生物活性的組合物(在加速穩(wěn)定性試驗(yàn)中測量的)。其中干擾素多肽基本上保留其生物活性是指保留其生物活性的至少80％，優(yōu)選其生物活性的至少90％。
另外，在本發(fā)明的組合物中優(yōu)選干擾素多肽在25℃的溫度下貯存至少4周，例如至少5，6，7，8，9，10，11或12周期間基本上保留其生物活性。在另一選擇中，本發(fā)明的組合物是其中干擾素多肽在37℃的溫度下貯存至少1周期間，和在25℃的溫度下貯存至少4周期間基本上保留其生物活性的組合物。待測量的生物活性是，例如抗病毒活性。
抗病毒活性可用本領(lǐng)域已知的方法測定，例如，通過使用在WO01/15736(干擾素β)和WO01/36001(干擾素γ)中所述的測定法。
WO01/15736的測定法如下使用A549細(xì)胞(CCL 185，美國組織培養(yǎng)物保藏中心)和腦心肌炎(EMC)病毒(VR-129B，美國組織培養(yǎng)物保藏中心)進(jìn)行抗病毒生物測定。將細(xì)胞以10,000個(gè)細(xì)胞/孔的濃度接種在96孔組織培養(yǎng)平板中并在37℃下在5％CO2的空氣中培養(yǎng)。在含有胎牛血清和抗生素的總共100μl DMEM培養(yǎng)基中以從大約100-0.0001IU/mL的濃度范圍(一般為100-0.0001IU/mL)加入本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物。24小時(shí)后取出培養(yǎng)基并向各孔中加入含有EMC病毒的0.1mL新鮮培養(yǎng)基。以24小時(shí)后在無干擾素-β的細(xì)胞培養(yǎng)物中引起100％細(xì)胞死亡的濃度加入EMC病毒。再過24小時(shí)后，使用WST-1測定法測量該多肽或偶聯(lián)物的抗病毒效果。向0.1mL培養(yǎng)物中加入0.01mL WST-1(WST-1細(xì)胞增生劑，Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)并在37℃下在5％CO2的空氣中培養(yǎng)1/2-2小時(shí)。在活細(xì)胞中線粒體脫氫酶裂解四氮唑鹽WST-1導(dǎo)致形成可通過在450nm下測量吸光度進(jìn)行定量的甲月替(formazan)。
相對于已知標(biāo)準(zhǔn)以U/ml計(jì)算產(chǎn)量，該標(biāo)準(zhǔn)包括在相同的平板上和在相同條件下分析。
WO01/36001中的測定法如下以前已經(jīng)公開了干擾素γ與HeLa細(xì)胞上的干擾素γ受體相互作用并激活該受體。因而，在含有干擾素刺激反應(yīng)元件(ISRE)的啟動子上可激活轉(zhuǎn)錄。因此通過使用放置于HeLa細(xì)胞中的偶聯(lián)螢光素酶報(bào)道基因的ISRE(ISRE-luc)來篩選干擾素受體的激動劑是可能的。
用ISRE-Luc和pCDNA 3.1/hygro共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，通過在含有潮霉素B的DMEM培養(yǎng)基中選擇可產(chǎn)生轉(zhuǎn)化灶(細(xì)胞克隆)。在存在或不存在干擾素γ的條件下篩選細(xì)胞克隆的螢光素酶活性。表現(xiàn)出刺激與未刺激的螢光素酶活性的最高比率的那些克隆用于進(jìn)一步的試驗(yàn)。
為了篩選突變體，在96孔培養(yǎng)平板中接種15,000個(gè)細(xì)胞/孔并在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。第二天以各種濃度向細(xì)胞中加入突變體和已知標(biāo)準(zhǔn)。平板在37℃下在5％CO2的空氣中培養(yǎng)6小時(shí)，隨后向各孔中加入LucLite底物(Packard Bioscience，Groningen The Netherlands)。密封平板并在TopCount發(fā)光計(jì)(Packard)上以SPC(單光子計(jì)數(shù))方式測量發(fā)光。每個(gè)平板含有用干擾素γ培養(yǎng)的孔作為刺激對照，其它孔含有正常培養(yǎng)基作為未刺激對照。刺激的和未刺激的螢光素酶活性之間的比率用作突變體活性和實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)間誤差的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。
本發(fā)明的藥用組合物可以是各種形式，包括液體，凝膠，凍干品，肺分散劑，或者任何其它合適的形式，例如壓縮固體。在本發(fā)明上下文中術(shù)語“液體”試圖包括術(shù)語“含水的”。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，該組合物是干燥形式或者是液體配制品。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，該組合物是干燥形式。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中該組合物是液體形式。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，該組合物是水溶液。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中該組合物是含水懸液。
優(yōu)選的形式依賴于所治療的具體適應(yīng)癥且對本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的。例如，凍干溶液可用于進(jìn)一步增加穩(wěn)定性。
本發(fā)明的藥用組合物可通過口腔，靜脈內(nèi)，大腦內(nèi)，肌肉內(nèi)，腹膜內(nèi)，真皮內(nèi)，皮下，鼻內(nèi)，肺內(nèi)，或以任何其它可接受的方式，例如使用諸如PowderJect或ProLease技術(shù)的給藥系統(tǒng)進(jìn)行給藥。優(yōu)選的給藥方式依賴于所治療的具體適應(yīng)癥且對本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的。
在下文中，描述了適合于配制品的特定類型的組合物。應(yīng)明白使用的各種添加劑的性質(zhì)和量依賴于干擾素多肽以及配制品的類型和給藥途徑。一般來說，本發(fā)明的組合物包含緩沖劑，張度劑，保存劑，潤濕劑，粘度增加劑，和/或一種或多種除了磺基烷基醚環(huán)糊精衍生物之外的穩(wěn)定劑。應(yīng)明白該穩(wěn)定劑必須對磺基烷基醚環(huán)糊精衍生物的穩(wěn)定效果無有害影響。該組合物的其它組分在下文中進(jìn)一步描述。
另外，本發(fā)明的組合物可包含人血-清白蛋白或用于穩(wěn)定該組合物和/或最小化與貯存該組合物的容器的吸附的其它人體蛋白質(zhì)。然而，在一個(gè)具體實(shí)施方案中，該組合物基本上不合人血清白蛋白或其它人體蛋白質(zhì)，因?yàn)閺氖芸刂频挠^點(diǎn)來看可能不需要存在該蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的組合物可用制備藥用組合物的常規(guī)方法來制備。例如，通過在摻入干擾素多肽前預(yù)先混合穩(wěn)定和緩沖劑，和任何其它添加劑可制備該組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中用氮凈化含水配制品和/或氮凈化部分填充的產(chǎn)品容器的空隙容積來制備該組合物。在另一實(shí)施方案中，無須該氮凈化來制備該組合物。
存在于組合物中的干擾素多肽的量依賴于干擾素多肽，配制品和給藥途徑的特性。例如，當(dāng)該組合物是含有干擾素β的組合物時(shí)，干擾素β多肽以相應(yīng)于1-100MIU/ml的量存在，一般為1-50MIU/ml(當(dāng)配制成液體配制品時(shí))或1-100MIU/劑(當(dāng)配制成固體配制品時(shí))。
腸胃外制品藥用組合物的一個(gè)例子是設(shè)計(jì)成用于腸胃外給藥的溶液。盡管在許多情況下，藥用溶液配制品以適合于立即使用的液體形式提供，但是該腸胃外配制品也可以冷凍或者凍干形式提供。在前一種情況下，該組合物必須在用前融化。后一種形式常用于增強(qiáng)組合物中所含的活性化合物在各種貯存條件下的穩(wěn)定性，因?yàn)楸绢I(lǐng)域的技術(shù)人員會認(rèn)識到凍干制品一般比其液體相應(yīng)物更穩(wěn)定。該凍干制品在用前通過加入一種或多種合適的可藥用的諸如注射用無菌水或者無菌生理鹽溶液的稀釋劑來重建。
對于腸胃外制品，可通過合適地混合具有所需純度的干擾素多肽與一種或多種可藥用的載體，本領(lǐng)域常用的賦形劑或者穩(wěn)定劑(它們都稱為“賦形劑”)，例如緩沖劑，穩(wěn)定劑，保存劑，張度劑，非離子去污劑，抗氧化劑和/或其它各種添加劑來制備它們用于作為凍干配制品或者水溶液貯存。
緩沖劑以這樣的濃度存在，即該濃度確保pH維持在所需水平，例如接近生理水平的水平。該緩沖劑對于各種緩沖類型具有高達(dá)100mM的合適濃度。對于大多數(shù)緩沖劑，該濃度一般以1-100mM的范圍存在，例如1-90mM，1-80mM，1-70mM，1-60mM，1-50mM，1-40mM，1-30mM，1-20mM，1-10mM，5-15mM，15-25mM，25-35mM，35-45mM，45-55mM，55-65mM，65-75mM，75-85mM，85-95mM。合適的濃度可由技術(shù)人員測定。緩沖劑一般是弱酸，弱堿或該酸的陰離子鹽的溶液。用于本發(fā)明的合適緩沖劑包括有機(jī)和無機(jī)酸及其鹽，例如檸檬酸鹽緩沖劑(例如，檸檬酸一鈉-檸檬酸二鈉混合物，檸檬酸-檸檬酸三鈉混合物，檸檬酸-檸檬酸一鈉混合物，等)，琥珀酸鹽緩沖劑(例如，琥珀酸-琥珀酸一鈉混合物，琥珀酸-氫氧化鈉混合物，琥珀酸-琥珀酸二鈉混合物，等)，酒石酸鹽緩沖劑(例如，酒石酸-酒石酸鈉混合物，酒石酸-酒石酸鉀混合物，酒石酸-氫氧化鈉混合物，等)，延胡索酸鹽緩沖劑(例如，延胡索酸-延胡索酸一鈉混合物，延胡索酸-延胡索酸二鈉混合物，延胡索酸一鈉-延胡索酸二鈉混合物，等)，馬來酸鹽緩沖劑(例如，馬來酸鈉)，葡萄糖酸鹽緩沖劑(例如，葡萄糖酸-葡萄糖酸鈉混合物，葡萄糖酸-氫氧化鈉混合物，葡萄糖酸-葡萄糖酸鉀混合物，等)，草酸鹽緩沖劑(例如，草酸-草酸鈉混合物，草酸-氫氧化鈉混合物，草酸-草酸鉀混合物，等)，乳酸鹽緩沖劑(例如，乳酸-乳酸鈉混合物，乳酸-氫氧化鈉混合物，乳酸-乳酸鉀混合物，等)和乙酸鹽緩沖劑(例如，乙酸-乙酸鈉混合物，乙酸-氫氧化鈉混合物，等)。其它可能性是磷酸鹽緩沖劑，碳酸鹽緩沖劑(例如，碳酸鈉)，組氨酸緩沖劑，和谷氨酸鹽緩沖劑。加入保存劑以阻止微生物生長，且一般以大約0.2％-1％(w/v)的量加入。用于本發(fā)明的合適的保存劑包括苯酚，苯甲醇，間甲酚，對羥基苯甲酸烷基酯，例如對羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯，芐烷銨鹵化物(例如，芐烷銨氯，溴或碘)，兒茶酚，間苯二酚，3-戊醇和其合適的混合物。
因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包含諸如上述任一種或其混合物的緩沖劑。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物還含有保存劑和/或粘度增加劑。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物不含保存劑。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包含選自檸檬酸鹽緩沖劑，琥珀酸鹽緩沖劑，酒石酸鹽緩沖劑，延胡索酸鹽緩沖劑，馬來酸鹽緩沖劑，葡萄糖酸鹽緩沖劑，草酸鹽緩沖劑，磷酸鹽緩沖劑，碳酸鹽緩沖劑，組氨酸緩沖劑，谷氨酸鹽緩沖劑，乳酸鹽緩沖劑，和乙酸鹽緩沖劑的一種緩沖劑。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包含以高達(dá)100mM的濃度存在的緩沖劑，例如1mM至100mM，1-90mM，1-80mM，1-70mM，1-60mM，1-50mM，1-40mM，1-30mM，1-20mM，1-10mM，5-15mM，15-25mM，25-35mM，35-45mM，45-55mM，55-65mM，65-75mM，75-85mM，或85-95mM。
加入張度劑以確保液體組合物的等滲性且該張度劑包括多羥基糖醇，優(yōu)選三羥基或更高級糖醇，例如甘油，赤蘚醇，阿拉伯糖醇，木糖醇，山梨醇和甘露醇(甘露醇一般以高達(dá)50mg/ml的濃度存在)，或NaCl(NaCl一般以高達(dá)9mg/ml的濃度存在)?？紤]到其它成分的相對量，多羥基醇以占重量的0.1％和25％之間的量存在，一般為1％至5％。
穩(wěn)定劑是指各種賦形劑，按功能從膨脹劑到可增溶治療劑或幫助防止變性或粘附到容器壁的添加劑之間變化。典型的穩(wěn)定劑可以是多羥基糖醇(上面列舉)；諸如精氨酸，賴氨酸，甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，組氨酸，丙氨酸，鳥氨酸，L-亮氨酸，2-苯丙氨酸，谷氨酸，蘇氨酸等的氨基酸，有機(jī)糖類或者糖醇，例如乳糖，海藻糖，水蘇糖，甘露醇，山梨醇，木糖醇，核糖醇，肌醇，半乳糖醇，甘油等，包括諸如肌醇的環(huán)醇；聚乙二醇；氨基酸多聚體；諸如尿素，谷胱甘肽，硫辛酸，巰基醋酸鈉，硫代甘油，α-一硫代甘油和硫代硫酸鈉的含硫還原劑；低分子量多肽(即＜10個(gè)殘基)；諸如人血清白蛋白，牛血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白的蛋白質(zhì)；諸如聚乙烯吡咯烷酮的親水性多聚體；諸如木糖，甘露糖，果糖和葡萄糖的單糖；諸如乳糖，麥芽糖和蔗糖的二糖；諸如棉子糖的三糖，和諸如葡聚糖的多糖。穩(wěn)定劑一般以基于活性蛋白重量的從0.1到10,000份重量的范圍存在。
可存在非離子表面活性劑或去污劑(也稱為“潤濕劑”)以幫助增溶治療劑和防止治療性多肽的攪拌誘導(dǎo)型聚集，它也允許該配制品暴露于剪切面張力而不引起多肽變性。合適的非離子表面活性劑包括聚山梨酯(20，80等)，polyoxamers(184，188等)，Pluronic多元醇，聚氧化乙烯脫水山梨醇單醚(Tween-20(Tween-20一般以高達(dá)2mg/ml的濃度存在)，Tween-80(Tween-80一般以高達(dá)2mg/ml的濃度存在)，等)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)組合物包含干擾素β多肽時(shí)不加入諸如非離子表面活性劑的表面活性劑。
其它各種賦形劑包括膨脹劑或者填充劑(例如，淀粉)，螯合劑(例如，EDTA)，抗氧化劑(例如，抗壞血酸，甲硫氨酸，維生素E)和助溶劑。在膠體給藥系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體，白蛋白微球體，微乳狀液，納米顆粒和納米膠囊)或在緩釋制品(參見下一部分)中，該活性成分也可包埋于通過例如，coascervation技術(shù)或者通過界面聚合制備的微膠囊中，例如羥甲基纖維素，明膠或聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊中。該技術(shù)在Remington′s PharmaceuticalSciences，by E.W.Martin，第18版，A.R.Gennaro，Ed.，Mack PublishingCompany ；Pharmaceutical Formulation Development of Peptides andProteins中公開。
用于體內(nèi)給藥的腸胃外配制品必須是無菌的。例如，通過無菌過濾膜過濾可容易地實(shí)現(xiàn)這點(diǎn)。
緩釋制品(用于腸胃外或其它用途)緩釋制品的合適例子包括含有干擾素多肽的固態(tài)疏水多聚體和/或親水性多聚體的半透性基質(zhì)，該基質(zhì)具有諸如薄膜，桿狀，微膠囊或微球體的合適形式。緩釋基質(zhì)的例子包括聚酯，水凝膠(例如，聚(2-羥乙基-異丁烯酸酯)或聚(乙烯醇))，聚交酯，L-谷氨酸和乙基-L-谷氨酸共聚物，不可降解的乙烯乙酸乙烯酯，葡聚糖，淀粉，諸如ProLease技術(shù)或Lupron Depot(由乳酸-乙醇酸共聚物和leuprolide乙酸組成的可注射的微球體)的可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。盡管諸如乙烯乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸的多聚體能在諸如達(dá)到或者超過100天的長時(shí)間內(nèi)釋放分子，但是某些水凝膠在較短的時(shí)間期限內(nèi)釋放蛋白質(zhì)。
肺或鼻給藥配制品該配制品可以是液體形式或者是固體配制品，作為分散體形式或者以該形式使用。
用于給藥和/或產(chǎn)生分散體的所有有關(guān)裝置需要使用適合于分散該干擾素多肽的配制品。一般來說，各配制品對于采用的裝置類型具有特異性且可包括使用除了用于治療的常規(guī)稀釋劑，佐劑和/或載體外的合適的推進(jìn)劑物質(zhì)。各配制品對于作為分散體給藥的干擾素多肽一般也具有特異性。另外，也包含使用脂質(zhì)體，微膠囊或微球體，包涵體復(fù)合物，或其它類型的載體?，F(xiàn)在描述可在最常見類型的肺分散裝置中使用以實(shí)施本發(fā)明的干擾素多肽配制品。
噴霧器干擾素配制品適合于用噴射或者超聲波的噴霧器使用的干擾素多肽配制品一般包含以例如，大約0.01到25mg干擾素多肽每mL溶液，優(yōu)選大約0.1到10mg/mL的濃度溶于水中的干擾素多肽。該配制品也可包括緩沖劑和張度劑，例如用于蛋白質(zhì)穩(wěn)定和滲透壓調(diào)節(jié)的糖類，和/或0.1到10mg/ml濃度范圍內(nèi)的人血清白蛋白?？墒褂玫木彌_劑的例子有醋酸鈉，檸檬酸鹽和甘氨酸。優(yōu)選的是，緩沖劑具有適合于將溶液pH調(diào)節(jié)到3至9范圍內(nèi)的組分和摩爾濃度。一般來說，從1mM到50mM的緩沖劑摩爾濃度適用于該目的?？墒褂玫奶穷惖睦邮侨樘?，麥芽糖，甘露醇，山梨醇，海藻糖和木糖，含量范圍通常占配制品重量的1％到10％。
噴霧器配制品也可含有表面活性劑以減小或防止在形成氣溶膠時(shí)由溶液噴霧引起的蛋白質(zhì)的表面誘導(dǎo)型聚集。可使用各種常規(guī)表面活性劑，例如聚氧化乙烯脂肪酸酯和醇，和聚氧化乙烯脫水山梨醇脂肪酸酯。含量范圍一般在配制品重量的0.001％和4％之間變動。用于本發(fā)明目的的特別優(yōu)選的表面活性劑是聚氧化乙烯脫水山梨醇一油酸酯。
具體配制品和產(chǎn)生液體顆粒的合適分散體的方法在WO 9420069，US5915378，US 5960792，US 5957124，US 5934272，US 5915378，US 5855564，US 5826570，和US 5522385中描述，它們在本文中引用以供參考。
適合于本發(fā)明實(shí)踐的商業(yè)上可獲得的噴霧器的3個(gè)具體例子是由Mallinckrodt，Inc.，St.Louis，Mo.生產(chǎn)的Ultravent噴霧器，由Marquest MedicalProducts，Englewood，Colorado生產(chǎn)的Acorn II噴霧器，和由AradigmCorporation，Hayward，Califomia生產(chǎn)的AERx肺給藥系統(tǒng)。
用于標(biāo)明劑量的吸入器和粉末吸入器的干燥配制品用標(biāo)明劑量的吸入器裝置使用的干擾素配制品一般包含有關(guān)形狀，表面和大小的精細(xì)分開的粉末。該粉末可通過凍干且如果需要，隨后研磨固體配制品來生產(chǎn)，也可含有諸如人血清白蛋白(HSA)的穩(wěn)定劑。一般來說，加入超過0.5％(w/w)的HAS。另外，如果需要，可向制品中加入一種或多種糖或糖醇。其例子包括乳糖，麥芽糖，甘露糖，山梨醇，山梨糖，海藻糖，木糖醇，和木糖。加入配制品中的量從大約0.01到100％(w/w)之間變化，優(yōu)選從大約1到50％。然后凍干該配制品并研磨成所需顆粒大小。
然后借助于表面活性劑將合適大小的顆粒懸浮于推進(jìn)劑中。推進(jìn)劑可以是用于該目的任一常規(guī)物質(zhì)，例如含氯氟烴，氫氯氟烴(hydrochlorofluorocarbon)，氫氟烴(hydrofluorocarbon)，或碳?xì)浠衔铮ㄈ燃淄?，二氯二氟甲烷，二氯四氟乙醇，?，1，1，2-四氟乙烷，或其組合。合適的表面活性劑包括脫水山梨醇三油酸酯和大豆卵磷脂。油酸也可用作表面活性劑。然后將該混合物裝載進(jìn)給藥裝置中。適用于本發(fā)明的商業(yè)上可獲得的標(biāo)明劑量的吸入器的例子是由Glaxo Inc.，Research Triangle Park，N.C生產(chǎn)的Ventolin標(biāo)明劑量的吸入器。
用于粉末吸入器的該干擾素配制品包含含有偶聯(lián)物的精細(xì)分開的干燥粉末且也可包括膨脹劑，例如乳糖，山梨醇，蔗糖，或甘露醇，其含量有助于粉末從該裝置散布，例如占配制品重量的50％至90％。粉末的顆粒應(yīng)具有肺內(nèi)空氣動力學(xué)特性。一般相應(yīng)于具有不超過10微米中央直徑的大約1g/cm2密度的顆粒，優(yōu)選在0.5至5微米之間，最優(yōu)選在1.5至3.5微米之間。
根據(jù)本文的教導(dǎo)適用的粉末吸入器的一個(gè)例子是由Fisons Corp.，Bedford，Mass生產(chǎn)的Spinhaler粉末吸入器。
用于這些裝置的粉末可通過US 5997848，US 5993783，US 5985248，US 5976574，US 5922354，US 5785049和US 55654007中公開的方法產(chǎn)生和/或給藥。
用于本發(fā)明的分散體給藥的機(jī)械裝置含有干擾素多肽的藥用組合物可通過設(shè)計(jì)用于治療產(chǎn)品的肺給藥的各種機(jī)械裝置給藥，該裝置包括，但不限于噴霧器，標(biāo)明劑量的吸入器，和粉末吸入器，所有這些都是本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟悉的。
適用于本發(fā)明實(shí)踐的商業(yè)上可獲得的裝置的一些具體例子是由Mallinckrodt，Inc.，St.Louis，Missouri生產(chǎn)的Ultravent噴霧器；由MarquestMedical Products，Englewood，Colorado生產(chǎn)的Acorn II噴霧器；由Glaxo Inc.，Research Triangle Park，North Carolina生產(chǎn)的Ventolin標(biāo)明劑量的吸入器；由Fisons Corp.，Bedford，Massachusetts生產(chǎn)的Spinhaler粉末吸入器；InhaleTherapeutic Systems，Inc.，San Carlos，California的“靜止霧(standing cloud)”裝置；Alkermes，Cambridge，Massachusetts生產(chǎn)的AIR吸入器；和由AradigmCorporation，Hayward，Califomia生產(chǎn)的AERx肺給藥系統(tǒng)。
本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明組合物的主要產(chǎn)品容器。該容器可以是適合于所述組合物的任何類型的容器，例如由不銹鋼或玻璃制成的容器。該容器可以是注射器，例如預(yù)裝的注射器。
另外，本發(fā)明提供了用于腸胃外施用根據(jù)本發(fā)明的液體干擾素組合物的試劑盒和使用說明。該試劑盒可包含干擾素組合物作為唯一藥用活性成份，或者可包含在同一容器或不同容器中的一種或多種其它藥用活性成份。
在另一方面，本發(fā)明涉及增加配制成藥用組合物的干擾素多肽的穩(wěn)定性的方法，所述的方法包含在所述的組合物中摻入磺基烷基醚環(huán)糊精衍生物和一種緩沖劑。
當(dāng)干擾素多肽在貯存期間表現(xiàn)出聚集體形成且以足以減少干擾素多肽聚集體形成的量摻入磺基烷基醚環(huán)糊精衍生物時(shí)該方法特別適當(dāng)。該干擾素多肽優(yōu)選是本文所述的任一多肽?；腔榛循h(huán)糊精衍生物優(yōu)選是在US5,376,645，US 5,874,418或US 5,134,127中所述任一衍生物，特別是β環(huán)糊精磺基丁基醚的鹽，例如可作為Captisol獲得的鈉鹽。
在另一方面，本發(fā)明涉及對哺乳動物進(jìn)行干擾素治療的方法，該方法包含施用治療上有效量的根據(jù)本發(fā)明的組合物。另外，本發(fā)明涉及本發(fā)明的組合物在治療疾病中的用途以及涉及本發(fā)明的組合物在生產(chǎn)治療疾病的藥物中的用途。很明顯當(dāng)本發(fā)明的組合物用作治療疾病或紊亂的藥物時(shí)，它是一種藥用組合物。
本發(fā)明的藥用組合物可與其它治療劑結(jié)合給藥。這些治療劑可作為同一藥用組合物的一部分摻入或者可與該干擾素多肽同時(shí)或按照任何其它可接受的治療計(jì)劃分別給藥。另外，本發(fā)明的藥用組合物可用作其它療法的輔助。
應(yīng)明白可治療的疾病取決于組合物中存在的干擾素多肽的類型。
當(dāng)干擾素多肽是干擾素α，或干擾素β，或其變體或偶聯(lián)物時(shí)，本發(fā)明提供了用于治療大多數(shù)類型的病毒感染，癌癥或腫瘤或腫瘤血管形成，Chrohn′s疾病，潰瘍性結(jié)腸炎，Guillain-Barré綜合征，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，原發(fā)性肺纖維變性，異常細(xì)胞生長，或者用于任何合適的動物，優(yōu)選哺乳動物，且特別是人類的免疫調(diào)節(jié)的組合物和方法。例如，本發(fā)明的組合物可用于治療骨肉瘤，基層細(xì)胞癌，卵巢癌，頸發(fā)育異常，頸癌，喉乳頭瘤病，真菌類霉菌病，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，急性骨髓白血病，多發(fā)性骨髓瘤，何杰金氏病，黑素瘤，乳腺癌，非小細(xì)胞肺癌，惡性黑素瘤(輔藥，晚期，以及預(yù)防劑)，類癌瘤，B-細(xì)胞淋巴瘤，T-細(xì)胞淋巴瘤，濾泡性淋巴瘤，卡波西肉瘤，慢性骨髓性白血病，腎細(xì)胞癌，復(fù)發(fā)性表面膀胱癌，結(jié)腸直腸癌，多毛細(xì)胞白血病，和病毒性感染，例如乳頭瘤病毒，病毒性肝炎，生殖器皰疹，帶狀皰疹，皰疹性角膜炎，單純皰疹，病毒性腦炎，巨細(xì)胞病毒性肺炎，鼻病毒慢性頑固性肝炎，慢性病期HCV(I型)，慢性病期HCV(II型)和慢性乙肝。
在這一方面，該組合物可用于CML單一療法或與阿糖胞苷結(jié)合，用于B-細(xì)胞淋巴瘤單一療法或者與基于阿霉素的療法結(jié)合，用于濾泡性淋巴瘤療法作為CHOP-類療法的輔助，用于丙肝單一療法或與三氮唑核苷結(jié)合，用于多發(fā)性骨髓瘤單一療法或者與VBMCP，BCNU或VBMCP+HiCy結(jié)合，或者用于腎癌單一療法或者與長春花堿，氟尿苷，5-氟尿嘧啶或IL-10結(jié)合。
具體地說，本發(fā)明的多肽或組合物可用于多發(fā)性硬化(MS)的治療，例如公認(rèn)的4種類型的MS(良性，復(fù)發(fā)減輕型MS(RRMS)，原發(fā)型進(jìn)行性MS(PPMS)和繼發(fā)型進(jìn)行性MS(SPMS))中的任一種和用于單癥狀MS，癌癥或腫瘤，肝炎，例如乙肝和丙肝，或者皰疹感染的治療(后一種治療任選與IL-10治療結(jié)合)。
因此，本發(fā)明還涉及含有干擾素β多肽和磺基烷基醚環(huán)糊精衍生物的組合物在制備用于治療病毒感染，癌癥或腫瘤或腫瘤血管形成，Chrohn′s疾病，潰瘍性結(jié)腸炎，Guillain-Barré綜合征，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，原發(fā)性肺纖維變性，異常細(xì)胞生長，或者用于任何合適的動物，優(yōu)選哺乳動物，且特別是人類的免疫調(diào)節(jié)的藥物中的用途。更具體地說，含有干擾素β多肽和磺基烷基醚環(huán)糊精衍生物的本發(fā)明的組合物可用于治療骨肉瘤，基層細(xì)胞癌，卵巢癌，頸發(fā)育異常，頸癌，喉乳頭瘤病，真菌類霉菌病，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，急性骨髓白血病，多發(fā)性骨髓瘤，何杰金氏病，黑素瘤，乳腺癌，非小細(xì)胞肺癌，惡性黑素瘤(輔藥，晚期，以及預(yù)防劑)，類癌瘤，B-細(xì)胞淋巴瘤，T-細(xì)胞淋巴瘤，濾泡性淋巴瘤，卡波西肉瘤，慢性骨髓性白血病，腎細(xì)胞癌，復(fù)發(fā)性表面膀胱癌，結(jié)腸直腸癌，多毛細(xì)胞白血病，和病毒性感染，例如乳頭瘤病毒，病毒性肝炎，生殖器皰疹，帶狀皰疹，皰疹性角膜炎，單純皰疹，病毒性腦炎，巨細(xì)胞病毒性肺炎，鼻病毒慢性頑固性肝炎，慢性病期HCV(I型)，慢性病期HCV(II型)，慢性乙肝，慢性或急性丙肝，或皰疹感染，多發(fā)性硬化(MS)，例如公認(rèn)的4種類型的MS(良性，復(fù)發(fā)減輕型MS(RRMS)，原發(fā)進(jìn)行性MS(PPMS)和繼發(fā)進(jìn)行性MS(SPMS))中的任一種和用于單癥狀MS。
在一個(gè)具體方面，本發(fā)明涉及含有干擾素β多肽和磺基烷基醚環(huán)糊精衍生物的組合物在制備用于治療選自骨肉瘤，基層細(xì)胞癌，卵巢癌，頸發(fā)育異常，頸癌，喉乳頭瘤病，真菌類霉菌病，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，急性骨髓白血病，多發(fā)性骨髓瘤，何杰金氏病，黑素瘤，乳腺癌，非小細(xì)胞肺癌，惡性黑素瘤(輔藥，晚期，以及預(yù)防劑)，類癌瘤，B-細(xì)胞淋巴瘤，T-細(xì)胞淋巴瘤，濾泡性淋巴瘤，卡波西肉瘤，慢性骨髓性白血病，腎細(xì)胞癌，復(fù)發(fā)性表面膀胱癌，結(jié)腸直腸癌，和多毛細(xì)胞白血病中任一種的癌癥的藥物中的用途，其中干擾素β多肽相對于SEQ ID NO 1所示的野生型人干擾素β含有取代C17S+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T，且具有與3個(gè)N-糖基化位點(diǎn)連接的3個(gè)糖類半分子和具有大約20kDa分子量的1個(gè)PEG分子(該干擾素β多肽的一個(gè)具體例子是例如，用20kDa-PEG進(jìn)行PEG化的實(shí)施例3的干擾素β變體)。每一種上述癌癥認(rèn)為是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中該癌癥是黑素瘤。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，該癌癥是乳腺癌。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，該癌癥是非小細(xì)胞肺癌。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，該癌癥是惡性黑素瘤。
因此，本發(fā)明還涉及含有干擾素α多肽和磺基烷基醚環(huán)糊精衍生物的組合物在制備用于治療病毒感染，癌癥或腫瘤或腫瘤血管形成，Chrohn′s疾病，潰瘍性結(jié)腸炎，Guillain-Barré綜合征，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，原發(fā)性肺纖維變性，異常細(xì)胞生長，或者用于任何合適的動物，優(yōu)選哺乳動物，且特別是人類的免疫調(diào)節(jié)的藥物中的用途。更具體地說，含有干擾素α多肽和磺基烷基醚環(huán)糊精衍生物的本發(fā)明的組合物可用于治療骨肉瘤，基層細(xì)胞癌，卵巢癌，頸發(fā)育異常，頸癌，喉乳頭瘤病，真菌類霉菌病，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，急性骨髓白血病，多發(fā)性骨髓瘤，何杰金氏病，黑素瘤，乳腺癌，非小細(xì)胞肺癌，惡性黑素瘤(輔藥，晚期，以及預(yù)防劑)，類癌瘤，B-細(xì)胞淋巴瘤，T-細(xì)胞淋巴瘤，濾泡性淋巴瘤，卡波西肉瘤，慢性骨髓性白血病，腎細(xì)胞癌，復(fù)發(fā)性表面膀胱癌，結(jié)腸直腸癌，多毛細(xì)胞白血病，和病毒性感染，例如乳頭瘤病毒，病毒性肝炎，生殖器皰疹，帶狀皰疹，皰疹性角膜炎，單純皰疹，病毒性腦炎，巨細(xì)胞病毒性肺炎，鼻病毒慢性頑固性肝炎，慢性病期HCV(I型)，慢性病期HCV(II型)，慢性乙肝，慢性或急性丙肝，或皰疹感染，多發(fā)性硬化(MS)，例如公認(rèn)的4種類型的MS(良性，復(fù)發(fā)減輕型MS(RRMS)，原發(fā)進(jìn)行性MS(PPMS)和繼發(fā)進(jìn)行性MS(SPMS))中的任一種和用于單癥狀MS。
另外，當(dāng)該組合物含有干擾素β多肽時(shí)，本發(fā)明涉及一種治療哺乳動物的方法，該動物具有抗諸如AvonexTM或Rebif的干擾素β1a或者諸如Betaseron的1b的循環(huán)抗體，該方法包括施用含有與所述抗體的反應(yīng)減小或不反應(yīng)的干擾素β多肽的本發(fā)明的組合物。該化合物以有效量給藥。該哺乳動物優(yōu)選是人類。需要治療的哺乳動物可患有干擾素β是有用的治療劑的上文所列的任一疾病。具體地說，本發(fā)明的該方面對于治療多發(fā)性硬化(上文所列的任一類型)，肝炎或癌癥是有利的。術(shù)語“循環(huán)抗體”試圖表示在哺乳動物中與用任一商業(yè)上可獲得的干擾素β制品(Rebif，Betaseron，Avonex)治療發(fā)生反應(yīng)形成的抗體，特別是中和抗體。
當(dāng)干擾素多肽是干擾素γ或其變體或偶聯(lián)物時(shí)，本發(fā)明的組合物可用于治療WO01/36001中描述的任一醫(yī)學(xué)適應(yīng)征，特別是間質(zhì)肺疾病，最具體地說是原發(fā)性肺纖維變性。已有建議將干擾素γ用于治療間質(zhì)肺疾病(也稱為間質(zhì)肺纖維變性(IPF))(Ziesche等(N.Engl.J.Med.3411264-1269，1999和Chest110Suppl25S，1996)和EP 795332)，為了該目的，干擾素γ可與強(qiáng)的松龍結(jié)合使用。除了IPF外，肉芽腫疾病(Bolinger等，Clinical Pharmacy，1992，11834-850)，某些分枝桿菌感染(N.Engl.J.Med.3301348-1355，1994)，腎癌(J.Urol.152841-845，1994)，骨硬化病(N.Engl.J.Med.3321594-1599，1995)，硬皮病(J.Rheumatol.23654-658，1996)，乙肝(Hepatogastroenterology 452282-2294，1998)，丙肝(Int.Hepatol.Communic.6264-273，1997)，膿毒性休克(Nature Medicine 3678-681，1997)，和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎可用干擾素γ治療。
因此，本發(fā)明還涉及含有干擾素γ多肽和磺基烷基醚環(huán)糊精衍生物的組合物在制備用于治療間質(zhì)肺疾病，最具體地說是原發(fā)性肺纖維變性，間質(zhì)肺疾病(也稱為間質(zhì)肺纖維變性(IPF))，肉芽腫疾病，分枝桿菌感染，腎癌，骨硬化病，硬皮病，乙肝，丙肝，膿毒性休克，和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物中的用途。
實(shí)施例制備干擾素γ的材料和方法材料CHO-K1細(xì)胞(可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心獲得(ATCC#CCL-61))。
HeLa細(xì)胞(可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心獲得(ATCC#CCL-2))。
ISRE-Luc從Stratagene，La Jolla USA獲得。
pCDNA 3.1/hygro從Invitrogen，Carlsbad USA獲得。
限制性酶和聚合酶可從New England Biolabs Inc.，Beverly，USA獲得。
DMEM培養(yǎng)基Dulbecco′s改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)，10％胎牛血清和潮霉素B可從Life Technologies A/S，Copenhagen，Denmark獲得。
LucLite底物可從Packard Bioscience，Groningen，The Netherlands獲得。
TopCount發(fā)光計(jì)可從Packard Bioscience，Groningen，The Netherlands獲得。
生物素標(biāo)記的多克隆抗人干擾素γ抗體BAF285可從R & D Systems Inc.，Minneapolis，USA獲得。
辣根過氧化物酶結(jié)合的鏈霉抗生物素蛋白P0397可從DAKO，Copenhagen，Denmark獲得。
TMB印跡試劑可從KEM-EN-TEC，Copenhagen，Denmark獲得。
方法干擾素測定法概要以前已經(jīng)公開了干擾素γ與HeLa細(xì)胞上的干擾素γ受體相互作用并激活該受體。因而，在含有干擾素刺激反應(yīng)元件(ISRE)的啟動子上可激活轉(zhuǎn)錄。因此通過使用放置于HeLa細(xì)胞中的偶聯(lián)螢光素酶報(bào)道基因的ISRE(ISRE-luc)來篩選干擾素受體的激動劑是可能的。
一級測定法用ISRE-Luc和pCDNA 3.1/hygro共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，通過在含有潮霉素B的DMEM培養(yǎng)基中選擇可產(chǎn)生轉(zhuǎn)化灶(細(xì)胞克隆)。在存在或不存在干擾素γ的條件下篩選細(xì)胞克隆的螢光素酶活性。表現(xiàn)出刺激與未刺激的螢光素酶活性的最高比率的那些克隆用于進(jìn)一步的試驗(yàn)。
為了篩選多肽，在96孔培養(yǎng)平板中接種15,000個(gè)細(xì)胞/孔并在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。第二天以各種濃度向細(xì)胞中加入多肽和已知標(biāo)準(zhǔn)。平板在37℃下在5％CO2的空氣中培養(yǎng)6小時(shí)，隨后向各孔中加入LucLite底物(Packard Bioscience，Groningen，The Netherlands)。密封平板并在TopCount發(fā)光計(jì)(Packard)上以SPC(單光子計(jì)數(shù))方式測量發(fā)光。
每個(gè)平板含有用干擾素γ培養(yǎng)的孔作為刺激對照，含有正常培養(yǎng)基的其它孔作為未刺激對照。刺激的和未刺激的螢光素酶活性之間的比率用作干擾素γ活性和實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)間誤差的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。
鑒定表面暴露的氨基酸殘基結(jié)構(gòu)通過X-射線晶體學(xué)測定的人干擾素γ的實(shí)驗(yàn)三維結(jié)構(gòu)已由Ealick等，Science 252698-702(1991)報(bào)導(dǎo)，他們報(bào)導(dǎo)了干擾素γ同型二聚體的C-α痕跡。Walter等，Nature 376230-235(1995)報(bào)導(dǎo)了與兩分子的干擾素γ受體可溶形式復(fù)合的干擾素γ同型二聚體的結(jié)構(gòu)。然而，該結(jié)構(gòu)的坐標(biāo)不能公開獲得。Thiel等，Structure 8927-936(2000)報(bào)導(dǎo)與兩分子的干擾素γ受體可溶形式復(fù)合的干擾素γ同型二聚體的結(jié)構(gòu)具有在結(jié)構(gòu)上不與干擾素γ同型二聚體發(fā)生相互作用的第三個(gè)受體分子。
可及表面面積(ASA)使用計(jì)算機(jī)程序Access(B.Lee和F.M.Richards，J.Mol.Biol.55379-400(1971))版本2(Copyright(c)1983 Yale University)計(jì)算各原子在結(jié)構(gòu)中的可及表面面積(ASA)。該方法一般使用1.4大小的探針并將可及表面面積(ASA)定義為探針中央形成的面積。計(jì)算前，從坐標(biāo)組(coordinate set)中去掉所有水分子，氫原子和與該蛋白質(zhì)不直接相關(guān)的其它原子。
側(cè)鏈的部分ASA通過用代表延伸的ALA-x-ALA三肽中該殘基類型側(cè)鏈原子ASA的值除以該側(cè)鏈中原子ASA的總和來計(jì)算側(cè)鏈原子的部分ASA。參見Hubbard，Campbell & Thomton(1991)J.Mol.Biol.220，507-530。例如，CA原子認(rèn)為是甘氨酸殘基而不是剩下殘基的側(cè)鏈部分。下表用作側(cè)鏈的標(biāo)準(zhǔn)100％ASAAla 69.232Leu 140.762Arg 200.352Lys 162.502Asn 106.252Met 156.082Asp 102.062Phe 163.902Cys 96.692Pro 119.652Gln 140.582Ser 78.162Glu 134.612Thr 101.672Gly 32.282Trp 210.892His 147.002Tyr 176.612Ile 137.912Val 114.142在結(jié)構(gòu)中未檢測的殘基定義為具有100％暴露，因?yàn)檎J(rèn)為它們存在于彈性區(qū)中。
測定原子間的距離使用分子制圖軟件，例InsightII v.98.0，MSI INC測定原子間的距離。
測定受體結(jié)合位點(diǎn)受體結(jié)合位點(diǎn)定義為包含受體結(jié)合時(shí)其可及表面面積改變的所有殘基。它可通過至少兩種ASA算法測定；一種針對配體/受體復(fù)合物中的分離配體，一種針對完整配體/受體復(fù)合物。
實(shí)施例A-測定表面暴露的氨基酸使用的X-射線結(jié)構(gòu)屬于Thiel等，Structure 8927-936(2000)報(bào)導(dǎo)的具有在結(jié)構(gòu)上不與干擾素γ同型二聚體發(fā)生相互作用的第三個(gè)干擾素γ受體分子的與兩分子的干擾素γ受體可溶形式復(fù)合的干擾素γ同型二聚體。該結(jié)構(gòu)由干擾素γ同型二聚體組成，其中兩個(gè)分子標(biāo)記為A和B。為了構(gòu)建目的，在干擾素γ序列前存在標(biāo)記為M0的另一甲硫氨酸且該序列在C-末端截短10個(gè)殘基(在構(gòu)建的多肽中Q133是最后一個(gè)殘基)。在該實(shí)施例的所有計(jì)算結(jié)果中從結(jié)構(gòu)中去掉M0。兩個(gè)干擾素γ單體的結(jié)構(gòu)在殘基120之后具有極弱的電子密度且直到殘基T126的殘基僅僅是模型。因此，在本實(shí)施例中計(jì)算前從結(jié)構(gòu)中去掉殘基S121-T126。標(biāo)記為C和D的兩個(gè)受體片斷與干擾素γ同型二聚體發(fā)生直接相互作用而標(biāo)記為E的第三個(gè)受體分子與干擾素γ同型二聚體不發(fā)生接觸且不包括在這些計(jì)算結(jié)果中。
表面暴露對兩個(gè)分子中不包括M0和S121-T126的分子A和B的同型二聚體進(jìn)行部分ASA計(jì)算得出下列殘基具有超過25％的其側(cè)鏈暴露于至少一個(gè)單體的表面Q1，D2，P3，K6，E9，N10，K12，K13，Y14，N16，G18，H19，S20，D21，A23，D24，N25，G26，T27，G31，K34，N35，K37，E38，E39，S40，K55，K58，N59，K61，D62，D63，Q64，S65，Q67，K68，E71，T72，K74，E75，N78，V79，K80，N83，S84，N85，K86，K87，D90，E93，K94，N97，S99，T101，D102，L103，N104，H111，Q115，A118和E119。
下列殘基具有超過50％的其側(cè)鏈暴露于至少一個(gè)單體的表面Q1，D2，P3，K6，E9，N10，K13，N16，G18，H19，S20，D21，A23，D24，N25，G26，T27，G31，K34，K37，E38，E39，K55，K58，N59，D62，Q64，S65，K68，E71，E75，N83，S84，K86，K87，K94，N97，S99，T101，D102，L103，N104，Q115，A118，E119。
對兩個(gè)分子中不包括M0和S121-T126且包括受體分子C和D的分子A和B的同型二聚體進(jìn)行部分ASA計(jì)算得出下列殘基具有超過25％的其側(cè)鏈暴露于至少一個(gè)單體的表面Q1，D2，P3，K6，E9，N10，K13，Y14，N16，G18，H19，D21，N25，G26，G31，K34，N35，K37，E38，E39，S40，K55，K58，N59，K61，D62，D63，Q64，S65，Q67，K68，E71，T72，K74，E75，N78，V79，K80，N83，S84，N85，K86，K87，D90，E93，K94，N97，S99，T101，D102，L103，N104，E119。
下列殘基具有超過50％的其側(cè)鏈暴露于至少一個(gè)單體的表面P3，K6，N10，K13，N16，D21，N25，G26，G31，K34，K37，E38，E39，K55，K58，N59，D62，Q64，S65，K68，E71，E75，N83，S84，K86，K87，K94，N97，S99，T101，D102，L103和N104。
比較兩次列出的結(jié)果，得出受體結(jié)合時(shí)從超過25％的側(cè)鏈ASA列出結(jié)果中去掉了K12，S20，A23，D24，T27，H111，Q115和A118，且受體結(jié)合時(shí)從超過50％的側(cè)鏈ASA列出結(jié)果中去掉了Q1，D2，E9，G18，H19，S20，A23，D24，T27，Q115，A118和E119。
在該結(jié)構(gòu)中未測定的殘基按表面完全暴露處理，即殘基S121，P122，A123，A124，K125，T126，G127，K128，R129，K130，R131，S132，Q133，M134，L135，F(xiàn)136，R137，G138，R139，R140，A141，S142，Q143。這些殘基也構(gòu)成用于導(dǎo)入連接基團(tuán)的獨(dú)立靶(或者可認(rèn)為屬于表面暴露的氨基酸殘基的基團(tuán)，例如，具有超過25％或超過50％暴露的側(cè)鏈)。
實(shí)施例B-測定受體結(jié)合位點(diǎn)按上述進(jìn)行ASA計(jì)算得出干擾素γ多肽的下列殘基以對分離的二聚體的計(jì)算結(jié)果相比在復(fù)合物的至少一個(gè)單體中具有降低的ASAQ1，D2，Y4，V5，E9，K12，G18，H19，S20，D21，V22，A23，D24，N25，G26，T27，L30，K34，K37，K108，H111，E112，I114，Q115，A118，E119。
實(shí)施例C-設(shè)計(jì)用于表達(dá)干擾素γ的具有優(yōu)化用于CHO細(xì)胞的密碼子選擇的表達(dá)序列盒修飾包含編碼具有其天然信號肽的成熟人干擾素γ的全長cDNA的DNA序列，即GenBank登錄號X13274以便有利于在CHO細(xì)胞中高度表達(dá)。通過形成在密碼子選擇上偏向于人類常用的密碼子來修飾人干擾素γ核苷酸序列的密碼子。隨后，用其它核苷酸取代在該序列中的某些核苷酸以便導(dǎo)入DNA限制性核酸內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)。設(shè)計(jì)引物以便合成該基因。
使用Platinum Pfx-聚合酶試劑盒(Life Technologies)和標(biāo)準(zhǔn)三步PCR循環(huán)參數(shù)通過一步PCR將引物裝配成合成基因。使用相同的條件通過PCR擴(kuò)增該裝配的基因且該基因具有SEQ ID NO5所示的序列。將合成基因克隆進(jìn)pcDNA3.1/hygro(InVitrogen)5’端的BamHI和3’端的XbaI之間，產(chǎn)生pIGY-22。
實(shí)施例D-定點(diǎn)誘變產(chǎn)生糖基化變體為了在干擾素γ中導(dǎo)入突變，以這樣的方式設(shè)計(jì)寡核苷酸，即PCR-產(chǎn)生的改變可通過傳統(tǒng)兩步PCR導(dǎo)入表達(dá)質(zhì)粒(pIGY-22)中。
使用兩個(gè)載體引物以及特異性突變引物ADJ0135′-GATGGCTGGCAACTAGAAG-3′(SEQ ID NO6)，(反義下游載體引物)和ADJ0145′-TGTACGGTGGGAGGTCTAT-3′(SEQ ID NO7)，(有義上游載體引物)。
使用ADJ013和ADJ014作為載體引物，ADJ093(5′-GTTCAGGTCTGTCACGGTGTAATTGGTCAGCTT-3′)(SEQ ID NO8)，和ADJ094(5′-AAGCTGACCAATTACACCGT GACAGACCTGAAC-3′)(SEQID NO9)作為突變引物，和pIGY-22作為模板通過傳統(tǒng)兩步PCR產(chǎn)生S99T變體。使用BamHI和XbaI將447 bp PCR產(chǎn)物亞克隆進(jìn)pcDNA3.1/Hygro(InVitrogen)，產(chǎn)生質(zhì)粒pIGY-48。
通過使用Lipofectaim2000(Life Technologies)作為轉(zhuǎn)染劑將pIGY-48轉(zhuǎn)染進(jìn)CHO K1細(xì)胞。24小時(shí)后收獲培養(yǎng)基并測定干擾素γ活性。使用本文所述的一級測定法，獲得了如下活性5.1×106AU/ml。
使用ADJ013和ADJ014作為載體引物，ADJ091(5′-CATGATCTTCCGATCGGTCTCGTTCTTCCAATT-3′)(SEQ ID NO10)，和ADJ092(5′-AATTGGAAGAACGAGACCGATCGG AAGATCATG-3′)(SEQID NO11)，作為突變引物，且pIGY-48作為模板通過傳統(tǒng)兩步PCR產(chǎn)生E38N+S40T+S99T變體。使用BamHI和xbaI將447 bp PCR產(chǎn)物亞克隆進(jìn)pcDNA3.1/Hygro(InVitrogen)，產(chǎn)生質(zhì)粒pIGY-54。
通過使用Lipofectaim2000(Life Technologies)作為轉(zhuǎn)染劑將pIGY-54轉(zhuǎn)染進(jìn)CHO K1細(xì)胞。24小時(shí)后收獲培養(yǎng)基并測定干擾素γ活性。使用本文所述的一級測定法，獲得了1.3×107AU/ml的活性。
使用上述相似的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，制備了許多全長干擾素γ糖基化變體。
產(chǎn)生C-末端截短的干擾素γ變體使用pIGY-22，pIGY-48和pIGY-54作模板通過一步PCR產(chǎn)生在緊靠Leu135密碼子的下游含有一個(gè)終止密碼子的C-末端截短的干擾素γ變體，接著使用BamHI和xbaI將PCR產(chǎn)物亞克隆進(jìn)pcDNA3.1/Hygro(InVitrogen)。用于構(gòu)建這些變體的引物是ADJ014(見上文，上游)和5′GAGTCTAGATTACAGC ATCTGGCTTCTCTT-3′(下游)。所得質(zhì)粒稱為pIGY-72(Leu135后截短的野生型干擾素γ)，pIGY-73(Leu135后截短的S99T變體)和pIGY-74(Leu135后截短的E38N+S40T+S99T)。
產(chǎn)生含有半胱氨酸的干擾素γ變體使用Stratagene′s QuikChangeTMXL定點(diǎn)誘變試劑盒，按照廠商說明書產(chǎn)生含有半胱氨酸殘基的干擾素γ變體。使用pIGY-48作模板產(chǎn)生各含有一個(gè)導(dǎo)入的半胱氨酸的7個(gè)干擾素γ變體N10C+S99T，N16C+S99T，E38C+S99T，N59C+S99T，N83C+S99T，K94C+S99T和S99T+N104C。同樣，使用pIGY-54作模板產(chǎn)生各含有一個(gè)導(dǎo)入的半胱氨酸的6個(gè)干擾素γ變體N10C+E38N+S40T+S99T，N16C+E38N+S40T+S99T，E38N+S40T+N59C+S99T，E38N+S40T+N83C+S99T，E38N+S40T+K94C+S99T和E38N+S40T+S99T+N104C。
實(shí)施例E-PEG化含有半胱氨酸的變體所有緩沖液在使用前去氧化。蛋白質(zhì)濃度通過測量A280估計(jì)。
使用OPSS偶聯(lián)化學(xué)劑進(jìn)行PEG化7.2ml在5mM琥珀酸鈉，4％甘露醇，0.01％Tween 20，pH6.0中的1.3mg/ml的干擾素γ變體N16C+S99T(全長)通過用300μl 0.5M DTT室溫下溫育30分鐘進(jìn)行還原。通過將2.5ml的3個(gè)等分試樣在NAP25凝膠過濾柱(Pharmacia)上在緩沖液A(50mM磷酸鈉，1mM EDTA，pH8.1)中過柱對干擾素γ變體脫鹽。每個(gè)等分試樣在3.5ml中洗脫。
將mPEG-OPSS(10KDa)溶于緩沖液A中達(dá)到2mg/ml的濃度并以等體積加入還原且脫鹽的干擾素γ變體中并在室溫下輕輕搖動溫育60分鐘。
使用Vivaspin20柱(VivaScience)將11ml的反應(yīng)混合物濃縮到1-6ml并使用以緩沖液A平衡的Sephacryl S-100柱(Pharmacia)通過凝膠過濾去掉剩余的mPEG。
使用Vivaspin 6柱(VivaScience)將PEG化的干擾素γ變體滲濾進(jìn)5mM琥珀酸鈉，4％甘露醇，pH6.0中并加入Tween 20至0.01％。純化的PEG化的干擾素γ變體在本文所述的一級測定法中測量為具有1.3×106AU/mg的比活(相應(yīng)的未PEG化的干擾素γ變體比活的15％)。
使用MAL偶聯(lián)化學(xué)劑進(jìn)行PEG化1.6ml在5mM琥珀酸鈉，4％甘露醇，0.01％Tween 20，pH6.0中的1.5mg/ml的干擾素γ變體N59C+S99T(全長)通過用64μl 0.5M DTT室溫下溫育30分鐘進(jìn)行還原。在NAP25凝膠過濾柱(Pharmacia)上在緩沖液A(50mM磷酸鈉，1mM EDTA，pH8.1)中對干擾素γ變體脫鹽。干擾素γ變體在3.5ml中洗脫。
將mPEG-MAL(5kDa)溶于緩沖液A中達(dá)到0.5mg/ml的濃度并以等體積加入還原且脫鹽的干擾素γ變體中并在室溫下輕輕搖動溫育120分鐘。
加入硫酸銨至0.9M的濃度且對PEG化的干擾素γ變體使用在緩沖液B(20mM磷酸鈉，0.9M硫酸銨，pH6.6)中平衡的1ml ResourceTM苯基柱(Pharmacia)。在30倍柱體積中以從0至50％緩沖液C(20mM磷酸鈉，pH6.6)的線型梯度洗脫結(jié)合的PEG化干擾素γ變體之前用5倍柱體積的緩沖液B洗滌柱子。PEG化的干擾素γ變體在大約0.6M硫酸銨處洗脫。
合并含有PEG化的干擾素γ變體的餾分并使用Vivaspin 6柱(VivaScience)滲濾進(jìn)5mM琥珀酸鈉，4％甘露醇，pH6.0中并加入Tween 20至0.01％。純化的PEG化的干擾素γ變體在本文所述的一級測定法中測量為具有2.4×106AU/mg的比活(相應(yīng)的未PEG化的干擾素γ變體比活的15％)。
實(shí)施例F在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)干擾素γ多肽為了瞬時(shí)表達(dá)干擾素γ，將細(xì)胞在含有1∶10胎牛血清(BioWhittakerCat#02-701F)和1∶100青霉素和鏈霉素(BioWhittaker Cat#17-602E)的培養(yǎng)基(Dulbecco′s MEM/Nut.-mix F-12(Ham)L-谷酰胺，15mM Hepes，吡哆醇-HCl(Life Technologies Cat#31330-038))中生長至95％匯合。使用Lipofectamine2000(Life Technologies)按照廠商說明書將編碼干擾素γ的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，收集培養(yǎng)基并測定干擾素γ活性。另外，為了定量利用的糖基化位點(diǎn)的相對數(shù)，使用收獲的培養(yǎng)基進(jìn)行Western印跡。
通過用編碼干擾素γ的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO K1細(xì)胞接著在含有0.36mg/ml潮霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)該細(xì)胞產(chǎn)生表達(dá)干擾素γ的穩(wěn)定克隆。分離穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞并通過有限稀釋亞克隆。通過ELISA鑒定產(chǎn)生高水平干擾素γ的克隆。
實(shí)施例G-大規(guī)模生產(chǎn)表達(dá)干擾素γ或變體的穩(wěn)定細(xì)胞系在1700cm2搖瓶(Coming，#431200)中的Dulbecco′s MEM/Nut.-mix F-12(Ham)L-谷酰胺，15mM Hepes，吡哆醇-HCl(Life Technologies Cat#31330-038)，1∶10胎牛血清(BioWhittaker Cat#02-701F)，1∶100青霉素和鏈霉素(BioWhittaker Cat#17-602E)中生長至匯合。然后將培養(yǎng)基更換成含有L-谷酰胺(BioWhittaker Cat #12-724Q)并加入了1∶500 EX-CYTE VLE(Serological Proteins Inc.#81-129)和1∶100青霉素和鏈霉素(BioWhittaker Cat #17-602E)的300ml UltraCHO。生長48小時(shí)后，用含有相同添加物的新鮮UltraCHO更換培養(yǎng)基。再生長48小時(shí)后，用加入了1∶100 ITS-A(Gibco/BRL#51300-044)，1∶500 EX-CYTE VLE(SerologicalProteins Inc.#81-129)和1∶100青霉素和鏈霉素(BioWhittaker Cat#17-602E)的Dulbecco′s MEM/Nut.-mix F-12(Ham)L-谷酰胺，吡哆醇-HCl(LifeTechnologies Cat#21041-025)更換培養(yǎng)基。隨后，每隔24小時(shí)，收獲培養(yǎng)基并用含有相同添加物的300ml無血清培養(yǎng)基更換。收集的培養(yǎng)基通過0.22μm濾器過濾以去掉細(xì)胞。
實(shí)施例H-純化使用Millipore TFF系統(tǒng)超濾至大約1/15體積前微孔過濾(0.22μm)濾液。在同一系統(tǒng)中使用10mM Tris，pH7.6滲濾該濃縮物。加入硫酸銨至1.7M的濃度，攪拌后使用GS3轉(zhuǎn)子在Sorvall離心機(jī)中以8000rpm離心25分鐘去掉沉淀。
將上清上樣到預(yù)先在10mM Tris，1.7M硫酸銨，pH7.6中平衡的25mlPhenyl High Performance(Pharmacia)柱上。上樣后用3倍柱體積的10mM Tris，1.7M硫酸銨，pH7.6洗滌柱子，然后以在10倍柱體積內(nèi)達(dá)到100％10mMTris，pH7.6的線形梯度洗脫結(jié)合的干擾素γ變體。分級分離流出物以及洗脫的干擾素γ變體。合并富含干擾素γ變體的餾分并使用分子量截?cái)嘀禐?0,000Da的Vivaflow200系統(tǒng)(VivaScience)通過滲濾進(jìn)10mM Tris，pH9.0中更換緩沖液。
然后將干擾素γ變體上樣到預(yù)先在10mM Tris，pH9.0中平衡的18mlQ-sepharose Fast Flow(Pharmacia)柱上。上樣后在15倍柱體積內(nèi)以從0-100％的10mM Tris，0.5M NaCl，pH9.0的梯度洗脫結(jié)合的干擾素γ變體之前用3倍柱體積的10mM Tris，pH9.0洗滌柱子。分級分離流出物以及洗脫的干擾素γ變體。合并富含干擾素γ變體的餾分并使用分子量截?cái)嘀禐?0,000Da的Vivaspin20(VivaScience)柱通過滲濾將緩沖液更換成10mM磷酸鈉，pH7.0。
然后，將干擾素γ變體上樣到在10mM磷酸鈉，pH7.0中預(yù)先平衡的8ml CHT陶瓷羥基磷灰石柱(Biorad)上。上樣后在30倍柱體積內(nèi)以從0-60％500mM磷酸鈉，pH7.0的梯度洗脫結(jié)合的干擾素γ變體之前用5倍柱體積的10mM磷酸鈉，pH7.0洗滌柱子。分級分離流出物以及洗脫的干擾素γ變體。合并富含干擾素γ變體的餾分并使用Vivaspin20柱(VivaScience)將緩沖液更換成5mM琥珀酸鈉，4％甘露醇，pH6.0并隨后加入Tween 20至0.01％的濃度。無菌過濾干擾素γ變體并貯存在-80℃。
另外，干擾素γ變體可按照下面的純化方案進(jìn)行純化使用Millipore TFF系統(tǒng)超濾至大約1/15體積前微孔過濾(0.22μm)濾液。在同一系統(tǒng)中使用10mM Tris，pH7.6滲濾該濃縮物，之后將pH調(diào)到9.0并通過微孔過濾去掉沉淀。
將該樣品上樣到在10mM Tris，pH9.0中預(yù)先平衡的Q-sepharose FastFlow(Pharmacia)柱上。上樣后在15倍柱體積內(nèi)以從0-100％的10mM Tris，0.5M NaCl，pH9.0的梯度洗脫結(jié)合的干擾素γ變體之前用3倍柱體積的10mM Tris，pH9.0洗滌柱子。分級分離流出物以及洗脫的干擾素γ變體。合并富含干擾素γ變體的餾分，并將pH調(diào)節(jié)到7.6。加入硫酸銨至1.5M且在攪拌后通過離心去掉沉淀。
然后將干擾素γ變體上樣到預(yù)先在10mM Tris，1.5M硫酸銨，pH7.6中平衡的苯基瓊脂糖高效柱(Pharmacia)上。
上樣后用3倍柱體積的10mM Tris，1.5M硫酸銨，pH7.6洗滌柱子，然后以在10倍柱體積內(nèi)達(dá)到100％10mM Tris，pH7.6的線形梯度洗脫結(jié)合的干擾素γ變體。分級分離流出物以及洗脫的干擾素γ變體。合并富含干擾素γ變體的餾分并將硫酸銨調(diào)節(jié)到1.7M。
然后將干擾素γ變體上樣到在10mM磷酸鈉，1.7M硫酸銨，pH7.6中預(yù)先平衡的丁基瓊脂糖柱上。上樣后在使用10mM磷酸鈉，pH6.5的一個(gè)步驟中洗脫結(jié)合的干擾素γ變體之前用10mM磷酸鈉，1.7M硫酸銨，pH7.6洗滌柱子。分級分離流出物以及洗脫的干擾素γ變體。
然后合并富含干擾素γ變體的餾分并上樣到在10mM磷酸鈉，pH6.5中預(yù)先平衡的羥基磷灰石柱上。上樣后在30倍柱體積內(nèi)以從0-100％500mM磷酸鈉，pH6.5的線形梯度洗脫結(jié)合的干擾素γ變體之前用5倍柱體積的10mM磷酸鈉，pH6.5洗滌柱子。分級分離流出物以及洗脫的干擾素γ變體。
合并含有干擾素γ變體的餾分并將緩沖液更換成含有5mM琥珀酸鈉，4％甘露醇，pH6.0的緩沖液。隨后加入Tween 20至0.01％的濃度。無菌過濾干擾素γ變體并貯存在-80℃。
干擾素多肽的配制品實(shí)施例1干擾素β(IFN-/3)變體Q49N+Q51T+F111N+R113T的配制品該變體按WO01/15736的實(shí)施例7和8所述構(gòu)建和表達(dá)并用如下的兩步法純化離心從搖瓶收獲的培養(yǎng)基且通過0.22um濾膜(PVDF)過濾。過濾的培養(yǎng)基在裝備有截留值為10000的聚醚砜(PES)膜的Vivaflow 200系統(tǒng)上滲濾且上樣到用50mM醋酸鈉，50mM氯化鈉，pH5.5平衡的S-Sepharose柱(Pharmacia)上。結(jié)合到柱子上的干擾素變體用50mM醋酸鈉，0.5M氯化鈉，pH5.5洗脫。將S-Sepharose柱的洗脫物中的氯化鈉濃度調(diào)節(jié)到1.0M并將樣品上樣到用50mM醋酸鈉，1.0M氯化鈉，pH5.5平衡的苯基-瓊脂糖高效柱(Pharmacia)上。上樣后用Milli Q水洗滌柱子。干擾素β變體用從Milli Q水到60％乙二醇，50mM醋酸鈉，pH5.5的梯度以30倍柱體積洗脫。收集含有完全糖基化的干擾素β變體的餾分。在裝備有截留值為10000的PES膜的Vivaspin 20ml濃縮器中將制品中的緩沖液更換成50mM磷酸鈉，pH7.0。
將純化的IFN-β變體配制成含有在50mM磷酸鈉緩沖液(最后調(diào)節(jié)到pH7.0)中起始濃度為10MIU/ml的變體且含有35mg/ml甘露醇以及2mg/mlTween 80的組合物。一種組合物(組合物A)不添加Captisol(可從CyDex Inc.獲得)。另一組合物(組合物B)含有10mg/ml Captisol。
組合物以50μl的等分試樣在0.5ml Eppendorf管中(不用氮或氬凈化)分別在-80℃和35℃下貯存18天。使用WO01/15736中所述的抗病毒試驗(yàn)測量抗病毒活性。
結(jié)果表示為“在35℃下貯存的樣品的平均百分活性，作為在-80℃下貯存的樣品的活性的函數(shù)(在同一天分析)”。
貯存天數(shù) “在35℃與-80℃下的活性％”組合物A B10 2414418 2778實(shí)施例2含有IFN-β變體Q49N+Q51T+F111+R113T的配制品的差示掃描量熱法通過差示掃描量熱法(DSC)分析實(shí)施例1的蛋白質(zhì)的樣品以研究蛋白質(zhì)的解折疊(或變性)且特別是測定在每次操作中蛋白質(zhì)的解折疊溫度(Tm)。
用于DSC分析的起始材料是在50mM乙酸鈉緩沖液中的蛋白質(zhì)溶液(最后調(diào)節(jié)到pH5.5)。以加入各種賦形劑產(chǎn)生0.4mg/mL的最終蛋白質(zhì)濃度制備了一系列的溶液。使用注射水作為DSC的空白，因?yàn)榻裹c(diǎn)僅是測定Tm值的變化。在進(jìn)行DSC分析之前，按MicroCal Inc.所述通過使用真空足夠的時(shí)間給所有溶液除氣。
通過使用MicroCal Inc的DSC裝置(VP-DSC型)評估該蛋白質(zhì)的行為。所述溶液的溫度以每分鐘1.5℃的速率從環(huán)境溫度(25℃)逐漸增加到大約120℃。隨著溫度的增加發(fā)生兩次事件。第一次事件是解折疊反應(yīng)(吸熱)，且在掃描中觀察到向上的峰值。第二次事件為沉淀(放熱反應(yīng))，且在掃描中觀察到向下的峰值。
向起始溶液中加入2.4mg/ml的Tween 80；5mg/ml氯化鈉或40mg/mlCaptisol導(dǎo)致ΔTm的Tm-值變化，分別為-0.7；+1.2或+7.2℃。其中ΔTm定義為ΔTm＝(Tm2-Tm1)其中“Tm1”涉及不加入其它賦形劑的起始溶液的DSC掃描且“Tm2”涉及加入了2.4mg/ml Tween 80；5mg/ml氯化鈉或40mg/ml Captisol的溶液的分別DSC掃描。
這些數(shù)據(jù)清楚地證明加入Captisol穩(wěn)定溶液中的蛋白質(zhì)；從而支持了實(shí)施例3[C17S+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T]IFN-β糖基化變體的生產(chǎn)，純化和PEG化將產(chǎn)生[C17S+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T]IFN-β糖基化變體的一個(gè)CHO K1亞克隆(5/G-10)接種進(jìn)6個(gè)搖瓶的200ml補(bǔ)充了10％FBS和青霉素/鏈霉素(P/S)的DMEM/F-12培養(yǎng)基(LifeTechnologies；Cat.#31330)中，每個(gè)搖瓶具有1700cm2的展開表面(Coming，USA)。2天后更換培養(yǎng)基。再過2天后兩個(gè)搖瓶接近100％匯合，將培養(yǎng)基更換成補(bǔ)充了1/500 EX-CYTE(Serologicals Proteins；Cat.#81129N)和P/S的300ml無血清UltraCHO培養(yǎng)基(BioWhittaker；Cat.#12-724)。細(xì)胞在該培養(yǎng)基中的生長促進(jìn)細(xì)胞量的提高，比在含血清的培養(yǎng)基中可達(dá)到的量更高。2天后更新培養(yǎng)基。再過2天后，將培養(yǎng)基更換成生產(chǎn)培養(yǎng)基補(bǔ)充了1/100 ITSA(Life Technologies；Cat.#51300-044)[ITSA表示用于貼壁培養(yǎng)物的胰島素(1.0g/L)-運(yùn)鐵蛋白(0.55g/L)-硒(0.67mg/L)添加物]，1/500 EC-CYTE和P/S的DMEM/F-12培養(yǎng)基(LifeTechnologies；Cat.#21041)。合并從搖瓶中收獲的培養(yǎng)基，之后取出培養(yǎng)基樣品用于IFN-β活性測定。在21天中，每天收獲1.8l培養(yǎng)基并在-80℃冷凍。
離心從搖瓶收獲的培養(yǎng)基且通過0.22μm濾膜(PVDF)過濾。過濾的培養(yǎng)基在裝備有截留值為10000的聚醚砜膜的Vivaflow200系統(tǒng)上滲濾并上樣到S-Sepharose柱(Pharmacia)上。
用50mM醋酸鈉，50mM氯化鈉，pH5.5平衡S.Sepharose柱，并用50mM醋酸鈉，0.5M氯化鈉，pH5.5洗脫干擾素變體。將洗脫物中的氯化鈉濃度調(diào)節(jié)到1.0M。
將來自S-Sepharose柱的洗脫物上樣到用50mM醋酸鈉，1.0M氯化鈉，pH5.5平衡的苯基-瓊脂糖高效柱(Pharmacia)上。上樣后用50mM醋酸鈉，50mM氯化鈉，pH5.5洗滌柱子。IFN-β變體用從50mM醋酸鈉，50mM氯化鈉，pH5.5到60％乙二醇，50mM醋酸鈉，pH5.5的梯度以30倍柱體積洗脫。收集并合并含有完全糖基化的IFN-β變體的餾分。
通過將洗脫物通過用50mM醋酸鈉，50mM氯化鈉，pH5.5平衡的S-Sepharose柱去掉苯基-瓊脂糖洗脫物中的乙二醇。乙二醇流過而干擾素變體結(jié)合到柱子上。上樣后用20mM醋酸鈉，pH5.5洗滌柱子并用100mM磷酸鈉，pH7.5洗脫干擾素變體。
將洗脫物中的磷酸鹽濃度調(diào)節(jié)到15mM磷酸鈉緩沖液，pH7.2，并上樣到用15mM磷酸鈉，pH7.2平衡的羥基磷灰石柱(CHT I，Ceramichydroxyapatite，Type I，Biorad)上。完全糖基化形式通過柱子，而糖基化不足形式使用一個(gè)富余的位點(diǎn)與柱子結(jié)合，用從15mM到200mM磷酸鈉，pH6.8的線型磷酸鈉梯度以20倍柱體積洗脫。
根據(jù)SDS-PAGE鑒定完全糖基化的變體[C17S+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T]IFN-β的純度高于95％。
純化后，將變體進(jìn)行PEG化。每次實(shí)驗(yàn)前在96％的乙醇中制備10mg/mlSCM-PEG(羧甲基化PEG的琥珀酰亞胺基酯，來自Shearwater，Alabama，12k或20k)的新鮮原液。
0.1mg/ml在20mM磷酸鈉，pH7.0中的蛋白質(zhì)溶液用SCM-PEG，20K進(jìn)行PEG化，PEG比可能的PEG化位點(diǎn)，即賴氨酸和N-末端過剩0.75倍的摩爾數(shù)。室溫下溫育30分鐘后，通過加入過剩的20mM甘氨酸，pH8.0終止反應(yīng)。反應(yīng)混合物含有單個(gè)，2個(gè)和未PEG化的物質(zhì)的混合物。使用陽離子交換層析或大小排阻層析或兩者的結(jié)合分離單個(gè)PEG化物質(zhì)與其它種類。將PEG化溶液中的pH調(diào)節(jié)到pH2.7并將樣品上樣到用20mM檸檬酸鈉，pH2.7平衡的SP-Sepharose HR(Pharmacia)柱上。用含有1M氯化鈉的50mM醋酸鈉從柱子上洗脫P(yáng)EG化蛋白質(zhì)并上樣到用100mM醋酸鈉，200mM氯化鈉，pH5.5平衡的大小排阻柱Sephacryl S-100，((16/60)Pharmacia)上。合并含有單個(gè)PEG化的物質(zhì)的餾分并進(jìn)一步鑒定。
在另一實(shí)驗(yàn)中，0.16mg/ml在20mM磷酸鈉，pH7.0中的蛋白質(zhì)溶液用SCM-PEG，12K進(jìn)行PEG化，PEG比可能的PEG化位點(diǎn)，即賴氨酸和N-末端過剩2倍的摩爾數(shù)。室溫下溫育30分鐘后，通過加入過剩的20mM甘氨酸，pH8.0終止反應(yīng)。反應(yīng)混合物含有單個(gè)，2個(gè)，3個(gè)PEG化物質(zhì)以及未衍生化物質(zhì)的混合物。使用陽離子交換層析或大小排阻層析或兩者的結(jié)合分離PEG化物質(zhì)與未修飾的蛋白質(zhì)。將PEG化溶液中的pH調(diào)節(jié)到pH2.7并將樣品上樣到用20mM檸檬酸鈉，pH2.7平衡的SP-Sepharose HR(Pharmacia)柱上。用含有1M氯化鈉的50mM醋酸鈉從柱子上洗脫P(yáng)EG化蛋白質(zhì)并上樣到用100mM醋酸鈉，200mM氯化鈉，pH5.5平衡的大小排阻柱SephacrylS-100，((16/60)Pharmacia)上。合并含有單個(gè)，2個(gè)和3個(gè)PEG化蛋白質(zhì)的混合物的餾分并進(jìn)一步鑒定。
實(shí)施例4含有[17S+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T]IFN-β糖基化變體的配制品的差示掃描量熱法通過差示掃描量熱法(DSC)分析IFN-β糖基化變體的樣品(實(shí)施例3制備)以研究蛋白質(zhì)的解折疊(或變性)且特別是測定在每次操作中蛋白質(zhì)的解折疊溫度(Tm)。
用于DSC分析的起始材料是在20mM磷酸鈉中的蛋白質(zhì)溶液(最后調(diào)節(jié)到βH7.1)。以加入各種賦形劑產(chǎn)生0.4mg/mL的最終蛋白質(zhì)濃度來制備溶液。使用注射水作為DSC的空白，因?yàn)榻裹c(diǎn)僅是測定Tm值的變化。在進(jìn)行DSC分析之前，按MicroCal Inc.所述通過使用真空足夠的時(shí)間給所有溶液除氣。
通過使用MicroCal Inc的DSC裝置(VP-DSC型)評估該蛋白質(zhì)的行為。所述溶液的溫度以每分鐘1.5℃的速率從環(huán)境溫度(25℃)逐漸增加到大約120℃。隨著溫度的增加在掃描中觀察到解折疊反應(yīng)(吸熱)為向上的峰值。
比較對加入“0.2M甘露醇”或“0.2M甘露醇+35mg/ml Captisol”的溶液的DSC操作揭示了含有Captisol的樣品Tm-值增加大約6.4℃。這些數(shù)據(jù)清楚地證實(shí)了加入Captisol可穩(wěn)定在溶液中的蛋白質(zhì)。
實(shí)施例5含有以12kDa PEG化的[C17S+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T]IFN-β糖基化變體的配制品將純化的以12kDa PEG化的IFN-β糖基化變體(實(shí)施例3制備)配制成下列在如下緩沖液10mM乙酸鈉緩沖液(最后調(diào)節(jié)到pH5.5)且含有45mg/ml甘露醇以及2mg/ml Tween 80(緩沖液I)，或50mM磷酸鈉緩沖液(最后調(diào)節(jié)到pH7.0)且含有30mg/ml甘露醇以及2mg/ml Tween 80(緩沖液II)中含有起始濃度為大約5MIU/ml的變體的組合物。對于緩沖系統(tǒng)I一種組合物(組合物A)不添加Captisol。另一組合物(組合物B)含有10mg/ml Captisol。對于緩沖系統(tǒng)II一種組合物(組合物C)不添加Captisol。另一組合物(組合物D)含有10mg/ml Captisol。
組合物以50μl的等分試樣在0.5ml Eppendorf管中在-80℃下貯存不同時(shí)間長度(不用氮或氬凈化)。至少0.4mL的樣品在硅化玻璃小瓶(I型玻璃)中在5，25和35℃下貯存(密封前用氮凈化)。
使用WO01/15736中所述的抗病毒試驗(yàn)測量抗病毒活性。
抗病毒活性試驗(yàn)的結(jié)果在下表中表示為“在給定溫度下貯存的樣品的平均百分活性，作為在-80℃下貯存的樣品的活性的函數(shù)(在同一天分析)”

NB.如果在給定時(shí)間點(diǎn)沒有分析該組合物的樣品，則表示為“-”。
這些數(shù)據(jù)清楚地證明向可藥用的緩沖系統(tǒng)中加入Captisol可延緩在某些pH值下的生物活性損失。
另外，對在小瓶中貯存的各種組合物的視覺觀測揭示了含有Captisol的組合物防止或延緩PEG化的IFN-β變體的沉淀。例如，組合物A和B在35℃貯存34天分別觀測為“高度渾濁”和“澄清溶液”。
實(shí)施例6含有以20kDa PEG化的[C17S+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T]IFN-β糖基化變體的配制品將純化的以20kDa PEG化的IFN-β變體(實(shí)施例3制備)配制成在如下緩沖液中含有起始濃度為11-14MIU/ml的變體的下列組合物10mM乙酸鈉緩沖液(最后調(diào)節(jié)到pH5.5)且含有45mg/ml甘露醇以及2mg/ml Tween 80和6.7mg/ml Captisol(組合物A)，或50mM磷酸鈉緩沖液(最后調(diào)節(jié)到pH7.0)且含有30mg/ml甘露醇以及2mg/ml Tween 80和10mg/ml Captisol(組合物B)。
組合物以50μl的等分試樣在0.5ml Eppendorf管中在-80℃下貯存不同時(shí)間長度(不用氮或氬凈化)。至少0.4mL的樣品在硅化玻璃小瓶(I型玻璃)中在5，25和35℃下貯存(密封前用氮凈化)。
使用WO01/15736中所述的抗病毒試驗(yàn)測量抗病毒活性。
抗病毒活性試驗(yàn)的結(jié)果在下表中表示為“在給定溫度下貯存的樣品的平均百分活性，作為在-80℃下貯存的樣品的活性的函數(shù)(在同一天分析)”

NB.如果在給定時(shí)間點(diǎn)沒有分析該組合物的樣品，則表示為“-”。
這些數(shù)據(jù)清楚地支持實(shí)施例5的發(fā)現(xiàn)，其中表明向可藥用的緩沖系統(tǒng)中加入Captisol可延緩或甚至防止在某些pH值下的生物活性損失。
實(shí)施例7[C17S+K19R+K33R+K45R+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T]IFN-β糖基化變體的生產(chǎn)，純化和PEG化將產(chǎn)生[C17S+K19R+K33R+K45R+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T]IFN-β糖基化變體的一個(gè)CHO K1亞克隆(5/G-10)按實(shí)施例3所述在6個(gè)搖瓶中生產(chǎn)并按實(shí)施例3所用的方案純化。根據(jù)SDS-PAGE鑒定完全糖基化的變體[C17S+K19R+K33R+K45R+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T]IFN-β的純度高于95％。
純化后，將變體進(jìn)行PEG化。每次實(shí)驗(yàn)前在乙醇中制備SCM-PEG(羧甲基化PEG的琥珀酰亞胺基酯，來自Shearwater，Alabama，12kD或20kD)的新鮮原液。
0.1mg/ml在20mM磷酸鈉，pH7.0中的蛋白質(zhì)溶液用SCM-PEG，20K進(jìn)行PEG化，PEG比可能的PEG化位點(diǎn)，即賴氨酸和N-末端過剩3倍的摩爾數(shù)。室溫下溫育30分鐘后，通過加入過剩的20mM甘氨酸，pH8.0終止反應(yīng)。反應(yīng)混合物含有單個(gè)，2個(gè)和未PEG化的物質(zhì)的混合物。使用陽離子交換層析或大小排阻層析或兩者的結(jié)合分離單個(gè)PEG化物質(zhì)與其它種類。將PEG化溶液中的pH調(diào)節(jié)到pH2.7并將樣品上樣到用20mM檸檬酸鈉，pH2.7平衡的SP-Sepharose HR(Pharmacia)柱上。用含有1M氯化鈉的50mM醋酸鈉從柱子上洗脫P(yáng)EG化蛋白質(zhì)并上樣到用100mM醋酸鈉，200mM氯化鈉，pH5.5平衡的大小排阻柱Sephacryl S-100，((16/60)Pharmacia)上。合并含有單個(gè)PEG化的物質(zhì)的餾分并進(jìn)一步鑒定。
在另一實(shí)驗(yàn)中，0.1mg/ml在20mM磷酸鈉，pH7.0中的蛋白質(zhì)溶液用(10mg/ml)SCM-PEg，12K進(jìn)行PEG化，PEG比可能的PEG化位點(diǎn)，即賴氨酸和N-末端過剩5倍的摩爾數(shù)。室溫下溫育30分鐘后，通過加入過剩的20mM甘氨酸，pH8.0終止反應(yīng)。反應(yīng)混合物含有單個(gè)，2個(gè)，3個(gè)PEG化物質(zhì)以及未衍生化物質(zhì)的混合物。使用陽離子交換層析或大小排阻層析或兩者的結(jié)合分離PEG化物質(zhì)與未修飾的蛋白質(zhì)。將PEG化溶液中的pH調(diào)節(jié)到pH2.7并將樣品上樣到用20mM檸檬酸鈉，pH2.7平衡的SP-Sepharose HR(Pharmacia)柱上。用含有1M氯化鈉的50mM醋酸鈉從柱子上洗脫P(yáng)EG化蛋白質(zhì)并上樣到用100mM醋酸鈉，200mM氯化鈉，pH5.5平衡的大小排阻柱Sephacryl S-100，((16/60)Pharmacia)上。合并含有單個(gè)，2個(gè)和3個(gè)PEG化蛋白質(zhì)的混合物的餾分并進(jìn)一步鑒定。
實(shí)施例8含有以20kDa PEG化的[C17S+K19R+K33R+K45R+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T]IFN-β糖基化變體的配制品將純化的以20kDa PEG化的IFN-β變體(實(shí)施例7制備)配制成在如下緩沖液中含有起始濃度為5-10MIU/ml的變體的下列組合物10mM乙酸鈉緩沖液(最后調(diào)節(jié)到pH5.0，～緩沖液A)；10mM乙酸鈉緩沖液(最后調(diào)節(jié)到pH5.5，～緩沖液B)，10mM琥珀酸鈉緩沖液(最后調(diào)節(jié)到pH5.5，～緩沖液C)，10mM琥珀酸鈉緩沖液(最后調(diào)節(jié)到pH6.0，～緩沖液D)和10mM檸檬酸鈉緩沖液(最后調(diào)節(jié)到pH6.0，～緩沖液E)。向5種所述緩沖系統(tǒng)的每一種中加入各種組合的下列3種賦形劑Tween 80(無，0.2和2.0mg/ml)，Captisol(10和50mg/ml)和甘露醇(17和39mg/ml)。另外，對于緩沖系統(tǒng)C和E，還研究了無Tween 80或Captisol但僅加入甘露醇(分別為34和32mg/ml)的組合。
調(diào)節(jié)甘露醇的量以確保等滲溶液適合于腸胃外給藥。
組合物以25μl的等分試樣在0.5ml Eppendorf管中在-80℃和5℃下貯存不同時(shí)間長度(不用氮或氬凈化)。至少0.4ml的樣品在硅化玻璃小瓶(I型玻璃)中在25℃下貯存(密封前用氮凈化)。
使用WO01/15736中所述的抗病毒試驗(yàn)測量抗病毒活性。
抗病毒活性試驗(yàn)的結(jié)果在下表中表示為“在給定溫度下貯存的樣品的平均百分活性，作為在-80℃下貯存的樣品的活性的函數(shù)(在同一天分析)”。
都含有10mM琥珀酸鈉緩沖液和甘露醇(最后調(diào)節(jié)到pH5.5，～緩沖液C)的7個(gè)不同的配制品在抗病毒分析前在-80℃和25℃下貯存。不合Tween 80和Captisol的配制品保持的穩(wěn)定性比其它配制品晚20天。

在25℃下貯存94-95天的緩沖液C組合物樣品的平均百分活性，作為在-80℃下貯存的樣品活性的函數(shù)(在同一天分析)。
*)在25℃下貯存74天的該緩沖液C組合物樣品的平均百分活性，作為在-80℃下貯存的樣品活性的函數(shù)(在同一天分析)。

在25℃下貯存160天的緩沖液C組合物樣品的平均百分活性，作為在-80℃下貯存的樣品活性的函數(shù)(在同一天分析)。
*)在25℃下貯存140天的該緩沖液C組合物樣品的平均百分活性，作為在-80℃下貯存的樣品活性的函數(shù)(在同一天分析)。
都含有10mM檸檬酸鈉緩沖液和甘露醇(最后調(diào)節(jié)到pH6.0，～緩沖液E)的7個(gè)不同的配制品在抗病毒分析前在-80℃和25℃下貯存。不含Tween 80和Captisol的配制品保持的穩(wěn)定性比其它配制品晚20天。

在25℃下貯存94-95天的緩沖液E組合物樣品的平均百分活性，作為在-80℃下貯存的樣品活性的函數(shù)(在同一天分析)。
*)在25℃下貯存75天的該緩沖液E組合物樣品的平均百分活性，作為在-80℃下貯存的樣品活性的函數(shù)(在同一天分析)。

在25℃下貯存164天的緩沖液E組合物樣品的平均百分活性，作為在-80℃下貯存的樣品活性的函數(shù)(在同一天分析)。
*)在25℃下貯存144天的該緩沖液E組合物樣品的平均百分活性，作為在-80℃下貯存的樣品活性的函數(shù)(在同一天分析)。
考慮到不含Captisol的組合物比剩下的組合物貯存的時(shí)間短得多，因此該數(shù)據(jù)清楚地表明向可藥用的緩沖系統(tǒng)中加入Captisol可延緩或甚至防止在某些pH值下的生物活性損失，即使在升高的溫度下貯存更長的時(shí)間。
實(shí)施例9結(jié)合下列參數(shù)研究包括實(shí)施例1-8的具體變體的選定純化的IFN-β變體的穩(wěn)定性a)“各種濃度”選自1-50MIU/ml。
b)緩沖液類型選自乙酸鈉，琥珀酸鈉，檸檬酸鈉，馬來酸鈉，碳酸鈉，酒石酸鈉，乳酸鈉，和其混合物，每種緩沖液類型具有高達(dá)100mM的合適濃度。
c)pH范圍選自pH4.0-7.0。
d)Captisol的濃度選自5-100mg/ml。
e)其它有關(guān)賦形劑的類型和量選自Tween 20(高達(dá)2mg/ml)，Tween80(高達(dá)2mg/ml)，甘露醇(高達(dá)50mg/ml)，氯化鈉(高達(dá)9mg/ml)。
f)適合于通過腸胃外施用給定產(chǎn)品的主要容器。
實(shí)施例10含有以20kDa PEG化的[C17S+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T]IFN-β糖基化變體的配制品配制前，用由含有25mg/ml甘露醇的10mM乙酸鈉緩沖液(最終調(diào)節(jié)到pH5.5)組成的溶液平衡純化的以20kDa PEG化的IFN-β變體(實(shí)施例3制備)。將該物質(zhì)配制成在如下緩沖液中含有起始濃度為100μg/ml的變體的下列組合物含有下列組合的甘露醇，氯化鈉(NaCl)，Tween 80和Captisol的10mM乙酸鈉緩沖液(最后調(diào)節(jié)到pH5.5)。

組合物通過過濾滅菌，在無菌條件下裝入無菌容器中并貯存不同時(shí)間長度。將20tl的等分試樣裝入0.5ml Eppendorf管中并在-80℃下貯存。至少0.3ml的等分試樣裝入硅化玻璃小瓶(I型玻璃)中并在5，25和35℃下貯存。
使用WO01/15736中所述的抗病毒試驗(yàn)測量抗病毒活性。
貯存大約1個(gè)月后抗病毒活性試驗(yàn)的結(jié)果在下表中表示為“在給定溫度下貯存的樣品的平均百分活性，作為在-80℃下貯存的樣品活性的函數(shù)(在同一天分析)”

在25℃下貯存的配制品組合物M01至M012的樣品的平均百分活性，作為在-80℃下貯存的樣品活性的函數(shù)(在同一天分析)。

在35℃下貯存的配制品組合物M01至M012的樣品的平均百分活性，作為在-80℃下貯存的樣品活性的函數(shù)(在同一天分析)。
這些數(shù)據(jù)清楚地支持實(shí)施例5中的發(fā)現(xiàn)，其中表明向可藥用的緩沖系統(tǒng)中加入Captisol可延緩或甚至防止在某些pH值下的生物活性損失。
與實(shí)施例6相比，在本實(shí)施例中使用明顯少得多的Tween 80，可解釋在所述多肽溫度升高時(shí)觀察到的穩(wěn)定性提高。
實(shí)施例11含有野生型IFN-β(IFN-β)的配制品按與實(shí)施例3所述的變體區(qū)別在于最后步驟由通過Superdex 75柱的凝膠過濾組成的方法純化IFN-β的大量制品。然后用由含有0.1M氯化鈉和0.2M甘露醇的50mM乙酸鈉(調(diào)節(jié)到pH5.5)組成的溶液平衡該物質(zhì)。
將該物質(zhì)配制成在如下緩沖液中含有起始濃度為大約5MIU/ml的IFN-β的下列組合物含有28mg/ml甘露醇，1.3mg/ml氯化鈉，和2mg/ml Tween80以及無Captisol(配制品A)或10mg/ml Captisol(配制品B)的50mM乙酸鈉緩沖液(最后調(diào)節(jié)到pH5.5)。
將該組合物以50μl的等分試樣裝入Eppendorf管中并在-80℃，-20和5℃下貯存不同時(shí)間長度。
使用WO01/15736中所述的抗病毒試驗(yàn)測量抗病毒活性。
貯存大約354天后抗病毒活性試驗(yàn)的結(jié)果在下表中表示為“在給定溫度下貯存的樣品的平均百分活性，作為在-80℃下貯存的樣品活性的函數(shù)(在同一天分析)”

在-20℃和5℃下貯存354天的配制品組合物A和B的樣品的平均百分活性，作為在-80℃下貯存的樣品活性的函數(shù)(在同一天分析)。
實(shí)施例12含有野生型IFN-γ(IFN-γ)的配制品按“制備干擾素γ的材料和方法”部分內(nèi)的實(shí)施例H所述進(jìn)行IFN-γ的大量制備。將該制品配制成在如下緩沖液中含有起始濃度為0.5mg/ml的IFN-γ的下列組合物含有40mg/ml甘露醇和0.01％ Tween 20以及無Captisol(配制品A)或50mg/ml Captisol(配制品B)的5mM琥珀酸鈉緩沖液(最后調(diào)節(jié)到pH6.0)。
組合物通過過濾滅菌，在無菌條件下裝入無菌容器中并貯存不同時(shí)間長度。將20μl的等分試樣裝入0.5ml Eppendorf管中并在-80℃下貯存。至少0.15ml的等分試樣裝入硅化玻璃小瓶(I型玻璃)中并在5，25，35和40℃下貯存。
使用“制備干擾素γ的材料和方法”部分中所述的螢光素酶測定法測量活性。
貯存8天后螢光素酶測定的結(jié)果在下表中表示為“在給定溫度下貯存的樣品的平均百分活性，作為在-80℃下貯存的樣品活性的函數(shù)(在同一天分析)”

在25，35和40℃下貯存8天的配制品組合物A和B的樣品的平均百分活性，作為在-80℃下貯存的樣品活性的函數(shù)(在同一天分析)。
實(shí)施例13含有[E38N+S40T+S99T]IFN-γ糖基化變體的配制品按“制備干擾素γ的材料和方法”部分描述的實(shí)施例D所述制備IFN-γ變體。按“制備干擾素γ的材料和方法”部分描述的實(shí)施例H所述純化該材料。將該純化的物質(zhì)配制成在如下緩沖液中含有起始濃度為0.5mg/ml的變體的下列組合物含有40mg/ml甘露醇和0.01％ Tween 20；以及無Captisol(配制品A)或50mg/ml Captisol(配制品B)的5mM琥珀酸鈉緩沖液(最后調(diào)節(jié)到pH6.0)。
組合物通過過濾滅菌，在無菌條件下裝入無菌容器中并貯存不同時(shí)間長度。將20μl的等分試樣裝入0.5ml Eppendorf管中并在-80℃下貯存。至少0.15ml的等分試樣裝入硅化玻璃小瓶(I型玻璃)中并在5和25℃下貯存。
使用“制備干擾素γ的材料和方法”部分中所述的螢光素酶測定法測量活性。
螢光素酶活性測定的結(jié)果在下表中表示為“在給定溫度下貯存的樣品的平均百分活性，作為在-80℃下貯存的樣品活性的函數(shù)(在同一天分析)”

在5和25℃下貯存的配制品組合物A和B的樣品的平均百分活性，作為在-80℃下貯存的樣品活性的函數(shù)(在同一天分析)。
序列表<110>馬克西根公司(Maxygen ApS)馬克西根控股有限公司(Maxygen Holdings Ltd.)<120>干擾素配制品<130>0232wo410<140>
<141>
<150>DK PA 2001 01040<151>2001-06-29<150>DK PA 2001 01277<151>2001-08-30<150>DK PA 2002 00257<151>2002-02-19<160>11<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>166<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln1 5 10 15Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu G1u Tyr Cys Leu20 25 30Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln35 40 45Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln50 55 60Asn Ile Phe Ala I1e Phe Arg G1n Asp Ser Ser Ser Thr G1y Trp Asn65 70 75 80Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn85 90 95His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr100 105 110Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg115 120 125Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr130 135 140Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu145 150 155 160Thr Gly Tyr Leu Arg Asn165
<210>2<211>143<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn1 5 10 15Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile20 25 30Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln35 40 45Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln50 55 60Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys65 70 75 80Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr85 90 95Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu100 105 110Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys115 120 125Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser Gln130 135 140<210>3<211>166<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>3Met Lys Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Ile Val Leu1 5 10 15Gly Ser Leu Gly Cys Tyr Cys Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu20 25 30Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn35 40 45Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp50 55 60Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe65 70 75 80Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile85 90 95Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg100 105 110Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val115 120 125Gln Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser130 135 140Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg145 150 155 160Gly Arg Arg Ala Ser Gln165<210>4
<211>140<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Actimmune<400>4Met Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe1 5 10 15Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly20 25 30Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser35 40 45Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Ash Phe Lys Asp Asp50 55 60Gln Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val65 70 75 80Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu85 90 95Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His100 105 110Glu Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly115 120 125Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg130 135 140<210>5<211>498<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>使干擾素γ在CHO細(xì)胞中的表達(dá)優(yōu)化的表達(dá)盒<400>5atgaagtaca caagctatat cctggccttt cagctgtgca tcgtgctggg ctccctgggc 60tgctattgcc aggaccctta cgtgaaggag gccgagaacc tgaagaagta ctttaacgcc 120ggccacagcg atgtggccga caatggcaca ctgtttctgg gcatcctgaa gaattggaag 180gaggagagcg atcggaagat catgcagtcc cagatcgtgt ccttctattt caagctgttt 240aagaatttca aggacgatca gtccatccag aagtccgtgg agaccatcaa ggaggacatg 300aacgtgaagt ttttcaatag caataagaag aagagagacg atttcgagaa gctgaccaat 360tactccgtga cagacctgaa cgtgcagaga aaggccatcc acgagctgat ccaggtgatg 420gccgagctgt cccccgccgc caagaccggc aagagaaaga gaagccagat gctgttcaga 480ggcagacggg ccagccag 498<210>6<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>6gatggctggc aactagaag 19
<210>7<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>7tgtacggtgg gaggtctat 19<210>8<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>8gttcaggtct gtcacggtgt aattggtcag ctt 33<210>9<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>9aagctgacca attacaccgt gacagacctg aac 33<210>10<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>10catgatcttc cgatcggtct cgttcttcca att 33<210>11<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>11aattggaaga acgagaccga tcggaagatc atg 3權(quán)利要求
1.一種穩(wěn)定化的組合物，它含有干擾素多肽和磺基烷基醚環(huán)糊精衍生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中該干擾素多肽是在貯存期間表現(xiàn)出聚集體形成和/或生物活性損失的多肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的組合物，其中該干擾素多肽是人野生型干擾素多肽或其變體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的組合物，其中該干擾素多肽是選自干擾素α，干擾素β，干擾素ω，干擾素τ，干擾素ε，和干擾素γ的人野生型干擾素多肽，或其變體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的組合物，其中該干擾素多肽被非多肽半分子衍生化。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的組合物，其中該干擾素多肽被糖基化和/或PEG化。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的組合物，其中該干擾素多肽是野生型人干擾素β。
8.根據(jù)權(quán)利要求5-6任一項(xiàng)的組合物，其中該干擾素多肽是含有干擾素β多肽的偶聯(lián)物，該干擾素β多肽的氨基酸序列與野生型人干擾素β的區(qū)別在于導(dǎo)入了至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)，該偶聯(lián)物還含有與導(dǎo)入的糖基化位點(diǎn)連接的至少一個(gè)糖類半分子。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的組合物，其中至少一個(gè)導(dǎo)入的糖基化位點(diǎn)是處在選自下列的位置的N-糖基化位點(diǎn)S2N+N4S/T，L6S/T，L5N+G7S/T，F(xiàn)8N+Q10S/T，L9N+R11S/T，R11N，R11N+S13T，S12N+N14S/T，F(xiàn)15N+C17S/T，Q16N+Q18S/T，Q18N+L20S/T，K19N+L21S/T，W22N+L24S/T，Q23N+H25S/T，G26N+L28S/T，R27N+E29S/T，L28S+Y30S/T，Y30N+L32S/T，L32N+D34S/T，K33N+R35S/T，R35N+N37S/T，M36N+F38S/T，D39S/T，D39N+P41S/T，E42N+I44S/T，Q43N+K45S/T，K45N+L47S/T，Q46N+Q48S/T，L47N+Q49T/S，Q48N+F50S/T，Q49N+Q51S/T，Q51N+E53S/T，K52N+D54S/T，L57N+I59S/T，Q64N+I66S/T，A68N+F70S/T，R71N+D73S/T，Q72N，Q72N+S74T，D73N，D73N+S75T，S75N+T77S，S75N，S76N+G78S/T，E81N+I83S/T，T82N+V84S/T，E85N+L87S/T，L88S/T，A89N+V91S/T，Y92S/T，Y92N+Q94S/T，H93N+I95S/T，L98S/T，H97N+K99S/T，K99N+V101S/T，T100N+L102S/T，E103N+K105S/T，E104N+L106S/T，K105N+E107S/T，E107N+E109S/T，K108N+D110S/T，E109N+F111S/T，D110N+T112S，D110N，F(xiàn)111N+R113S/T，R113N+K115S/T，G114N+L116S/T，K115N+M117S/T，L116N，L116N+S118T，S119N+H212S/T，L120N+L122S/T，H121N+K123S/T，K123N+Y125S/T，R124N+Y126S/T，G127N+I129S/T，R128N+L130S/T，L130N+Y132S/T，H131N+L133S/T，K134N+K136S/T，A135N+E137S/T，K136N+Y138S/T，E137N，Y138N+H140S/T，H140N+A142S/T，V148N+I150S/T，R152N+F154S/T，Y155N+I157S/T，L160S/T，R159N+T161S，R159N，G162N+L164S/T，和Y163N+R165S/T，所述取代相對于SEQ ID NO 1所示的野生型人干擾素β的氨基酸序列來表示。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的組合物，其中該干擾素多肽是還含有C17S突變的干擾素β多肽，所述取代相對于SEQ ID NO 1所示的野生型人干擾素β的氨基酸序列來表示。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-3，5，6，8-9中任一項(xiàng)的組合物，其中該干擾素β多肽選自Q49N+Q51T；F111N+R113T；Q49N+Q51T+F111N+R113T；C17S+Q49N+Q51T+L98P+F111N+R113T；S2N+N4T+C17S+Q51N+E53T；S2N+N4T+C17S+Q51N+E53T+F111N+R113T；C17S+Q49N+Q51T+F111N+R113T；C17S+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T；C17S+Q48F+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T；C17S+Q48Y+Q49N+Q51T+D110Y+F111N+R113T；K19R+K45R+K123R；K19R+K45R+Q49N+Q51T+F111N+R113T+K123R；C17S+K19R+K45R+Q49N+Q51T+F111N+R113T+K123R；C17S+K19R+K45R+Q49N+Q51T+F111N+R113T+K123R；C17S+K19R+Q49N+Q51T+F111N+R113T+K123R；C17S+K19R+K45R+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T+K123R；C17S+K19R+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T+K123R；S2N+N4T+C17S+K19R+K45R+Q51N+E53T+K123R；C17S+K19R+K45R+Q48F+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T+K123R；S2N+N4T+C17S+K19R+K45R+Q51N+E53T+D110F+F111N+R113T+K123R；C17S+K19R+K33R+K45R+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T；C17S+K19R+K33R+K45R+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T+K123R；C17S+K19R+K33R+K45R+Q49N+Q51T+F111N+R113T；和C17S+K19R+K33R+K45R+Q49N+Q51T+F111N+R113T+K123R；所述取代相對于SEQ ID NO 1所示野生型人干擾素β的氨基酸序列來表示。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的組合物，其中該干擾素多肽是干擾素γ多肽。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的組合物，其中該干擾素γ多肽是野生型人干擾素γ或其變體。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的組合物，其中該干擾素γ多肽是人野生型干擾素γ的含有取代S99T的變體，該取代相對于SEQ ID NO 2所示的野生型人干擾素γ的氨基酸序列表示。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的組合物，其中該變體還含有取代E38N+S40T，該取代相對于SEQ ID NO 2所示的野生型人干擾素γ的氨基酸序列表示。
16.根據(jù)權(quán)利要求12-15任一項(xiàng)的組合物，其中該干擾素γ多肽在C-末端截短了1-15個(gè)氨基酸殘基。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-16任一項(xiàng)的組合物，其中該磺基烷基醚環(huán)糊精衍生物是式(I)的化合物 其中n是4，5或6，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，和R9分別獨(dú)立地是，-O-或-O-(C2-C6亞烷基)-SO3-基團(tuán)，其中R1和R2中至少一個(gè)獨(dú)立地是-O-(C2-C6亞烷基)-SO3-基團(tuán)，且S1，S2，S3，S4，S5，S6，S7，S8和S9分別獨(dú)立地是可藥用的陽離子。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的組合物，其中該磺基烷基醚環(huán)糊精是β環(huán)糊精磺基丁基醚，例如其鹽形式，例如其鈉鹽，優(yōu)選Captisol。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)的組合物，其中所述的磺基烷基醚環(huán)糊精衍生物以從1mg/ml至150mg/ml的濃度存在。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)的組合物，其中所述的干擾素多肽以相應(yīng)于1-100MIU/ml，例如1-50MIU/ml的液體配制品，或者1-100MIU/劑，例如1-50MIU/劑的固體配制品的量存在。
21.根據(jù)權(quán)利要求1-20任一項(xiàng)的組合物，其中所述的組合物的pH范圍為4-8，優(yōu)選pH5-8，或另選4-7。
22.根據(jù)權(quán)利要求1-21任一項(xiàng)的組合物，它還含有一種緩沖劑。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的組合物，其中所述的緩沖劑以高達(dá)100mM的濃度存在。
24.根據(jù)權(quán)利要求1-23任一項(xiàng)的組合物，其中所述的組合物是一種液體等滲溶液且具有大約240-360mOsmol/kg的摩爾滲透壓濃度。
25.根據(jù)權(quán)利要求1-24任一項(xiàng)的組合物，它還含有一種張度劑。
26.根據(jù)權(quán)利要求1-23任一項(xiàng)的組合物，它是干燥形式或液體配制品，例如水溶液或懸液。
27.根據(jù)權(quán)利要求1-26任一項(xiàng)的組合物，它是液體溶液，例如水溶液。
28.根據(jù)權(quán)利要求26的組合物，它是冷凍的液體配制品，噴霧干燥，或者冷凍干燥的配制品形式。
29.根據(jù)上述權(quán)利要求任一項(xiàng)的組合物，它適合于腸胃外，鼻或肺給藥。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的組合物，它適合于靜脈內(nèi)，肌肉內(nèi)或皮下給藥。
31.根據(jù)權(quán)利要求1-30任一項(xiàng)的組合物，它還包含另一種賦形劑。
32.根據(jù)權(quán)利要求1-31任一項(xiàng)的組合物，它還包含能夠減少干擾素多肽的聚集和/或化學(xué)降解的第二種穩(wěn)定劑。
33.根據(jù)權(quán)利要求1-32任一項(xiàng)的組合物，它還含有一種保存劑和/或增粘劑。
34.根據(jù)權(quán)利要求1-32任一項(xiàng)的組合物，它不含保存劑。
35.根據(jù)權(quán)利要求1-34任一項(xiàng)的組合物，它還含有HSA。
36.根據(jù)權(quán)利要求1-34任一項(xiàng)的組合物，它不含HSA。
37.根據(jù)權(quán)利要求1-36任一項(xiàng)的組合物，它還含有一種表面活性劑，例如非離子表面活性劑。
38.根據(jù)權(quán)利要求1-36任一項(xiàng)的組合物，它不含表面活性劑，特別是非離子表面活性劑。
39.根據(jù)權(quán)利要求1-38任一項(xiàng)的組合物，其中該干擾素多肽在a)37℃的溫度下貯存至少1周和/或b)25℃的溫度下貯存至少4周期間基本上保留其抗病毒活性。
40.根據(jù)權(quán)利要求7-39任一項(xiàng)的組合物，其中該干擾素多肽還包含多聚體分子，例如聚乙二醇。
41.根據(jù)權(quán)利要求40的組合物，其中該多聚體分子包含一個(gè)PEG分子。
42.含有根據(jù)權(quán)利要求1-41任一項(xiàng)的組合物的主要產(chǎn)品容器。
43.根據(jù)權(quán)利要求42的容器，它是預(yù)裝的注射器。
44.一種增強(qiáng)配制成藥用組合物的干擾素多肽的穩(wěn)定性的方法，所述的方法包括向所述組合物中摻入磺基烷基醚環(huán)糊精衍生物，并可選包含一種緩沖劑。
45.根據(jù)權(quán)利要求44的方法，其中該干擾素多肽在貯存期間表現(xiàn)出聚集體形成，且該磺基烷基醚環(huán)糊精衍生物的摻入量足以減少干擾素多肽的聚集體形成。
46.根據(jù)權(quán)利要求44或45的方法，其中該組合物按權(quán)利要求1-41任一項(xiàng)限定。
47.對哺乳動物進(jìn)行干擾素治療的方法，該方法包含施用治療上有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-41任一項(xiàng)的組合物。
48.根據(jù)權(quán)利要求1-41任一項(xiàng)的組合物作為藥物的用途。
49.根據(jù)權(quán)利要求1-41任一項(xiàng)的組合物在制備用于治療疾病或紊亂的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及諸如藥用干擾素組合物的干擾素組合物及其制備方法。具體地說本發(fā)明涉及含有干擾素多肽和磺基烷基醚環(huán)糊精衍生物的穩(wěn)定組合物。
文檔編號A61K9/08GK1522159SQ02813121
公開日2004年8月18日 申請日期2002年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月29日
發(fā)明者喬恩·德魯斯特拉普, 喬恩 德魯斯特拉普 申請人:馬克西根公司, 馬克西根控股公司