專利名稱：抑制血管生成的化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可有效地抑制血管生成的化合物，其因此可代替硫酸化多糖如肝素，用于預(yù)防再狹窄，促進(jìn)傷口愈合，并抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有技術(shù)中已公開了硫酸化多糖在抑制血管生成和治療與血管生成有關(guān)的病癥和疾病中的應(yīng)用。國際專利申請No．PCT/GB95/00515(WO95/24907)，其內(nèi)容結(jié)合在此作為參考，它討論了肝素和其他硫酸化多糖如戊聚糖多硫酸酯和葡聚糖硫酸酯在這些病癥和疾病的治療中的應(yīng)用，還公開了另一種硫酸化多糖，昆布多糖硫酸酯的應(yīng)用，它在通過抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖而預(yù)防再狹窄，通過激活儲存在胞外基質(zhì)中的活性生長因子的釋放而促進(jìn)傷口愈合，以及通過抑制乙酰肝素酶活性而抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移方面顯示出的抗凝活性僅為肝素的約30％。
國際專利申請No．PCT/AU95/00350(WO95/34595)公開了一類抗病毒化合物，它包含樹狀聚合物如聚酰氨基胺(polyamidoamine)或具有多個(gè)端基的賴氨酸樹狀聚合物，其中至少有一個(gè)端基具有鍵合或連接其上的含有陰離子或陽離子的部分，特別是含有磺酸、含有羧酸、或含有三甲基銨的部分。
本發(fā)明提供了通過將離子基連接到直鏈非糖類聚合物或樹狀聚合物上而形成的多離子物質(zhì)在血管生成的抑制和相關(guān)疾病和病癥的治療中的應(yīng)用。
發(fā)明概述按照本發(fā)明，它提供了預(yù)防性或治療性抑制人或非人類動(dòng)物患者血管生成的方法，其包含給予該患者有效量的選自以下種類的化合物(ⅰ)具有多個(gè)側(cè)鏈基團(tuán)的直鏈非糖類聚合物，其中所述側(cè)鏈基團(tuán)中至少有一個(gè)具有鍵合或連接其上的含有陰離子或陽離子的部分；和
(ⅱ)具有多個(gè)端基的樹狀聚合物，其中所述端基中至少有一個(gè)具有鍵合或連接其上的含有陰離子或陽離子的部分。
特別優(yōu)選用于本發(fā)明方法的化合物是在其側(cè)鏈基團(tuán)上連接有含有磺酸的部分、含有羧酸的部分、含有磷酸或膦酸的部分、含有硼酸的部分、含有神經(jīng)氨酸或唾液酸的部分或含有在其4位或其他位置上有修飾的神經(jīng)氨酸或唾液酸的部分的直鏈聚合物，和在其端基上連接有含有磺酸的部分、含有羧酸的部分、含有磷酸或膦酸的部分、含有硼酸的部分、含有神經(jīng)氨酸或唾液酸的部分或含有在其4位或其他位置上有修飾的神經(jīng)氨酸或唾液酸的部分的樹狀聚合物。
在本文中提到的用于本發(fā)明方法的化合物分別是直鏈多離子聚合物或多離子樹狀聚合物，在整個(gè)說明書以及隨后的權(quán)利要求書中所用的這些術(shù)語的含義不僅包括該聚合物或樹狀聚合物本身，而且包括它們的藥學(xué)上或獸醫(yī)可接受的鹽，例如堿金屬或堿土金屬鹽如鈉、鉀或鈣鹽。
發(fā)明詳述本發(fā)明優(yōu)選使用的化合物包括(ⅰ)通式Ⅰ的直鏈多離子聚合物
其中R是形成直鏈聚合物骨架的非糖類單體單元；X是非必需的單體單元R的側(cè)鏈基團(tuán)上的連接基；和A是含有陰離子的部分；和(ⅱ)通式Ⅱ的多離子樹狀聚合物
其中Ⅰ是起始核心；Z是內(nèi)部分支單元；n是整數(shù)，它表示生成的樹狀聚合物的數(shù)目；和A是含有陰離子的部分，它可以通過非必需的連接基X連接到內(nèi)部分支單元Z上。
依照本發(fā)明，優(yōu)選的直鏈多離子聚合物是陰離子部分(A)，非必需地通過連接基(X)，軛合到直鏈非糖類聚合物骨架(由大量單體單元R組成)上而形成的多陰離子物質(zhì)。所得多陰離子直鏈聚合物具有重復(fù)單元的重量范圍分布，由此得到所期望的分子量分布的中值。所期望的是，分子量分布的中值范圍是1,000-1,000,000，優(yōu)選為10,000-600,000。
單體單元R優(yōu)選為氨基或酰胺部分，更優(yōu)選為氨基酸部分。特別優(yōu)選的單體單元是賴氨酸部分。從Sigma化學(xué)公司可購得具有不同分子量范圍的聚-L-賴氨酸。
陰離子部分A可直接或經(jīng)各種官能連接基X而連接到直鏈聚合物骨架上的活性側(cè)鏈基團(tuán)上，官能連接基X諸如但不限于酯，酰胺，醚，硫醚，胺，脲，硫脲，甲氨酸酯和碳酸酯。
非必需的連接基X也可作為聚合物和陰離子部分A之間的間隔基，并可由烷基鏈(可選為取代的或分支的)，烷氧基、聚烷氧基、烷硫基或聚烷硫基鏈(可選被取代的)，或鏈烯基、多鏈烯基、炔基或多炔基鏈(可選被取代的)組成。合適的間隔基鏈包括式-(CH2)n-Z-(CH2)n-基團(tuán)，其中Z是-CH2-,-CH=CH-,-C≡C-,-O-或-S-，而n是1-15的整數(shù)。
樹狀聚合物是大分子的高度分支的化合物，它是從最初的核心分子開始，通過反復(fù)的反應(yīng)序列，在核心上連續(xù)地“生成”連續(xù)的層或級，從而形成的一個(gè)三維的高度有序的聚合化合物。樹狀聚合物具有下述特征Ⅰ．起始核心(Ⅰ)可以具有一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)部位并且是點(diǎn)狀的或者是相當(dāng)大的以便影響該樹狀聚合物的最終布局；ⅱ．結(jié)合在起始核心上的分支的重復(fù)單元(Z)形成層；ⅲ．非必需地通過連接基(如上述連接基X)結(jié)合在樹狀聚合物表面上的官能端基(如陰離子部分A)。本發(fā)明以樹狀結(jié)構(gòu)作為附著離子部分的骨架；本發(fā)明并不限于本文中詳細(xì)描述的球形樹狀聚合物，而是可以基于任何樹狀結(jié)構(gòu)。形狀和結(jié)構(gòu)不同的各種樹狀聚合物均是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
樹狀聚合物的制備是已知的，例如在美國專利No.4,289,872和4,410,688中描述的(它們描述了基于賴氨酸單元成層的樹狀聚合物)，以及美國專利No.4,507,466,4,558,120,4,568,737和4,587,329中描述的(它們描述了基于其他單元包括聚酰氨基胺的樹狀聚合物或PAMAM樹狀聚合物)。在這些美國專利中公開的樹狀聚合物，記載它們適合用作如表面改性劑，金屬螯合劑，破乳化劑或水包油型乳劑，造紙中的濕強(qiáng)度劑，以及含水制劑如涂料中改良粘度的試劑。在美國專利No.4,289,872和4,410,688中也提出了基于賴氨酸單元的樹狀聚合物可用作藥劑制備的底物。
國際專利公開No.WO88/01178,WO88/01179和WO88/01180中公開了一些共軛物，其中樹狀聚合物與另一種物質(zhì)如載帶藥物或農(nóng)藥的物質(zhì)軛合或締合。另外，國際專利申請公開No.WO95/24221公開了由至少一種樹狀聚合物與載體物質(zhì)以及非必需的靶導(dǎo)向體締合而組成的樹狀聚合物共軛物，載體物質(zhì)可以是生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物。這些專利出版物和上面所提到的美國專利一起較全面地公開了各種樹狀聚合物及其制備方法，這些出版物所公開的內(nèi)容均結(jié)合在此作為參考。
本文中所用的術(shù)語“樹狀聚合物”應(yīng)理解為其最寬的含義，并且在其范圍內(nèi)包括如專利申請No.WO88/01178,WO88/01179和WO88/01180中公開的這些樹狀聚合物的所有形式和組合物。該術(shù)語還包括如在這些專利申請中公開的連接或橋接樹狀聚合物。
本發(fā)明的優(yōu)選的樹狀聚合物包含一個(gè)共價(jià)鍵合到至少兩個(gè)樹狀分支上的多價(jià)核心，并優(yōu)選通過至少兩個(gè)生長支而擴(kuò)展。特別優(yōu)選的樹狀聚合物是聚酰氨基胺(PAMAM)樹狀聚合物，PAMAM(EDA)樹狀聚合物和聚賴氨酸樹狀聚合物。
按照本發(fā)明，至少有一個(gè)、并優(yōu)選有相當(dāng)數(shù)量的直鏈聚合物上的側(cè)鏈基團(tuán)或樹狀聚合物表面上的端基具有共價(jià)鍵合其上的含有陰離子或陽離子的部分。該直鏈聚合物的側(cè)鏈或該樹狀聚合物的分支可以氨基或其他官能活性基團(tuán)如OH、SH或類似基團(tuán)結(jié)尾，它們隨后可與陰離子或陽離子部分反應(yīng)。當(dāng)直鏈聚合物的側(cè)鏈基團(tuán)或樹狀聚合物的端基為氨基時(shí)，含有陰離子或陽離子的部分可以通過各種官能基包括酰胺和硫脲鍵而連接到該樹狀聚合物上。可鍵合到直鏈聚合物的側(cè)鏈基團(tuán)或樹狀聚合物的端基上的優(yōu)選的含有陰離子或陽離子的部分包括含有磺酸的部分，含有羧酸的部分(包括含有神經(jīng)氨酸和唾液酸的部分和含有修飾的神經(jīng)氨酸和唾液酸的部分)，含有硼酸的部分，含有磷酸和膦酸的部分(包括含有酯化磷酸和膦酸的部分)以及含有三甲基銨的部分。
合適的可鍵合或連接到氨基或其他側(cè)鏈或端基上的含有陰離子或陽離子的部分包括，例如以下基團(tuán)(其中n為0或正整數(shù)，更具體地是n為0或1-20的整數(shù))-NH(CH2)nSO3-(CH2)nSO3-Ar(SO3)n-CH2CH(SO3)COOH-CH(SO3)CH2COOH -ArX(CH2)nSO3X=O,S,NH+ + +-(CH2)nNMe3-Ar(NMe3)n-Ar(CH2NMe3)n
-ArXP(=O)(OR)2X=O,CH2,CHF,CF2R=烷基，芳基H,Na-ArXP(=O)(OR1)(NR2R3)x=O,CH2,CHF,CF2R1=烷基，芳基H,Na R2,R3=烷基，芳基-Ar[P(=O)(OR)2]nR=烷基，芳基H,Na n=1-3-Ar[B(OH)2]nn=1-3 -Ar[COOH]nn=1-3
按照本發(fā)明，除了上述基團(tuán)外，各種含有神經(jīng)氨酸或唾液酸的部分或含有修飾的神經(jīng)氨酸或唾液酸的部分也可鍵合或連接到側(cè)鏈或端基上。這些部分包括神經(jīng)氨酸的各種N-和O-取代的衍生物，特別是N-和O-?；苌锶鏝-乙酰基，O-乙?；蚇-羥乙?；苌?，以及其中神經(jīng)氨酸基團(tuán)被修飾，特別是通過在4-位被氨基、酰胺基、氰基、疊氮基或胍基取代而修飾的部分。
本發(fā)明的陰離子或陽離子直鏈聚合物和樹狀聚合物可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)方法制備。在下文中的實(shí)施例部分利用實(shí)施例描述了合適的方法。
如前所述，已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的陰離子或陽離子直鏈聚合物和樹狀聚合物能抑制血管生成。因此，本發(fā)明的方法包括患者血管生成的抑制，與新血管的生長有關(guān)的疾病諸如慢性炎癥、糖尿病性視網(wǎng)膜病、銀屑病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療，以及相關(guān)疾病和病癥的治療，包括但不限于通過抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖而預(yù)防再狹窄，通過激活儲存在胞外基質(zhì)中的活性生長因子的釋放而促進(jìn)傷口愈合，以及通過抑制血管生成而抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。
因此，另一方面本發(fā)明提供了用于預(yù)防性或治療性抑制人或非人動(dòng)物患者血管生成的藥物或獸醫(yī)組合物，它包含上文中已清楚描述的陰離子或陽離子直鏈聚合物或樹狀聚合物，以及至少一種藥學(xué)上或獸醫(yī)可接受的載體或稀釋劑。
這種組合物的制劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。合適的藥學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑包括所有任意的常規(guī)溶劑，分散介質(zhì)，填充劑，固體載體，水溶液，包衣劑，抗細(xì)菌和抗真菌劑，等滲和吸收延遲劑等。這些介質(zhì)和試劑對藥物活性物質(zhì)的作用是本領(lǐng)域中熟知的，例如，在Remington’s藥物科學(xué)，第18版，Mack出版公司，賓西法尼亞州，美國中對它們進(jìn)行了描述。除了與活性成分不相容的任何常規(guī)介質(zhì)或試劑以外，其他均可考慮用于本發(fā)明的藥物組合物中。也可在該組合物中加入附加的活性成分。
為了易于給藥和使劑量均勻，尤為有利的是以劑量單位形式配制這些組合物。本文中所用的劑量單位形式是指適合作為單位劑量而用于要進(jìn)行治療的病人的物理分散單位；每個(gè)單位含有計(jì)算好能產(chǎn)生預(yù)期治療效果的預(yù)定量的活性成分和所需的藥物載體和/或稀釋劑。本發(fā)明的新的劑量單位形式的規(guī)格取決并直接依賴于(a)活性成分的特有性能和要達(dá)到的特定治療效果，和(b)用于特定治療的活性成分的配制領(lǐng)域中的固有限制。
另一方面，本發(fā)明提供了如上文中已清楚描述的有效量的陰離子或陽離子直鏈聚合物或樹狀聚合物通過抑制血管生成而在人或非人動(dòng)物患者的預(yù)防或治療中，或在用于預(yù)防或治療人或非人動(dòng)物患者的藥劑的制備中的應(yīng)用。
可使用各種給藥途徑。當(dāng)然，所選擇的特定方式將依據(jù)要治療的特定病情和治療效果所需的劑量而定。一般來說，本發(fā)明的方法可利用醫(yī)學(xué)上可接受的任何給藥方式，也就是說能產(chǎn)生本發(fā)明活性成分的治療濃度而不會導(dǎo)致臨床上不可接受的負(fù)作用的任何方式來實(shí)施。這樣的給藥方式包括口服，直腸，局部，鼻，吸入，經(jīng)皮或胃腸外(例如皮下，肌內(nèi)和靜脈內(nèi))途徑。用于口服給藥的制劑包括諸如膠囊，片劑，錠劑等分散單元。其他途徑包括直接鞘內(nèi)給藥到脊髓液中，利用諸如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的各種導(dǎo)管和氣囊血管成形術(shù)設(shè)備直接加入，和實(shí)質(zhì)組織內(nèi)注射到靶向區(qū)域。
該組合物可方便地以單位劑型存在并可用制藥領(lǐng)域中熟知的任何方法制備。這樣的方法包括將活性成分加入相關(guān)的構(gòu)成一種或多種輔助成分的載體中的步驟。一般說來，通過將活性成分均勻而緊密地?fù)饺胂嚓P(guān)的液體載體、精細(xì)分離的固體載體、或二者中而制得該組合物，然后如果需要，將該產(chǎn)物成形。
適于口服給藥的本發(fā)明的組合物可以作為分散單元如膠囊，扁囊劑，片劑或錠劑存在，每個(gè)單元含有預(yù)定量的活性成分，在脂質(zhì)體中或作為在含水液體或非含水液體中的懸液如糖漿，酏劑，或乳劑。
適于胃腸外給藥的組合物方便地包含活性成分的無菌含水制劑，其優(yōu)選與接受者的血液等滲。該含水制劑可以按照已知方法，利用那些合適的分散或濕潤劑和懸浮劑來配制。無菌注射制劑也可以是在無毒的胃腸外可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌注射溶液或懸液，例如在聚乙二醇中的溶液?？梢詰?yīng)用的可接受的賦形劑和溶劑是水，Ringer’s溶液和等滲氯化鈉溶液。另外，無菌固定油類可方便地用作溶劑或懸浮介質(zhì)。出于這一目的，可應(yīng)用任何溫和固定油包括合成的單甘油酯或二甘油酯。另外，可注射制劑中可應(yīng)用脂肪酸如油酸。
該活性成分也可配制成用于將活性成分鼻內(nèi)或通過吸入給藥的釋放系統(tǒng)，例如含有活性成分的精細(xì)分散的氣霧噴劑。
其他釋放系統(tǒng)可包括緩釋系統(tǒng)。優(yōu)選的緩釋系統(tǒng)是可使本發(fā)明的活性成分以緩釋的小丸或膠囊形式釋放的那些。可使用許多類型的緩釋系統(tǒng)。這些包括但不限于(a)浸蝕系統(tǒng)，其中活性成分包含在基質(zhì)中，和(b)擴(kuò)散系統(tǒng)，其中活性成分以可控速率滲透通過聚合物。另外，也可使用基于泵的硬件釋放系統(tǒng)，它們中的某些適于埋植。
活性成分以預(yù)防或治療有效量給藥。預(yù)防或治療有效量是指至少部分達(dá)到預(yù)期效果、或延遲所治療的特定疾病的發(fā)作、或抑制其發(fā)展、或完全終止其發(fā)作或發(fā)展所需的量。當(dāng)然，這樣的量將依據(jù)所治療的特定疾病，該疾病的嚴(yán)重程度和患者個(gè)體狀況包括年齡、體質(zhì)、大小、重量和并行的治療等而定。這些因素是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的并可僅僅通過例行試驗(yàn)確定。一般優(yōu)選使用最大劑量，也就是說，根據(jù)充分的醫(yī)學(xué)鑒定判斷出的最高安全劑量。不過，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，出于醫(yī)學(xué)原因、心理原因或?qū)嶋H上任何其他原因，可以較低的劑量或容許的劑量給藥。
一般說來，活性成分的日口服劑量將是約0.01mg/kg/天到1000mg/kg/天。一開始可給予小劑量(0.01-1mg)，接著增加劑量到最多約1000mg/kg/天。如果這樣的劑量不能使患者產(chǎn)生足夠的應(yīng)答，甚至可以使用更高的劑量(或者可以通過不同的更局限的釋放途徑使用有效的更高劑量)直到患者的容限。也可考慮每天多次給藥來達(dá)到化合物的合適的系統(tǒng)濃度。
按照本發(fā)明的活性成分也可以獸用組合物的形式存在，例如，它可用該領(lǐng)域中的常規(guī)方法制備。這樣的獸用組合物的實(shí)例包括適于以下給藥途徑的那些(a)口頭給藥，外用，例如獸用頓服藥(例如含水或非含水溶液或懸液)；片劑或大丸劑；用于與飼料混合的粉末、顆?；蛐⊥?；用于舌頭的糊劑；(b)胃腸外給藥例如通過皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)注射，例如作為無菌溶液或懸液；或(合適時(shí))通過乳房內(nèi)注射給藥，由此懸液或溶劑經(jīng)乳頭加入到乳房中；(c)局部應(yīng)用，例如作為皮膚用的霜?jiǎng)?，油膏或噴霧劑；或(d)陰道內(nèi)給藥，例如作為陰道栓劑，霜?jiǎng)┗蚺菽?br> 除非在上下文中另有要求，否則在整個(gè)說明書以及后面的權(quán)利要求書中，詞語“包含”將理解為包括所宣稱的整數(shù)或整數(shù)組而不包括任何其他整數(shù)或整數(shù)組。
從以下實(shí)施例中將明顯看出本發(fā)明的其他特征，這些實(shí)施例是為了闡述而不是限制本發(fā)明的。在下述實(shí)施例中，PAMAM樹狀聚合物是指如美國專利No.4,507,466,4,558,120,4,568,737和4,587,329中詳細(xì)描述的基于氨核心的聚酰氨基胺樹狀聚合物；PAMAM(EDA)樹狀聚合物是指基于乙二胺核心的聚酰氨基胺樹狀聚合物；而BHAlysxlysylysz樹狀聚合物是指如美國專利No.4,289,872和4,410,688中描述的基于二苯甲基胺核心和賴氨酸分支單元的聚賴氨酸不對稱樹狀聚合物。如美國專利No.4289872,4410688,4507466,4558120,4568737和4578639以及國際專利申請No.WO88/01178,WO88/01179,WO88/01180和WO95/24221中所述制得的聚酰氨基胺樹狀聚合物PAMAM1.0,PAMAM2.0,PAMAM3.0,PAMAM4.0,PAMAM5.0或更高代產(chǎn)物，PAMAM4.0(EDA)，以及聚賴氨酸樹狀聚合物BHAlyslys2,BHAlyslys2lys4,BHAlyslys2lys4lys8和BHAlyslys2lys4lys8lys16,BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32,BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32lys64，或更高代產(chǎn)物分別相應(yīng)于上述樹狀聚合物。
實(shí)施例1樹狀聚合物與2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸反應(yīng)得到以磺酸結(jié)尾的樹狀聚合物。A．PAMAM1.0將固體碳酸鈉(0.13g；1.0mmol)緩慢加入2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸(0.41g；2.0mmol)的攪拌的水(3ml)溶液中。當(dāng)停止放出氣體后，該溶液的pH為8.0。然后向該溶液中加入PAMAM1.0(0.12g；0.33mmol)的水溶液(1ml)，接著加入四滴氫氧化芐基三甲銨的40％水溶液。然后在氮?dú)庀略?0℃加熱該溶液三天后將其濃縮。殘余物用凝膠過濾法(交聯(lián)葡聚糖G10；水)純化，之后冷凍干燥得到磺化PAMAM1.0樹狀聚合物，為米色固體(0.51g)。1H和13C核磁共振譜顯示出二烷基化和一烷基化PAMAM1.0樹狀聚合物的混合物(約70∶30)。13C nmr(D2O):δ31.0,31.1,37.1,37.7,41.3,48.6,51.5,53.1,53.4,55.6,56.2,61.2,61.5,178.3,179.0,179.8。B．PAMAM2.0PAMAM2.0如上所述與2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸反應(yīng)。粗產(chǎn)物用凝膠過濾法(交聯(lián)葡聚糖G10；水)純化，之后冷凍干燥得到米色固體。1H和13C核磁共振譜顯示出二烷基化和一烷基化PAMAM2.0樹狀聚合物的混合物(約65∶35)。13C nmr(D2O):δ31.0,31.1,37.1,37.7,41.3,48.7,51.5,53.4,55.6,56.2,61.2,61.5,178.4,179.0,179.1,179.6。
當(dāng)重復(fù)上述反應(yīng)但略去氫氧化芐基三甲銨時(shí)，會得到類似結(jié)果。C．PAMAM3.0 BRI2783PAMAM3.0如上所述與2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸反應(yīng)，只是使用稍微過量的碳酸鈉并略去氫氧化芐基三甲銨。1H和13C核磁共振譜顯示出二烷基化和一烷基化PAMAM3.0樹狀聚合物的混合物(約50∶50)。13C nmr(D2O):δ31.0,31.1,36.9,37.4,41.1,48.6,51.5,53.4,55.7,56.2,61.1,61.5,178.2,178.9,179.0,179.8。D．PAMAM4.0 BRI2784PAMAM4.0如PAMAM3.0中所述與2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸反應(yīng)。1H和13C核磁共振譜顯示出二烷基化和一烷基化PAMAM4.0樹狀聚合物的混合物(約35∶65)。13C nmr(D2O):δ31.0,31.1,36.9,37.3,41.1,48.5,51.5,53.5,55.7,56.2,61.1,61.5,178.1,178.9,179.0,179.8。
實(shí)施例2以磺乙酰胺鈉結(jié)尾的樹狀聚合物的制備。A．PAMAM1.0將4-硝基苯基溴乙酸酯(0.40g；1.5mmol)的無水DMF(1ml)溶液加入PAMAM1.0(0.18g；0.5mmol)的攪拌的DMF(3ml)溶液中。當(dāng)茚三酮試驗(yàn)為陰性時(shí)，所得黃色溶液在室溫下攪拌20小時(shí)。濃縮該溶液(30°/0.1mmHg)得到黃色油。該油在水和氯仿之間分配，分離水層并用氯仿洗滌(2×)，最后用乙酸乙酯洗滌。濃縮該水溶液(35°/25mmHg)得到溴乙?；疨AMAM1.0樹狀聚合物，為黃色油(0.36g；100％)。13C nmr(D2O):δ32.8,33.3,43.0,43.5,54.4,174.5,176.4。
將亞硫酸鈉(0.2g；1.6mmol)的水溶液(1ml)加入上述溴乙酰化PAMAM1.0樹狀聚合物(0.36g；0.5mmol)的水(5ml)溶液中,并將該溶液在室溫下放置11天。濃縮該黃色溶液得到黃色固體(0.60g)。13C nmr(D2O):δ34.4,43.1,43.4,54.0,61.7,171.3,177.2。
上述反應(yīng)也可不分離溴乙?；瘶錉罹酆衔?，而是通過簡單地將亞硫酸鈉溶液加入到第一個(gè)反應(yīng)中得到的粗水提取物中而進(jìn)行。B．PAMAM2.0方法1將4-硝基苯基溴乙酸酯(0.18g；0.7mmol)的無水DMF(1ml)溶液加入PAMAM2.0(0.10g；0.1mmol)的攪拌的DMF(3ml)溶液中。當(dāng)茚三酮試驗(yàn)為陰性時(shí)，所得黃色溶液在室溫下攪拌20小時(shí)。然后邊打旋邊將該溶液加入水(150ml)中，該混合物用氯仿(3X)和乙酸乙酯萃取。將亞硫酸鈉(0.1g；0.8mmol)的水(1ml)溶液加入粗溴乙?；瘶錉罹酆衔锶芤褐胁⑹乖摶旌衔镌谑覝叵路胖萌?。然后濃縮該黃色溶液得到黃色固體殘余物，其用凝膠過濾法(交聯(lián)葡聚糖LH20；水)純化得到以磺乙酰胺鈉結(jié)尾的PAMAM2.0樹狀聚合物(103mg)。13C nmr(D2O):δ33.0,35.7，36.0,37.7,40.3,43.0,43.2,53.4,53.7,56.0,61.6,171.2,174.6,178.5。方法2將固體乙?；虼宜徵牾啺滨?67mg；0.33mmol)加入PAMAM2.0(52mg；0.05mmol)的無水DMF(2ml)溶液中，所得溶液在室溫下攪拌2天。然后將該混合物濃縮(30°/10-3mmHg)得到油狀殘余物。該殘余物在水和氯仿之間分配，分離水層并濃縮得到粘性油(117mg)。1H和13C核磁共振譜顯示該油為乙酰化樹狀聚合物和N-羥基琥珀酰亞胺的混合物。凝膠過濾法(交聯(lián)葡聚糖G10；水)得到以乙?；虼阴０方Y(jié)尾的PAMAM2.0樹狀聚合物的純樣品(29mg)。13C nmr(D2O):δ34.0,34.2,37.3,43.0,43.1,43.3,53.5,54.0,56.3,175.4,177.2,177.5。
然后將上述官能化樹狀聚合物在40％甲酸水溶液(7ml)中的溶液加入冰冷的新鮮制備的過甲酸(1.6mmol)的甲酸溶液(2ml)中。該混合物在0℃攪拌1小時(shí)，然后在室溫下攪拌20小時(shí)。加入小量活性碳以分解任何過量的過酸，該混合物攪拌30分鐘后過濾并濃縮得到粘性油。
將粗產(chǎn)物溶于水，用碳酸氫鈉水溶液將pH調(diào)節(jié)到9.0，該物質(zhì)通過交聯(lián)葡聚糖G10柱而脫鹽。冷凍干燥后得到白色固體(20mg)，其光譜表明其與用方法1得到的物質(zhì)本質(zhì)上相同。13C nmr (D2O):δ33.0,38.7,42.9,43.0,43.1,53.9,54.3,56.5,61.6,171.2,176.4,177.0。
實(shí)施例3以磺基琥珀酰胺酸鈉結(jié)尾的樹狀聚合物的制備。A．PAMAM1.0將固體馬來酐(0.11g；1.1mmol)加入PAMAM1.0(0.12g；0.33mmol)的攪拌的無水DMF(3ml)溶液中.當(dāng)該酐溶解時(shí)該混合物變成棕色并輕微發(fā)熱，將所得溶液在室溫下攪拌過夜。然后將該溶液濃縮(30°/10-4mmHg)得到粘性油。1H和13C(D2O)核磁共振譜(D2O)顯示PAMAM1.0完全轉(zhuǎn)化為三酰胺和一些馬來酸。13C nmr(D2O):δ33.1,42.8,43.1,54.3,135.0,137.1,169.1,171.9,173.3。
然后將粗三酰胺溶于水(4ml)并加入固體亞硫酸鈉(0.20g；1.6mmol)。使所得溶液在室溫下放置4天，然后濃縮。1H和13C(D2O)核磁共振譜顯示為以區(qū)域異構(gòu)的磺基琥珀酰胺酸鈉結(jié)尾的PAMAM1.0樹狀聚合物與一些磺基琥珀酸的1∶1混合物。該粗產(chǎn)物用凝膠過濾法(交聯(lián)葡聚糖G10；水)純化得到以磺基琥珀酰胺酸鈉結(jié)尾的PAMAM1.0樹狀聚合物的樣品(107mg)。13C nmr(D2O):δ33.3.39.6,40.0,42.9,43.1,54.0,67.9,69.4,173.8,176.3,177.6,181.8。B．PAMAM2.0如上所述制備以區(qū)域異構(gòu)的磺基琥珀酰胺酸鈉結(jié)尾的PAMAM2.0樹狀聚合物的混合物。13C nmr PAMAM2.0馬來酰胺酸衍生物(D2O):δ32.8,33.0,38.7,42.9,53.8,54.3,56.5,135.2,136.8,169.2,171.9,173.5,174.6。13C nmr PAMAM2.0磺基琥珀酰胺酸鈉衍生物(D2O):δ37.0,40.1,41.1,43.0,43.2,43.9,53.0,53.3,55.5,68.0,69.4,173.8.177.6,179.1,179.5,179.8.182.3。C．PAMAM4.0 BRI6038將固體馬來酐(60mg；0.6mmol)加入PAMAM4.0(51mg；0.01mmol)的攪拌的無水DMF(2ml)溶液中。一開始該混合物變得混濁但很快得到澄清溶液，將其在室溫下攪拌過夜。然后將該溶液濃縮(35°/10-4mmHg)得到粘性油。1H和13C(D2O)核磁共振譜顯示PAMAM4.0完全轉(zhuǎn)化為聚酰胺和一些馬來酸。然后將該粗聚酰胺溶于水(2ml)并加入亞硫酸鈉(126mg；1.0mmol)水(2ml)溶液。使所得溶液在室溫下放置2天，然后濃縮。1H和13C(D2O)核磁共振譜顯示為以區(qū)域異構(gòu)的磺基琥珀酰胺酸鈉結(jié)尾的PAMAM4.0樹狀聚合物與一些磺基琥珀酸的混合物。該粗產(chǎn)物用凝膠過濾法(交聯(lián)葡聚糖LH20；水)純化得到以24個(gè)區(qū)域異構(gòu)的磺基琥珀酰胺酸基團(tuán)結(jié)尾的PAMAM4.0的樣品(90mg)。1H nmr(D2O):δ2.4-2.6；2.7-3.1；3.2-3.4；3.9-4.0。13C nmr(D2O):δ36.2；39.8；40.5；43.0；43.2；53.5；55.8；68.1；69.5；173.8；177.4；177.6；178.7；182.3。
實(shí)施例4以N-(2-磺乙基)琥珀酰胺鈉結(jié)尾的樹狀聚合物的制備。a．N-(2-磺乙基)琥珀酰胺酸四丁基銨的制備將固體琥珀酐(0.5g；5.0mmol)加入2-氨乙基磺酸四丁基銨(1.83g；5.0mmol)的攪拌的無水二氯甲烷(30ml)溶液中。該琥珀酐緩慢溶解，并將所得混濁溶液在室溫下攪拌過夜。將該混合物過濾并濃縮濾液得到粘性油(2.41g)。13C核磁共振譜顯示完全轉(zhuǎn)化為預(yù)期的一酰胺和小量琥珀酸。通過將二氯甲烷溶液逐滴加入到大大過量的二乙醚中而使該產(chǎn)物重復(fù)沉淀，從而得到N-(2-磺乙基)琥珀酰胺酸四丁基銨(1.762g；76％)，為白色固體，mp125-127℃。1H nmr(CDCl3):δ0.86(t,12h,4×CH3),1.28(m,8H,4×CH2),1.50(m,8H,4×CH2),2.33(m,2H,CH2COOH),2.44(m,2H,CH2CONH),2.76(m,2H,CH2NHCO),3.12(m,8H,4×CH2N),3.50(m,2H,CH2SO3),7.53(br t,1H,NH)。13C nmr(CDCl3):δ13.5,19.5,23.8,30.1,30.9,35.6,50.0,58.5,172.0,174.1。b．4-硝苯基N-(2-磺乙基)琥珀酰胺酸四丁銨的制備將二環(huán)己基碳化二亞胺(45mg；0.22mmol)的無水二氯甲烷(1ml)溶液加入N-(2-磺乙基)琥珀酰胺酸四丁銨(94mg；0.20mmol)的攪拌的二氯甲烷(2ml)溶液中，該混合物在室溫下攪拌過夜。將所得懸液過濾并濃縮濾液得到粗的活性酯，其不必進(jìn)一步純化即可使用。A．以N-(2-磺乙基)琥珀酰胺鈉結(jié)尾的PAMAM樹狀聚合物的制備PAMAM4.0 BRI2786將粗4-硝苯基N-(2-磺乙基)琥珀酰胺酸四丁銨(0.30mmol)的無水DMF(1ml)溶液加入攪拌的PAMAM4.0(51.5mg；0.01mmol)的50％DMF水溶液(3ml)中，并將所得黃色溶液在室溫下攪拌過夜。然后濃縮該混合物(35°/10-5mmHg)，且黃色殘余物在水和氯仿之間分配。分離水層，用氯仿(2×)和乙酸乙酯洗滌，然后濃縮得到黃色油(134mg)。將該粗產(chǎn)物通過離子交換樹脂Amberlite IR120(Na)柱而將其轉(zhuǎn)化為85mg鈉鹽。將該物質(zhì)通過凝膠過濾法(交聯(lián)葡聚糖LH20；水)進(jìn)一步純化得到以N-(2-磺乙基)琥珀酰胺鈉結(jié)尾的PAMAM4.0樹狀聚合物(45mg)。13C nmr(D2O):δ33.2,33.6,35.5,39.0,39.5,42.8,43.2,53.8,54.1,54.4,56.6,176.5,176.9,177.2,178.9,179.4。
類似地制備相應(yīng)的以N-(2-磺乙基)琥珀酰胺鈉基團(tuán)結(jié)尾的PAMAM1.0和PAMAM3.0(BRI2785)樹狀聚合物。13C nmr PAMAM3.0衍生物(D2O):δ33.4,35.5,39.0,39.5,42.9,43.2,53.8,54.1,54.3,56.5,176.4,176.9,177.4,178.9,179.4。13C nmr PAMAM1.0衍生物(D2O):δ34.9,35.5,39.5,42.9,43.1,53.7,54.1,179.0,179.1,179.3。B．以N-(2-磺乙基)琥珀酰胺鈉結(jié)尾的聚賴氨酸樹狀聚合物的制備BHAlyslys2lys4lys8lys16BRI2789將三氟乙酸(1ml)加入BHAlyslys2lys4lys8DBL16(36.5mg；5.0μmol)的無水二氯甲烷(1ml)懸液中，并將所得溶液在氮?dú)庀略谑覝叵聰嚢?小時(shí)，然后濃縮。將殘余物溶于干燥DMSO(2ml)并用三乙胺將pH調(diào)節(jié)到8.5。然后滴加粗4-硝苯基N-(2-磺乙基)琥珀酰胺酸四丁銨(約0.2mmol)的DMSO溶液(1ml)并將該混合物在室溫下攪拌過夜。濃縮該黃色溶液(50°/10-5mmHg)，且黃色殘余物在水和氯仿之間分配。分離水層，用氯仿(3×)和乙酸乙酯洗滌，然后濃縮得到油(99mg)。將該粗產(chǎn)物通過離子交換樹脂AmberliteIR120(Na)柱而將其轉(zhuǎn)化為81mg鈉鹽。將該物質(zhì)通過凝膠過濾法(交聯(lián)葡聚糖LH20；水)進(jìn)一步純化得到以N-(2-磺乙基)琥珀酰胺鈉結(jié)尾的BHAlyslys2lys4lys8lys16樹狀聚合物(39mg)。13C nmr(D2O):δ27.0,32.3,35.2,35.3,35.6,35.7,39.5,43.5,54.1,58.5,131.5,132.0,133.3,145.1,177.8,178.0,178.4,178.8,178.9,179.2,179.7,179.8。
類似地制備相應(yīng)的以N-(2-磺乙基)琥珀酰胺鈉基團(tuán)結(jié)尾的BHAlyslys2,BHAlyslys2lys4(BRI2787)和BHAlyslys2lys4lys8(BRI2788)樹狀聚合物。13C nmr BHAlyslys2lys4lys8衍生物(D2O):δ26.9,32.3,35.1,35.3,35.6,35.7,39.5,43.5,54.1,58.5,131.6,131.9,132.2,132.3,133.2,133.3,145.0,145.2,177.2,177.8,177.9,178.0,178.2,178.3,178.6,178.7,178.8,178.9,179.2,179.3,179.7,179.8。13C nmr BHAlyslys21ys4衍生物(D2O):δ26.9,32.3,35.1,35.4,35.7,35.8,39.5,43.5,54.1,58.5,61.8,131.7,132.0,132.2,132.3,133.2,133.3,145.0,145.1,177.3,178.0,178.3,178.4,178.7,178.9,179.0,179.3,179.7,179.8。13C nmr BHAlyslys2衍生物(D2O):δ26.9,27.1,32.2,32.3,34.7,34.8,35.1,35.3,35.6,35.7,39.5,43.4,54.1,58.6,61.8,131.7,131.9,132.2,132.3,133.3,144.9,145.0,177.7,178.4,178.8,179.0,179.3,180.0。
實(shí)施例5以4-磺苯基硫脲鈉結(jié)尾的樹狀聚合物的制備A．PAMAM4.0 BRI2791將固體4-磺苯基異硫氰酸鈉一水合物(500mg；1.96mmol)加入PAMAM4.0(300mg；0.0582mmol)的水(10ml)溶液中，并將所得溶液在氮?dú)庀略?3℃加熱2小時(shí)，然后冷卻。濃縮該溶液，黃色固體殘余物用凝膠過濾法(交聯(lián)葡聚糖LH20；水)純化。合并純的級分并冷凍干燥得到以4-磺苯基硫脲鈉結(jié)尾的PAMAM4.0樹狀聚合物，為松散的白色固體(370mg)。1H nmr(D2O):δ2.28；2.52；2.69；3.15；3.27；3.60；7.32(d,J=9Hz)；7.72(d,J=9Hz)。13C nmr(D2O):δ36.9；41.1；43.1；48.3；53.6；55.8；129.0；131.1；144.4；178.5；179.1；184.4。
類似地制備相應(yīng)的分別以3、6、12和48個(gè)4-磺苯基硫脲鈉基團(tuán)結(jié)尾的PAMAM1.0,PAMAM2.0(BRI2790),PAMAM3.0和PAMAM5.0(BRI2991)樹狀聚合物。B．PAMAM4.0(EDA)BRI6045將固體4-磺苯基異硫氰酸鈉一水合物(130mg；0.5mmol)加入PAMAM4.0(EDA)(69mg；0.01mmo1)的水(4ml)溶液中，并將所得溶液在氮?dú)庀略?3℃加熱2小時(shí)，然后冷卻。濃縮該溶液，固體殘余物用凝膠過濾法(交聯(lián)葡聚糖LH20；水)純化。合并純的級分并冷凍干燥得到以32個(gè)4-磺苯基硫脲鈉基團(tuán)結(jié)尾的PAMAM4.0，為松散的白色固體(136mg)。1H nmr(D2O):δ2.30；2.50；2.70；3.18；3.62；7.35(d,J=9Hz)；7.72(d,J=9Hz)。13C nmr(D2O):δ36.8；41.0；43.1；48.4；53.6；55.7；128.9；131.0；144.3；178.5；179.0；184.5。C．BHAlyslys2lys4lys8lys16BRI2792在氮?dú)庀拢瑢⑷宜?4ml)加入BHAlyslys2lys4lys8DBL16(0.73g；0.1mmol)的無水二氯甲烷(4ml)懸液中。觀察到在短時(shí)間內(nèi)有大量氣體放出，將所得溶液在室溫下攪拌2小時(shí)，然后濃縮。將殘余糊漿溶于水(5ml)，讓該溶液通過Amberlite IRA-401(OH)柱并將濾液濃縮得到BHAlyslys2lys4lys8lys16，為粘性油(0.49g)。將該油再次溶于水(5ml)并加入N,N-二甲基-N-烯丙胺緩沖液(pH9.5；3ml)。然后加入固體4-磺苯基異硫氰酸鈉一水合物(1.30g；5.1mmol)并將所得溶液在氮?dú)庀略?3℃加熱2小時(shí)，然后冷卻。濃縮該溶液，棕色固體殘余物用凝膠過濾法(交聯(lián)葡聚糖LH20；水)純化。合并純的級分，通過Amberlite IR 120(Na)柱并冷凍干燥得到以4-磺苯基硫脲鈉結(jié)尾的BHAlyslys2lys4lys8lys16樹狀聚合物，為松散的白色固體(374mg)。1H nmr(D2O):δ1.40；1.72；3.08；3.42；4.24；4.60；7.30；7.40(d,J=9Hz)；7.78(d,J=9Hz)。13C nmr(D2O):δ27.3；32.5；35.9；43.7；48.9；58.6；63.3；128.8；131.0；143.7；144.7；145.1；177.7；178.1；183.8；185.2。
類似地制備相應(yīng)的分別以16、64和128個(gè)4-磺苯基硫脲鈉基團(tuán)結(jié)尾的BHAlyslys2lys4lys8,BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32(BRI2992)和BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32lys64(BRI2993)樹狀聚合物。
實(shí)施例6以3,6-二磺萘基硫脲鈉結(jié)尾的樹狀聚合物的制備A．PAMAM4.0 RRI2923
將固體3,6-二磺萘基異硫氰酸鈉(160mg；0.41mmol)加入PAMAM4.0(51mg；0.01mmol)的水(3ml)溶液中，并將所得溶液在氮?dú)庀略?3℃加熱2小時(shí)，然后冷卻。濃縮該溶液，棕色固體殘余物用凝膠過濾法(交聯(lián)葡聚糖LH20；水)純化。合并純的級分并濃縮得到以3,6-二磺萘基硫脲鈉結(jié)尾的PAMAM4.0樹狀聚合物，為棕色固體(73mg)。
1H nmr(D2O):δ2.30；2.60；2.74；3.20；3.57；7.75；7.86；8.28。13C nmr(D2O):δ35.0；39.9；43.1；48.1；53.8；56.1；128.4；128.6；129.3；131.0；131.3；136.0；136.8；138.2；145.5；146.0；177.2；177.8；185.5。
類似地制備相應(yīng)的以3,6-二磺萘基硫脲鈉基團(tuán)結(jié)尾的PAMAM2.0樹狀聚合物。B．PAMAM4.0(EDA)BRI6046將固體3,6-二磺萘基異硫氰酸鈉(220mg；0.57mmol)加入PAMAM4.0(EDA)(74mg；0.01mmol)的水(4ml)溶液中，并將所得溶液在氮?dú)庀略?3℃加熱2小時(shí)，然后冷卻。濃縮該溶液，棕色固體殘余物用凝膠過濾法(交聯(lián)葡聚糖LH20；水)純化。合并純的級分并濃縮得到以32個(gè)3,6-二磺萘基硫脲鈉基團(tuán)結(jié)尾的PAMAM4.0，為黃褐色固體(148mg)。
1H nmr(D2O):δ2.30；2.80；3.20；3.54；7.74；7.85；8.25。13C nmr(D2O):δ36.0；40.8；43.1；48.3；53.6；55.9；128.5；129.4；131.0；131.3；136.0；136.8；138.3；145.5；146.0；178.2；185.6。C．BHAlyslys2lys4lys8lys16BRI2999在氮?dú)庀?，將三氟乙?2ml)加入BHAlyslys2lys4lys8DBL16(73mg；0.01mmol)的無水二氯甲烷(2ml)懸液中。觀察到在短時(shí)間內(nèi)有大量氣體放出，將所得溶液在室溫下攪拌2小時(shí)，然后濃縮。將殘余糊漿溶于水(5ml)，讓該溶液通過Amberlite IRA-401(OH)柱并將濾液濃縮得到BHAlyslys2lys4lys8lys16，為粘性油。將該油再次溶于水(5ml)并加入N,N-二甲基-N-烯丙胺緩沖液(pH9.5；3ml)。然后加入固體3,6-二磺萘基異硫氰酸鈉(234mg；0.60mmol)并將所得溶液在氮?dú)庀略?3℃加熱2小時(shí)，然后冷卻。濃縮該溶液，棕色固體殘余物用凝膠過濾法(交聯(lián)葡聚糖LH20；水)純化。合并純的級分，通過Amberlite IR 120(Na)柱并冷凍干燥得到以32個(gè)3,6-二磺萘基硫脲鈉基團(tuán)結(jié)尾的BHAlyslys2lys4lys8lys16樹狀聚合物，為松散的米色固體(119mg)。1H nmr(D2O):δ1.0-2.0；3.18；3.43；4.31；7.22；7.80；7.89；8.25。13C nmr(D2O):δ27.2；32.4；35.3；43.7；49.0；58.5；63.6；128.4；129.1；131.4；136.1；136.6；138.6；139.0；145.1；145.6；178.4；184.8；186.7。
實(shí)施例7以4-磺萘基硫脲鈉結(jié)尾的樹狀聚合物的制備PAMAM4.0 BRI2997將固體4-磺萘基異硫氰酸鈉(180mg；0.5mmol)加入PAMAM4.0(51mg；0.01mmol)的水(5ml)溶液中，并將該混合物在氮?dú)庀略?3℃加熱2小時(shí)，然后冷卻。從所得懸液中減壓餾去水，米色固體殘余物用凝膠過濾法(交聯(lián)葡聚糖LH20；水)純化。合并純的級分并冷凍干燥得到以4-磺萘基硫脲鈉結(jié)尾的PAMAM4.0樹狀聚合物，為松散的白色固體(60mg)。1Hnmr(D2O):δ2.20；2.60；3.14；3.48；7.23；7.47；7.56；7.77；7.93(d,J=6Hz)；8.56(d,J=6Hz)。13C nmr(D2O):δ 35.8；40.5；43.1；48.4；53.6；55.9；127.6；128.6；130.3；131.9；132.5；133.5；134.7；140.5；142.7；177.8；178.0；185.4。
實(shí)施例8以3,5-二磺苯基硫脲鈉結(jié)尾的樹狀聚合物的制備PAMAM4.0 BRI6039將固體3,5-二磺苯基異硫氰酸鈉(110mg；0.32mmol)加入PAMAM4.0(63mg；0.012mmol)的水(3ml)溶液中，并將所得溶液在氮?dú)庀略?3℃加熱2小時(shí)，然后冷卻。濃縮該溶液，棕色固體殘余物用凝膠過濾法(交聯(lián)葡聚糖G25；水)純化。合并純的級分并濃縮得到以24個(gè)3,5-二磺苯基硫脲鈉基團(tuán)結(jié)尾的PAMAM4.0，為米色固體(110mg)。1H nmr(D2O):δ2.53；3.08；3.36；3.66；7.90；7.95。13C nmr(D2O):δ 34.8；41.0；43.1；48.0；53.7；56.2；124.1；128.6；143.5；148.8；177.6；185.0。
實(shí)施例9以3,6,8-三磺萘基硫脲鈉結(jié)尾的樹狀聚合物的制備PAMAM4.0 BRI2998將固體3,6,8-三磺萘基異硫氰酸鈉(250mg；0.5mmol)加入PAMAM4.0(51mg；0.01mmol)和N,N-二甲基-N-烯丙胺緩沖液(pH9.5；1ml)的水(2ml)溶液中，并將該混合物在氮?dú)庀略?3℃加熱2小時(shí)，然后冷卻。將該混合物減壓濃縮得到橙色固體。將殘余固體溶于水(2ml)并通過Amberlite IR-120(Na)短柱。然后濃縮濾液，殘余物用凝膠過濾法(交聯(lián)葡聚糖LH20；水)純化。合并純的級分并冷凍干燥得到以3,6,8-三磺萘基硫脲鈉結(jié)尾的PAMAM4.0樹狀聚合物，為米色固體(102mg)。1H nmr(D2O):δ2.65；3.02；3.30；3.66；8.05；8.42；8.59；8.67。13C nmr(D2O):δ33.2；38.7；43.2；43.7；47.8；54.0；54.3；56.7；131.0；131.3；131.9；135.9；138.0；139.6；143.8；144.1；145.6；176.2；176.5；186.0。
實(shí)施例10以4-(磺甲基)苯甲酰胺鈉結(jié)尾的樹狀聚合物的制備PAMAM4.0 BRI6040將固體4-硝苯基4-(氯甲基)苯甲酸酯(200mg；0.68mmol)加入PAMAM4.0(70mg；0.014mmol)的攪拌的無水DMSO(4ml)溶液中，并將所得黃色溶液在室溫下攪拌2小時(shí)。然后濃縮(10-4mmHg；40℃)該溶液，殘余物用水和二氯甲烷(1∶1)的混合物萃取。將剩下的固體物質(zhì)溶于DMSO(5ml)并加入亞硫酸鈉(130mg；1mmol)的水(3ml)溶液。將所得到的微混濁的混合物放置4天，之后加入水(2ml)，由此形成澄清的均質(zhì)的黃色溶液。然后濃縮該溶液，首先在25mmHg和40℃條件下，然后在10-4mmHg和50℃條件下濃縮得到粗產(chǎn)物。粗產(chǎn)物用凝膠過濾法(交聯(lián)葡聚糖G25；水)純化得到以24個(gè)4-(磺甲基)苯甲酰胺鈉基團(tuán)結(jié)尾的PAMAM4.0(24mg)。1H nmr(D2O):δ2.25；2.66；3.08；3.20；3.33；3.38；4.01；7.40(br d)；7.62(br d)。13C nmr(D2O):δ 36.7；40.9；43.0；43.6；53.5；55.5；61.0；131.6；135.0；137.2；140.4；174.5；178.6；179.2。
實(shí)施例11以4-磺基苯甲酰胺結(jié)尾的樹狀聚合物的制備PAMAM4.0(EDA)BRI6116將固體N-羥基琥珀酰亞氨基4-磺基苯甲酸鉀(100mg；0.3mmol)加入PAMAM4.0(EDA)(35mg；0.005mmol)的0.1M pH8.5硼酸鹽緩沖溶液(5ml)中，并將該溶液在室溫下攪拌2小時(shí)。在此階段所得奶狀溶液的pH為4.5。然后加入1M碳酸鈉溶液(1ml)得到澄清溶液，將其濃縮得到白色固體粗產(chǎn)物。該粗產(chǎn)物用凝膠過濾法(交聯(lián)葡聚糖G25；水)純化得到以32個(gè)4-磺基苯甲酰胺鈉基團(tuán)結(jié)尾的PAMAM4.0(EDA)(47mg)。1H nmr(D2O):δ2.25；2.42；2.63；3.05；3.18；3.31；3.38；7.72(d,J=8Hz)；7.78(d,J=8Hz)。13C nmr(D2O):δ36.0；40.4；43.0；43.7；53.7；55.8；130.2；132.2；140.4；150.1；173.6；178.0；178.5。
實(shí)施例12以N-(4-磺苯基)丙酰胺鈉結(jié)尾的樹狀聚合物的制備PAMAM4.0(EDA)BRI6117將固體N-(4-磺苯基)丙烯酰胺鈉(250mg；1mmol)和固體碳酸鈉(106mg；1mmol)依次加入PAMAM4.0(EDA)(78mg；0.011mmol)的攪拌的水(4ml)溶液中。所得溶液在氮?dú)庀聰嚢?天，然后冷凍干燥得到松散的白色固體。該粗產(chǎn)物用凝膠過濾法(交聯(lián)葡聚糖LH20；水)純化得到以64個(gè)N-(4-磺苯基)丙酰胺鈉基團(tuán)結(jié)尾的PAMAM4.0(EDA)(206mg)。13C核磁共振譜顯示有一烷基化末端氨基的弱痕跡。1H nmr(D2O):δ2.10；2.48；2.58；2.79；3.20；7.42(d,J=7Hz)；7.65(d,J=7Hz)。13C nmr(D2O):δ 36.5；37.9；41.1；53.4；55.6；124.8；130.9；143.0；144.2；177.4；178.5。
實(shí)施例13以4-磺苯基脲鈉結(jié)尾的樹狀聚合物的制備PAMAM4.0(EDA)BRI6115將磺胺酸鈉(195mg；1mmol)的無水DMSO(3ml)溶液滴加到N,N’-二琥珀酰亞胺碳酸酯(530mg；2mmol)的無水DMSO溶液(4ml)中，并將所得棕色溶液在室溫下攪拌20小時(shí)。加入PAMAM4.0(EDA)(75mg；0.011mmol)的無水DMSO(1ml)溶液并將該溶液再攪拌18小時(shí)。然后在高真空下濃縮該溶液(10-5mmHg；35℃)得到黃色半固體。將該粗產(chǎn)物溶于DMSO(4ml)并將該溶液加入到200ml充分?jǐn)嚢璧囊宜嵋阴ブ小Ｍㄟ^過濾收集沉淀出的白色固體并用乙酸乙酯(2×)和乙醚(2×)洗滌，然后干燥得到白色粉末(275mg)。該物質(zhì)進(jìn)一步用凝膠過濾法(交聯(lián)葡聚糖LH20；水)純化得到以32個(gè)4-磺苯基脲鈉基團(tuán)結(jié)尾的PAMAM4.0(EDA)(106mg)。1H nmr(D2O):δ2.31；2.55；2.75；3.19；7.32(d,J=9Hz)；7.63(d,J=9Hz)。13C nmr(D2O):δ36.3；40.7；43.3；43.8；53.7；55.7；123.3；130.9；140.9；146.0；161.4；178.2；178.6。
實(shí)施例14以N,N,N-三甲基氯化甘氨酰胺結(jié)尾的樹狀聚合物的制備BHAlyslys2lys4lys8lys16BRI2922將三氟乙酸(4ml)加入BHAlyslys2lys4lys8DBL16(220mg；30μmol)的無水二氯甲烷(2ml)懸液中，并將所得溶液在氮?dú)庀略谑覝財(cái)嚢?小時(shí)，然后濃縮。將殘余物溶于干燥DMSO(5ml)并用三乙胺將pH調(diào)節(jié)到85。然后加入固體4-硝苯基N,N,N-三甲基氯化甘氨酸酯(0.50g；1.8mmol)并將該混合物在室溫下攪拌過夜。然后濃縮該混濁溶液(50°/10-5mmHg)，殘余物在水和二氯甲烷之間分配。分離水層，用二氯甲烷(3×)和乙酸乙酯洗滌，然后濃縮得到油(1.128g)。該粗產(chǎn)物用凝膠過濾法(交聯(lián)葡聚糖LH20；水)純化得到以N,N,N-三甲基甘氨酰胺結(jié)尾的BHAlyslys2lys4lys8lys16樹狀聚合物(116mg)。13C nmr(D2O):δ25.5,30.5,30.8,33.4,42.1,56.5,57.1,67.5,68.1,166.7,167.0,167.1,176.0,176.2。
實(shí)施例15以4-三甲銨苯甲酰胺結(jié)尾的樹狀聚合物的制備PAMAM4.0 BRI6043將1,1’-羰基二咪唑(85mg；0.52mmol)加入4-三甲銨苯甲酸碘化物(154mg；0.5mmol)的無水DMF(4ml)溶液中并將該混合物在氬氣下在室溫?cái)嚢?小時(shí)。在此期間有白色固體與該溶液分離。然后加入PAMAM4.0(58mg；0.011mmol)的無水DMF(2ml)溶液并將該混合物在室溫下攪拌過夜。這一階段后大部分沉淀已溶解,且該溶液的茚三酮試驗(yàn)為陰性。濃縮該混合物(10-4mmHg；30℃)得到白色固體殘余物。粗產(chǎn)物用凝膠過濾法(交聯(lián)葡聚糖LH20；10％AcOH)純化得到以24個(gè)4-三甲銨苯甲酰胺基團(tuán)結(jié)尾的PAMAM4.0,為乙酸鹽(89mg)。1H nmr(D2O):δ1.96；2.65-2.85；3.25-3.55；3.64；7.92。13C nmr(D2O):δ25.8；33.1；33.5；38.7；43.1；43.5；53.5；54.1；56.4；61.2；124.8；133.6；139.9；153.2；173.2；176.3；176.8；182.6。
類似地制備以6個(gè)4-三甲銨苯甲酰胺基團(tuán)結(jié)尾的相應(yīng)的PAMAM2.0樹狀聚合物。
實(shí)施例16以4-(三甲銨甲基)苯甲酰胺結(jié)尾的樹狀聚合物的制備PAMAM4.0 BRI6044將固體4-硝苯基4-(氯甲基)苯甲酸酯(150mg；0.5mmol)加入攪拌的PAMAM4.0(52mg；0.01mmol)的無水DMSO(3ml)溶液中。當(dāng)茚三酮試驗(yàn)為陰性(pH約8.5)時(shí)，將所得黃色溶液在室溫下攪拌20小時(shí)。然后濃縮該溶液(10-5mmHg；40℃)，殘余物用水和二氯甲烷的混合物(1∶1)振搖。通過過濾收集不溶的凝膠樣物質(zhì)，用水(2×)和二氯甲烷(2×)洗滌，然后空氣干燥。將粗的以4-(氯甲基)苯甲酰胺結(jié)尾的樹狀聚合物溶于25％三甲胺水溶液(20ml)中并將該黃色溶液放置過夜。然后濃縮該溶液，殘余物溶于水(5ml)并讓該溶液通過Amberlite IRA-401(OH)柱。將無色的濾液濃縮得到粘性油，其用凝膠過濾法(交聯(lián)葡聚糖G10；10％AcOH)純化得到以24個(gè)4-(三甲銨甲基)苯甲酰胺基團(tuán)結(jié)尾的PAMAM4.0(90mg)。
1H nmr(D2O):δ1.88；2.65-2.80；2.98；3.10-3.60；7.52(br d,J=9Hz)；7.72(br d,J=9Hz)。13C nmr(D2O):δ26.6；33.4；38.8；43.2；43.5；53.6；53.6；54.1；56.8；62.8；73.0；132.1；135.3；137.5；140.0；176.4；176.9；183.6。
實(shí)施例17以N-(2-乙酰氧基乙基)-N,N-(二甲銨)甲基羧酰胺結(jié)尾的樹狀聚合物的制備PAMAM4.0將固體1,1'-羰基二咪唑(85mg；0.52mmol)加入N-(2-乙酰氧基乙基)-N-(羧甲基)-N,N-二甲基溴化銨(135mg；0.5mmol)的無水DMF(3ml)溶液中并將所得溶液在氮?dú)庀聰嚢?小時(shí)。然后加入PAMAM4.0(60mg；0.012mmol)的DMF(2ml)溶液，這使得立即形成了絮狀沉淀，隨后又緩慢溶解。將該混合物攪拌2天，然后濃縮(10-4mmHg；40℃)得到粘性油。粗產(chǎn)物用凝膠過濾法(交聯(lián)葡聚糖G10；10％AcOH)純化得到以24個(gè)N-(2-乙酰氧基乙基)-N,N-(二甲銨)甲基羧酰胺基團(tuán)結(jié)尾的PAMAM4.0(64mg)。1Hnmr(D2O):δ1.93；2.05；2.70；3.10-3.60；3.28；3.93(m)；4.14；4.48(m)。13C nmr(D2O):δ24.6；26.2；33.2；38.7；42.8；42.9；53.9；57.4；62.6；67.3；67.5；168.9；176.4；176.8；177.3；183.2。
實(shí)施例18以胍基結(jié)尾的樹狀聚合物的制備PAMAM4.0 BRI6042將PAMAM4.0(63mg；0.012mmol)和甲基硫代硫酸假脲(170mg；0.61mmol)的水(5ml)溶液(pH 10.5)在氮?dú)庀略?0℃加熱2小時(shí)。然后濃縮該溶液，殘余物用凝膠過濾法(交聯(lián)葡聚糖G10；10％AcOH)純化得到以24個(gè)胍基結(jié)尾的PAMAM4.0，為乙酸鹽(107mg)。1H nmr(D2O):δ2.00；2.80(brt)；3.09(brt)；3.32,3.45(brt)；3.60(brt)。13C nmr(D2O):δ25.2；33.2；33.4；38.7；41.2；42.6；43.4；44.7；53.5；54.0；56.3；176.5；176.7；176.9；181.6。
類似地制備相應(yīng)的以6個(gè)胍基結(jié)尾的PAMAM 2.0樹狀聚合物。
實(shí)施例19以4-([1,4,8,11-四氮雜環(huán)十四烷]甲基)苯甲酰胺結(jié)尾的樹狀聚合物的制備PAMAM4.0 BRI6041將1-(4-羧苯基)甲基-1,4,8,11-四氮雜環(huán)十四烷四鹽酸化物(120mg；0.25mmol),N-羥基琥珀酰亞胺(60mg；0.52mmol)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸化物(250mg；1.3mmol)在pH7磷酸鹽緩沖液(10ml)中的溶液在室溫下放置1小時(shí)，然后加入PAMAM4.0(32mg；0.006mmol)在pH7磷酸鹽緩沖液(10ml)中的溶液。將該混合物放置2天，然后濃縮。殘余物用凝膠過濾法(交聯(lián)葡聚糖LH20；10％AcOH)純化得到用1H和13C核磁共振譜確定的以約12個(gè)4-([1,4,8,11-四氮雜環(huán)十四烷]甲基)苯甲酰胺基團(tuán)結(jié)尾的PAMAM4.0(80mg)。然后將該產(chǎn)物溶于水并通過Amberlite IRA-401(Cl)樹脂柱，之后濃縮。將殘余物溶于水(1ml)，加入濃鹽酸(1ml)，該溶液用乙醇(30ml)稀釋以沉淀出白色固體。通過過濾收集該固體(68mg)。再次進(jìn)行1H和13C核磁共振測定顯示了末端氨基的約50％官能化。1H nmr(D2O):δ2.17；2.36；2.50；2.78；2.85；3.25；3.40；3.50；3.60,3.62；4.49；7.63(br d)；7.78(br d)。13C nmr(D2O):δ22.7；23.1；33.2；38.8；39.9；40.2；40.3；41.0；41.2；42.0；42.9；43.2；43.6；45.5；46.1；49.1；52.2；53.9；54.3；56.6；62.7；132.5；135.7；137.1；139.7；174.3；176.2；176.3；176.7；177.0；178.2；178.5。
實(shí)施例20以4-羧基-3-羥基芐胺結(jié)尾的樹狀聚合物的制備PAMAM4.0(EDA)BRI6119將氰基硼氫化鈉(32mg；0.5mmol)加入PAMAM4.0(EDA)(69mg；0.01mmol),4-甲酰-2-羥基苯甲酸(83mg；0.5mmol)和碳酸氫鈉(42mg；0.5mmol)在水(4ml)中的混合物中。將該非均質(zhì)的橙色混合物在室溫下攪拌4小時(shí)，在此期間其變?yōu)榫|(zhì)的。然后濃縮該橙色溶液，殘余物用凝膠過濾法(交聯(lián)葡聚糖LH20；水)純化得到以約32個(gè)4-羧基-3-羥基芐胺基團(tuán)結(jié)尾的PAMAM4.0(EDA)(91mg)。1H和13C(D2O)核磁共振譜顯示末端氨基多數(shù)為一烷基化，但有一些表現(xiàn)為二烷基化，兩個(gè)譜均顯示為寬峰。13C nmr(D2O):δ37.0；41.1；50.9；53.4；55.5；55.8；61.5；120.9；122.2；122.4；132.3；132.7；135.0；135.8；163.5；163.7；169.0；178.6；179.3。1H nmr(D2O):δ 2.20；2.35；2.60；3.15；3.30；3.55；4.25；6.68；7.12；7.55。
實(shí)施例21以4-羧苯基酰胺結(jié)尾的樹狀聚合物的制備PAMAM4.0(EDA)將固體4-羧苯基異硫氰酸鹽(86mg；0.48mmol)加入PAMAM4.0(EDA)(69mg；0.01mmol)的水(20ml)溶液中。用飽和碳酸氫鈉溶液將所得混濁溶液的pH調(diào)節(jié)到9，然后在室溫下攪拌24小時(shí)。將該反應(yīng)混合物過濾，濾液濃縮得到白色固體殘余物，其用凝膠過濾法(交聯(lián)葡聚糖LH20；水)純化，然后冷凍干燥得到白色松散固體產(chǎn)物(68mg)。
實(shí)施例22以3,5-二羧苯基酰胺結(jié)尾的樹狀聚合物的制備PAMAM4.0(EDA)將固體3,5-二羧苯基異硫氰酸鹽(112mg；0.5mmol)加入PAMAM4.0(EDA)(70mg；0.01mmol)的水(5ml)溶液中。用1MNa2CO3溶液將所得混濁溶液的pH調(diào)節(jié)到10，然后在氮?dú)庀略?3℃加熱2小時(shí)。將該反應(yīng)混合物過濾，濾液濃縮得到棕色固體殘余物，其用凝膠過濾法(交聯(lián)葡聚糖LH20；水)純化，然后冷凍干燥得到淡棕色固體產(chǎn)物(112mg)。
實(shí)施例23以4-膦酰氧基苯基硫脲鈉結(jié)尾的樹狀聚合物的制備PAMAM4.0(EDA)將固體4-膦酰氧基苯基異硫氰酸鈉(251mg)加入PAMAM4.0(EDA)(69mg；0.01mmol)的水(20ml)溶液中。將所得溶液(pH9)在氮?dú)庀略谑覝財(cái)嚢?4小時(shí)。將該反應(yīng)混合物濃縮得到白色固體殘余物，其用凝膠過濾法(交聯(lián)葡聚糖LH20；水)純化，然后冷凍干燥得到松散的白色固體產(chǎn)物(86mg)。
實(shí)施例24以4-(膦酰甲基)苯基硫脲鈉結(jié)尾的樹狀聚合物的制備PAMAM4.0(EDA)將固體4-(膦酰甲基)苯基異硫氰酸鈉(97mg)加入PAMAM4.0(EDA)(69mg；0.01mmol)的水(30ml)溶液中。所得溶液在氮?dú)庀略谑覝財(cái)嚢?天，定期加入飽和碳酸氫鈉溶液以維持pH為8。將該反應(yīng)混合物濃縮得到白色固體殘余物，其用凝膠過濾法(交聯(lián)葡聚糖LH20；水)純化，然后冷凍干燥得到松散的白色固體產(chǎn)物(102mg)。
實(shí)施例25以4-(膦酰甲基)苯基硫脲乙酯鈉結(jié)尾的樹狀聚合物的制備PAMAM4.0(EDA)將固體4-(膦酰甲基)苯基異硫氰酸乙酯鈉(109mg)加入PAMAM4.0(EDA)(69mg；0.01mmol)的DMF(30ml)溶液中。所得溶液在氮?dú)庀略谑覝財(cái)嚢?7小時(shí)，定期加入飽和碳酸氫鈉溶液以維持pH為8。將該反應(yīng)混合物濃縮得到白色固體殘余物，其用凝膠過濾法(交聯(lián)葡聚糖LH20；水)純化，然后冷凍干燥得到松散的白色固體產(chǎn)物(30mg)。
實(shí)施例26以4-磺苯基硫脲鈉結(jié)尾的聚賴氨酸的制備將固體4-磺苯基異硫氰酸鈉一水合物(2.55g；10mmol)加入聚-L-賴氨酸(15-30K)(Sigma化學(xué)公司)(1.0g)在水(20ml)和N,N-二甲基-N-烯丙胺緩沖液(pH9.5；15ml)的混合物中的溶液中。當(dāng)茚三酮試驗(yàn)為陰性時(shí)，將所得混合物在氮?dú)庀略?3℃加熱3小時(shí)。將冷卻后的混合物過濾，濾液濃縮得到灰色固體殘余物。將該固體殘余物再溶于水并通過離子交換樹脂Amberlite IR 120(Na)柱，然后濃縮。粗產(chǎn)物用凝膠過濾法(交聯(lián)葡聚糖LH20；水)純化并冷凍干燥得到以4-磺苯基硫脲鈉結(jié)尾的聚-L-賴氨酸BRI2995，為白色松散固體(1.25g)。
類似地制備分子量級分1-4K BRI2994、4-15K BRI2967、150-300K BRI2996的以4-磺苯基硫脲鈉結(jié)尾的聚賴氨酸。
實(shí)施例27以3,6-二磺萘基硫脲鈉結(jié)尾的聚賴氨酸的制備。
將固體3,6-二磺萘基異硫氰酸鈉(200mg；0.51mmol)加入聚-L-賴氨酸(15-30K)(50mg)在水(2ml)和N,N-二甲基-N-烯丙胺緩沖液(pH9.5；2ml)的混合物中的溶液中。當(dāng)茚三酮試驗(yàn)為陰性時(shí)，將所得混合物在氮?dú)庀略?3℃加熱3小時(shí)。將冷卻后的混合物過濾，濾液濃縮得到棕色固體殘余物。將該固體殘余物再溶于水并通過離子交換樹脂Amberlite IR 120(Na)柱，然后濃縮。粗產(chǎn)物用凝膠過濾法(交聯(lián)葡聚糖LH20；水)純化并冷凍干燥得到以3,6-二磺萘基硫脲鈉結(jié)尾的聚-L-賴氨酸BRI6047，為白色松散固體(87mg)。
實(shí)施例28以Cn-烷基連接的2-硫代唾液糖苷(thiosialoside)結(jié)尾的樹狀聚合物和直鏈聚合物的制備用下述方法制備[(8-辛酸N-羥基琥珀酰亞胺酯)5-乙酰氨基-4,7,8,9-四-O-乙?；?3,5-二脫氧-2-硫代-D-甘油基-α-D-半乳糖-2-nonulo吡喃糖苷酸]甲酯。
向5-乙酰氨基-4,7,8,9-四-O-乙酰基-2-S-乙?；?3,5-二脫氧-2-硫代-D-甘油基-α-D-半乳糖-2-nonulo吡喃糖酸甲酯(Hasegawa等人，1986)(100mg)的無水二甲基甲酰胺(1ml)溶液中加入8-溴辛酸(41mg)和二乙胺(280mg)，該溶液在20℃攪拌17小時(shí)。真空除去溶劑，殘余物在乙酸乙酯和冰冷的5％鹽酸之間分配。有機(jī)層用水洗滌，用硫酸鈉干燥，并蒸發(fā)得到殘余物(130mg)。將其溶于乙酸乙酯(5ml)中并加入N-羥基琥珀酰亞胺(26mg)和二環(huán)己基碳化二亞胺(46mg)。該混合物在20℃攪拌17小時(shí)，然后濾除白色沉淀。將濾液濃縮并用快速硅膠色譜法純化，用乙酸乙酯洗脫。將含有產(chǎn)物的洗脫級分合并，蒸發(fā)得到白色泡沫97mg。71％。
類似地制備[(11-十一烷酸N-羥基琥珀酰亞胺酯)5-乙酰氨基-4,7,8,9-四-O-乙?；?3,5-二脫氧-2-硫代-D-甘油基-α-D-半乳糖-2-nonulo吡喃糖苷酸]甲酯。甲酯。甲酯。甲酯。A．PAMAM[EDA]4.0[[(8-辛酰氨基)-5-乙酰氨基-3,5-二脫氧-2-硫代-D-甘油基-α-D-半乳糖-2-nonulo吡喃糖苷酸]32BRI6112在惰性氣氛下，向PAMAM[EDA]4.0(50mg)的無水二甲亞砜溶液(4ml)中加入[(8-辛酸N-羥基琥珀酰亞胺酯)5-乙酰氨基-4,7,8,9-四-O-乙?；?3,5-二脫氧-2-硫代-D-甘油基-α-D-半乳糖-2-nonulo吡喃糖苷酸]甲酯(300mg)，并將該溶液在20℃攪拌60小時(shí)。真空除去溶劑，將殘余物溶于甲醇(2ml)。該溶液用交聯(lián)葡聚糖LH20進(jìn)行體積排阻色譜，用甲醇洗脫。蒸發(fā)溶劑得到產(chǎn)物PAMAM[EDA]4.0[(8-辛酰氨基)5-乙酰氨基-4,7,8,9-四-O-乙?；?3,5-二脫氧-2-硫代-D-甘油基-α-D-半乳糖-2-nonulo吡喃糖苷酸]甲酯]32，為白色粉末。182mg。93％用下述方法將其轉(zhuǎn)化為游離的唾液糖苷(sialoside)在氨氣下在20℃，向PAMAM[EDA]4.0[[(8-辛酰氨基)5-乙酰氨基-4,7,8,9-四-O-乙?；?3,5-二脫氧-2-硫代-D-甘油基-α-D-半乳糖-2-nonulo吡喃糖苷酸]甲酯]32(182mg)的無水甲醇(3ml)溶液中加入新鮮制備的0.19M甲醇鈉的甲醇溶液(7ml)并將該混合物攪拌2.5小時(shí)。蒸除溶劑，將殘余物溶于水(10ml)并攪拌3小時(shí)。該溶液用交聯(lián)葡聚糖LH20進(jìn)行體積排阻色譜，用水洗脫。冷凍干燥后得到產(chǎn)物PAMAM[EDA]4.0[(8-辛酰氨基)-5-乙酰氨基-3,5-二脫氧-2-硫代-D-甘油基-α-D-半乳糖-2-nonulo吡喃糖苷酸]32，為淡檸檬色粉末110mg。77％用類似方法制備PAMAM[EDA]4.0[(11-十一酰氨基)-5-乙酰氨基-3,5-二脫氧-2-硫代-D-甘油基-α-D-半乳糖-2-nonulo吡喃糖苷酸]32BRI6147PAMAM[EDA]4.0[(乙酰氨基)-5-乙酰氨基-3,5-二脫氧-2-硫代-D-甘油基-α-D-半乳糖-2-nonulo吡喃糖苷酸]32BRI6121PAMAM[EDA]4.0[(4-甲基苯甲酰氨基)-5-乙酰氨基-3,5-二脫氧-2-硫代-D-甘油基-α-D-半乳糖-2-nonulo吡喃糖苷酸]32BRI6120B．BHAlyslys2lys4lys8lys16[(8-辛酰氨基)-5-乙酰氨基-3,5-二脫氧-2-硫代-D-甘油基-α-D-半乳糖-2-nonulo吡喃糖苷酸]32BRI6169將BHAlyslys2lys4lys8lys16(t-Boc)32(20.3mg)在三氟乙酸(2ml)和二氯甲烷(2ml)的混合物中的溶液在20℃下攪拌2小時(shí)，然后真空除去溶劑。將殘余物溶于干燥的二甲亞砜(1ml)并加入二-異丙基乙胺(25mg)和[(8-辛酸N-羥基琥珀酰亞胺酯)5-乙酰氨基-4,7,8,9-四-O-乙酰基-3,5-二脫氧-2-硫代-D-甘油基-α-D-半乳糖-2-nonulo吡喃糖苷酸]甲酯(78mg)。將該混合物在氬氣下在20℃攪拌60小時(shí)，然后真空除去溶劑。將殘余物溶于新鮮制備的甲醇鈉的0.1M甲醇溶液(2.5ml)并將該混合物在氬氣下在20℃攪拌3小時(shí)。蒸除溶劑，將殘余物溶于水(1ml)并攪拌17小時(shí)。該溶液用交聯(lián)葡聚糖LH20進(jìn)行體積排阻色譜，用水洗脫。冷凍干燥后得到產(chǎn)物BHAlyslys2lys4lys8lys16[(8-辛酰氨基)-5-乙酰氨基-3,5-二脫氧-2-硫代-D-甘油基-α-D-半乳糖-2-nonulo吡喃糖苷酸]32，為白色粉末44mg。86％。C．聚-L-賴氨酰[(8-辛酰氨基)-5-乙酰氨基-3,5-二脫氧-2-硫代-D-甘油基-α-D-半乳糖-2-nonulo吡喃糖苷酸]nBRI6150向聚-L-賴氨酸．HBr MW 150-300Kd(22mg)的無水二甲亞砜(1ml)溶液中加入二異丙基乙胺(15mg)和[(8-辛酸N-羥基琥珀酰亞胺酯)5-乙酰氨基-4,7,8,9-四-O-乙?；?3,5-二脫氧-2-硫代-D-甘油基-α-D-半乳糖-2-nonulo吡喃糖苷酸]甲酯(90mg)。該混合物在氬氣下在20℃攪拌60小時(shí)，然后真空除去溶劑。將殘余物溶于新鮮配制的甲醇鈉的0.5M甲醇溶液(4ml)并將該混合物在氫氣下在20℃攪拌48小時(shí)。蒸除溶劑，將殘余物溶于水(1.5ml)并攪拌24小時(shí)。該溶液用交聯(lián)葡聚糖LH20進(jìn)行體積排阻色譜，用水洗脫。冷凍干燥后得到產(chǎn)物聚賴氨酰[(8-辛酰氨基)-5-乙酰氨基-3,5-二脫氧-2-硫代-D-甘油基-α-D-半乳糖-2-nonulo吡喃糖苷酸]n，為白色粉末49mg。94％。
實(shí)施例29在唾液酸的4位有修飾的樹狀唾液糖苷的制備用下述方法制備4-疊氮基-5-乙酰氨基-7,8,9-三-O-乙?；?2-S-乙?；?3,4,5-三脫氧-2-硫代-D-甘油基-α-D-半乳糖-2-nonulo吡喃糖酸甲酯。向4-疊氮基-5-乙酰氨基-7,8,9-三-O-乙?；?2-氯-3,4,5-三脫氧-D-甘油基-β-D-半乳糖-2-nonulo吡喃糖酸甲酯(Sabesan,1994)(5g)的無水二氯甲烷溶液(150ml)中加入精細(xì)粉碎的硫羥乙酸鉀(5.8g)，并將該懸液在20℃用力攪拌48小時(shí)。將該混合物過濾并蒸發(fā)得到淺棕色泡沫(5.2g)。用制備型反相HPLC[C18,30％乙腈/水]分離出所需產(chǎn)物，為白色泡沫3.9g。72％用下述方法制備[(8-辛酸N-羥基琥珀酰亞胺酯)4-疊氮基-5-乙酰氨基-7,8,9-三-O-乙?；?3,4,5-三脫氧-2-硫代-D-甘油基-α-D-半乳糖-2-nonulo吡喃糖苷酸]甲酯。
向4-疊氮基-5-乙酰氨基-7,8,9-三-O-乙?；?2-S-乙酰基-3,4,5-三脫氧-2-硫代-D-甘油基-α-D-半乳糖-2-nonulo吡喃糖酸甲酯(300mg)的無水二甲基甲酰胺(3.5ml)溶液中加入8-溴辛酸(115mg)和二乙胺(1.26ml)，該溶液在20℃攪拌17小時(shí)。真空除去溶劑，殘余物在乙酸乙酯和冰冷的10％鹽酸之間分配。有機(jī)層用水洗滌，用硫酸鈉干燥，并蒸發(fā)得到黃色泡沫(385mg)。將其溶于乙酸乙酯(20ml)中并加入N-羥基琥珀酰亞胺(95mg)和二環(huán)己基碳化二亞胺(175mg)。該混合物在20℃攪拌17小時(shí)，然后濾除白色沉淀。將濾液濃縮并用制備型反相HPLC[C18,30％乙腈/水]純化，得到白色泡沫340mg。83％。A．PAMAM[EDA]4.0[(8-辛酰氨基)-4-疊氮基-5-乙酰氨基-3,4,5-三脫氧-2-硫代-D-甘油基-α-D-半乳糖-2-nonulo吡喃糖苷酸]32BRI6146在惰性氣氛下，向PAMAM[EDA] 4.0(72mg)的無水二甲亞砜溶液(5ml)中加入[(8-辛酸N-羥基琥珀酰亞胺酯)4-疊氮基-5-乙酰氨基-7,8,9-三-O-乙?；?3,4,5-三脫氧-2-硫代-D-甘油基-α-D-半乳糖-2-nonulo吡喃糖苷酸]甲酯(318mg)，并將該溶液在20℃攪拌60小時(shí)。真空除去溶劑，將殘余物溶于甲醇(2ml)。該溶液用交聯(lián)葡聚糖LH20進(jìn)行體積排阻色譜，用甲醇洗脫。蒸發(fā)溶劑得到產(chǎn)物PAMAM[EDA]4.0[[(8-辛酰氨基)4-疊氮基-5-乙酰氨基-7,8,9-三-O-乙?；?3,4,5-三脫氧-2-硫代-D-甘油基-α-D-半乳糖-2-nonulo吡喃糖苷酸]甲酯]32，為白色泡沫。225mg。81％用下述方法得到游離的唾液糖苷在氬氣下在20℃，向PAMAM[EDA] 4.0[[(8-辛酰氨基)4-疊氮基-5-乙酰氨基-7,8,9-三-O-乙酰基-3,4,5-三脫氧-2-硫代-D-甘油基-α-D-半乳糖-2-nonulo吡喃糖苷酸]甲酯]32(215mg)的無水甲醇溶液(1ml)中加入新鮮制備的甲醇鈉的1M甲醇溶液(1ml)并將該混合物攪拌3小時(shí)。蒸除溶劑，將殘余物溶于水(2ml)并攪拌17小時(shí)。該溶液用交聯(lián)葡聚糖LH20進(jìn)行體積排阻色譜，用水洗脫。冷凍干燥后得到產(chǎn)物PAMAM[EDA]4.0[(8-辛酰氨基)-4-疊氮基-5-乙酰氨基-3,4,5-三脫氧-2-硫代-D-甘油基-α-D-半乳糖-2-nonulo吡喃糖苷酸]32，為松散的白色粉末160mg。90％B．PAMAM[EDA]4.0[(8-辛酰氨基)-4-氨基-5-乙酰氨基-3,4,5-三脫氧-2-硫代-D-甘油基-α-D-半乳糖-2-nonulo吡喃糖苷酸]32BRI6149在20℃下，將硫化氫氣流緩慢通入PAMAM[EDA]4.0[(8-辛酰氨基)-4-疊氮基-5-乙酰氨基-3,4,5-三脫氧-2-硫代-D-甘油基-α-D-半乳糖-2-nonulo吡喃糖苷酸]32(25mg)在吡啶(40ml)和水(20ml)的混合物中的溶液中，持續(xù)5天。然后向該溶液中通入氮?dú)?小時(shí)以除去過量的硫化氫。將該溶液蒸發(fā)至干，殘余物溶于水(5ml)并通過0.45μm膜濾器過濾以除去硫。冷凍干燥后得到產(chǎn)物PAMAM[EDA]4.0[(8-辛酰氨基)-4-氨基-5-乙酰氨基-3,4,5-三脫氧-2-硫代-D-甘油基-α-D-半乳糖-2-nonulo吡喃糖苷酸]32，為松散的白色粉末23mg。96％實(shí)施例30以硼酸結(jié)尾的樹狀聚合物的制備。4-羧苯基硼酸N-羥基琥珀酰亞胺酯向4-羧苯基硼酸(500mg)的無水二甲基甲酰胺(5ml)溶液中加入N-羥基琥珀酰亞胺(380mg)和二環(huán)己基碳化二亞胺(680mg)，并將該混合物在20℃攪拌64小時(shí)，然后濾除白色沉淀。真空除去溶劑，殘余物溶于乙酸乙酯(100ml)。該溶液用水洗滌，用硫酸鈉干燥并蒸發(fā)得到白色固體，將其從乙腈/水中結(jié)晶，得到細(xì)針狀體730mg。92％PAMAM[EDA]4.0[4-苯甲酰氨基硼酸]32BRI6160在惰性氣氛下，向PAMAM[EDA]4.0(69mg)的無水二甲亞砜(5ml)溶液中加入4-羧苯基硼酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(130mg)，并將該溶液在20℃攪拌65小時(shí)。向該稠密的淤漿中加入1M碳酸鈉溶液(1ml)并將該澄清溶液再攪拌24小時(shí)。真空除去溶劑，將殘余物溶于10％氨溶液(5ml)。該溶液用交聯(lián)葡聚糖LH20進(jìn)行體積排阻色譜，用10％氨溶液洗脫。蒸發(fā)溶劑得到產(chǎn)物PAMAM[EDA]4.0[4-苯甲酰氨基硼酸]32，為白色松散固體。110mg。94％實(shí)施例31以3,6-二磺萘基硫脲鈉結(jié)尾的樹狀聚合物的制備。BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32將三氟乙酸(2ml)加入BHAlyslys2lys4lys8lys16DBL32(147mg)的攪拌的無水二氯甲烷(2ml)懸液中，并將所得溶液在氮?dú)庀略谑覝財(cái)嚢?小時(shí)，然后濃縮。將殘余物溶于N,N-二甲基-N-烯丙胺緩沖液(pH9.5；5ml)中，然后加入固體3,6-二磺萘基異硫氰酸鹽(400mg)。加入1M碳酸鈉將該混合物的pH調(diào)節(jié)到9.5，并將該溶液在氮?dú)庀略?3℃加熱3小時(shí)。濃縮該反應(yīng)混合物，將殘余物再次溶于水并將該溶液通過Amberlite IR 120(Na)柱。將濾液濃縮得到粗產(chǎn)物，其用凝膠過濾法(交聯(lián)葡聚糖LH20；水)純化得到有64個(gè)3,6-二磺萘基脲鈉基團(tuán)的BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32，為白色松散固體(175mg)。
實(shí)施例32以3,5-二磺苯基硫脲鈉結(jié)尾的樹狀聚合物的制備BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32將三氟乙酸(3ml)加入BHAlyslys2lys4lys8lys16DBL32(300mg；0.02mmol)的攪拌的無水二氯甲烷(3ml)懸液中，并將所得溶液在氮?dú)庀略谑覝財(cái)嚢?小時(shí)，然后濃縮。將殘余物溶于水并將該溶液通過Amberlite IRA 401(OH)柱，將濾液濃縮得到粘性油(187mg)。將該油溶于吡啶/水的1∶1混合物(8ml)中并加入固體3,5-二磺苯基異硫氰酸鈉(680mg；2mmol)。將所得溶液在氮?dú)庀略?3℃加熱3小時(shí)。然后濃縮該溶液得到白色固體殘余物。該粗產(chǎn)物用凝膠過濾法(交聯(lián)葡聚糖LH20；水)純化得到有64個(gè)3,5-二磺苯基脲鈉基團(tuán)的BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32，為白色松散固體。
實(shí)施例33以3,5-二羧苯基硫脲鈉結(jié)尾的樹狀聚合物的制備BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32將三氟乙酸(3ml)加入BHAlyslys2lys4lys8lys16DBL32(300mg；0.02mmol)的攪拌的無水二氯甲烷(3ml)懸液中，并將所得溶液在氮?dú)庀略谑覝財(cái)嚢?小時(shí)，然后濃縮。將殘余物溶于水并將該溶液通過Amberlite IRA 401(OH)柱，將濾液濃縮得到粘性油(186mg)。將該油溶于吡啶/水的1∶1混合物(8ml)中并加入3,5-二羧苯基異硫氰酸鈉(450mg；2mmol)。將所得溶液在氮?dú)庀略?3℃加熱13小時(shí)。然后濃縮該溶液得到白色固體殘余物。該粗產(chǎn)物用凝膠過濾法(交聯(lián)葡聚糖LH20；水)純化得到有64個(gè)3,6-二羧苯基脲鈉基團(tuán)的BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32，為白色松散固體。
實(shí)施例34以4-膦酰氧基苯基硫脲鈉結(jié)尾的樹狀聚合物的制備BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32將三氟乙酸(2ml)加入BHAlyslys2lys4lys8lys16DBL32(147mg；0.01mmol)的攪拌的無水二氯甲烷(2ml)懸液中，并將所得溶液在氮?dú)庀略谑覝財(cái)嚢?小時(shí)，然后濃縮得到粘性油。將該油溶于N,N-二甲基-N-烯丙胺緩沖液(pH9.5；5ml)中并加入固體4-膦酰氧基苯基異硫氰酸鹽(250mg)。用1M碳酸鈉將所得溶液的pH調(diào)節(jié)到10，并將該混合物在氮?dú)庀略?3℃加熱3小時(shí)。濃縮該溶液得到白色固體殘余物。將殘余物再次溶于水并將該溶液通過Amberlite IR 120(Na)柱，濃縮濾液。殘余物用凝膠過濾法(交聯(lián)葡聚糖LH20；水)純化得到有64個(gè)4-膦酰氧基苯基脲鈉基團(tuán)的BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32，為白色松散固體(150mg)。
實(shí)施例35以4-膦酰苯基硫脲鈉結(jié)尾的樹狀聚合物的制備BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32將三氟乙酸(2ml)加入BHAlyslys2lys4lys8lys16DBL32(147mg；0.01mmol)的攪拌的無水二氯甲烷(2ml)懸液中，并將所得溶液在氮?dú)庀略谑覝財(cái)嚢?小時(shí)，然后濃縮得到粘性油。將該油溶于N,N-二甲基-N-烯丙胺緩沖液(pH9.5；5ml)中并加入固體4-膦酰苯基異硫氰酸鹽(250mg)。用飽和碳酸氫鈉溶液將所得溶液的pH調(diào)節(jié)到9，并將該混合物在氮?dú)庀略?3℃加熱3小時(shí)。濃縮該溶液得到白色固體殘余物。將殘余物再次溶于水并將該溶液通過Amberlite IR 120(Na)柱，濃縮濾液。殘余物用凝膠過濾法(交聯(lián)葡聚糖LH20；水)純化得到有64個(gè)4-膦酰苯基脲鈉基團(tuán)的BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32BRI6196，冷凍干燥后為白色松散固體(152mg)。
實(shí)施例36以4,6-二膦酰萘基硫脲鈉結(jié)尾的樹狀聚合物的制備PAMAM4.0將4,6-二膦酰萘基異硫氰酸鈉(165mg)的水溶液(2ml)加入PAMAM4.0(51mg；0.01mmol)的水(2ml)溶液中。用飽和碳酸氫鈉溶液將該混合物的pH調(diào)節(jié)到9.5，并將該混合物在室溫下用力攪拌1小時(shí)，然后在氮?dú)庀略?3℃加熱3小時(shí)。將該混合物過濾，將濾液濃縮得到棕色固體殘余物。粗產(chǎn)物用凝膠過濾法(交聯(lián)葡聚糖G25；水)純化得到以24個(gè)4,6-二膦酰萘基硫脲鈉基團(tuán)結(jié)尾的PAMAM4.0，冷凍干燥后為棕色固體(81mg)。
實(shí)施例37以熒光素硫脲結(jié)尾的樹狀聚合物的制備PAMAM4.0(EDA)將固體熒光素異硫氰酸鹽(188mg)加入PAMAM4.0(EDA)(74mg；0.01mmol)的水(3ml)溶液中。加入飽和碳酸氫鈉溶液將pH調(diào)節(jié)到9，并將所得均質(zhì)溶液在室溫下攪拌過夜，然后濃縮。橙色殘余物用凝膠過濾法(交聯(lián)葡聚糖LH20；水)純化得到以21個(gè)熒光素硫脲基團(tuán)結(jié)尾的PAMAM4.0(EDA)，冷凍干燥后為松散的橙色固體(193mg)。
實(shí)施例38以(苯基-3-硼酸)-硫脲鈉結(jié)尾的樹狀聚合物的制備PAMAM4.0(EDA)將固體(苯基-3-硼酸)異硫氰酸鹽(100mg；0.5mmol)加入PAMAM4.0(EDA)(69mg；0.01mmol)的水(5ml)溶液中。將1M碳酸鈉加入到溶解的異硫氰酸鹽中(pH約10)。然后該混合物在氮?dú)庀略?3℃加熱2小時(shí)，之后過濾并將濾液濃縮得到棕色固體殘余物。該粗產(chǎn)物用凝膠過濾法(交聯(lián)葡聚糖LH20；水)純化得到以32個(gè)(苯基-3-硼酸)硫脲基團(tuán)結(jié)尾的PAMAM4.0(EDA)，冷凍干燥后為白色松散固體(87mg)。
實(shí)施例39以3,5-二羧苯基硫脲鈉結(jié)尾的聚賴氨酸的制備。
將聚-L-賴氨酸氫溴化物(4-15K)(Sigma化學(xué)公司)(50mg)的水(2ml)溶液加入3,5-二羧苯基異硫氰酸鈉(305mg)的水(3ml)溶液中，用碳酸氫鈉水溶液將所得溶液的pH調(diào)節(jié)到9。然后將該溶液在氮?dú)庀略?3℃加熱4小時(shí)。將該溶液冷卻并過濾，濾液濃縮得到米色固體殘余物。該粗產(chǎn)物用凝膠過濾法(交聯(lián)葡聚糖LH20；水)純化并冷凍干燥得到以3,5-二羧苯基硫脲鈉結(jié)尾的聚-L-賴氨酸，為白色松散固體(71mg)。
實(shí)施例40以4-(膦酰甲基)苯基硫脲鈉結(jié)尾的聚賴氨酸的制備。
將固體4-(膦酰甲基)苯基異硫氰酸鹽(231mg；1.0mmol)加入聚-L-賴氨酸氫溴化物(30-70K)(Sigma化學(xué)公司)(50mg)在吡啶/水的1∶1混合物中的溶液中。用1M碳酸鈉將該混合物的pH調(diào)節(jié)到9.5并將該溶液在氮?dú)庀略?3℃加熱過夜。將該混合物冷卻并過濾，濾液濃縮得到棕色固體殘余物。該粗產(chǎn)物用凝膠過濾法(交聯(lián)葡聚糖LH20；水)純化得到棕色固體(82mg)。
實(shí)施例41以1-膦酰-氧苯基-4-硫脲結(jié)尾的聚-L-賴氨酸的制備。
向在53℃加熱并攪拌的聚-L-賴氨酸氫溴化物(50mg,SigmaP2636,30-70千道爾頓)的水(10ml)溶液中加入4-膦酰氧基苯基異硫氰酸鹽(153mg)，并用1M碳酸鈉溶液將該混合物的pH調(diào)節(jié)到9.5-10。該混合物在53℃加熱并攪拌5小時(shí)，然后過濾。澄清溶液用交聯(lián)葡聚糖LH20凝膠過濾法純化，用水洗脫。洗脫液冷凍干燥得到白色泡沫產(chǎn)物。77mg。94％。
實(shí)施例42以苯甲酰氨基-4-硼酸結(jié)尾的聚-L-賴氨酸的制備。
在惰性氣氛下，向聚-L-賴氨酸氫溴化物(50mg,Sigma P2636,30-70千道爾頓)的DMSO(10ml)溶液中加入4-羧苯基硼酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(90mg)和1M碳酸鈉溶液(2ml)，該混合物在20℃攪拌60小時(shí)。真空除去溶劑，將殘余物溶于水(5ml)并過濾。澄清溶液用交聯(lián)葡聚糖LH20凝膠過濾法純化，用水洗脫。洗脫液冷凍干燥得到白色泡沫產(chǎn)物。50mg。90％。
實(shí)施例43Ⅰ．尿囊絨膜(CAM)測定本試驗(yàn)中使用最初由Folkman(1985)描述并由Maragoudakis等人(1988)加以改進(jìn)的體內(nèi)CAM血管生成模型。簡言之，當(dāng)在接觸CAM的卵殼上打開一個(gè)小口時(shí)，將新鮮的受精卵在37℃下培養(yǎng)4天。將此開口用玻璃紙帶覆蓋并將該卵放回到孵化箱中直到第9天應(yīng)用受試化合物時(shí)為止。將該受試化合物置于無菌塑料盤(10mm)上并使之在無菌條件下干燥。將對照盤(含有PBS)置于距離含有受試物質(zhì)的盤1cm遠(yuǎn)的CAM上。在所有盤中均加入醋酸可的松的無菌溶液(100ug/盤，Sigma)以防止炎性應(yīng)答。將加載并干燥后的盤反轉(zhuǎn)并置于CAM上，將開口覆蓋并培養(yǎng)這些卵直到第11天評定血管生成。CAM測定中血管生成的形態(tài)學(xué)評估如上處理這些卵以進(jìn)行形態(tài)學(xué)評估。第11天時(shí)，將這些卵注滿10％緩沖的福爾馬林(Janssen Chimica,Geel,Belguim)，除去塑料盤并使這些卵在室溫下保持至少4小時(shí)。將盤周圍的大部分面積切去并置于玻璃載片上，用Harris-Hooker等人(1983)的方法測定血管密度指數(shù)(表示成血管數(shù))。Ⅱ．大鼠主動(dòng)脈測定本試驗(yàn)中使用由Nicosia等人(1990)最初描述的大鼠主動(dòng)脈環(huán)模型。簡言之，將瓊脂糖的1.5％無菌溶液(Pharmacia Biotech AB.Upppsala,Sweden)倒入培養(yǎng)皿中并使之成凝膠狀。在瓊脂糖凝膠中沖壓出兩個(gè)直徑分別為10和17mm的同心圈，從而得到瓊脂糖環(huán)。將這些環(huán)內(nèi)外多余的瓊脂糖除去。將這些環(huán)轉(zhuǎn)移到6孔平板(Nuncion,Roskilde，丹麥)上，每孔中含有三個(gè)環(huán)。從3月齡的雄性Wistar大鼠得到胸主動(dòng)脈。將這些主動(dòng)脈立即轉(zhuǎn)移到含有無血清最低必需培養(yǎng)液(MEM)的培養(yǎng)盤中。仔細(xì)地除去主動(dòng)脈周圍的纖維脂肪性組織以損害主動(dòng)脈壁。切取主動(dòng)脈環(huán)薄片(0.5mm厚)并用無血清培養(yǎng)基連續(xù)徹底沖洗12次。在將這些主動(dòng)脈環(huán)轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基環(huán)中之前，將每個(gè)瓊脂糖孔的底部涂上150ul凝固纖維蛋白原。當(dāng)纖維蛋白凝膠形成后，將主動(dòng)脈環(huán)轉(zhuǎn)移到瓊脂糖孔中并置于瓊脂糖孔的中心。然后將瓊脂糖孔完全填充上凝固纖維蛋白原。將部分純化的牛纖維蛋白原(Sigma)溶于無血清培養(yǎng)基中使?jié)舛葹?mg/ml。將20ul 50μl/ml的牛凝血酶溶液(Sigma)加入到1ml纖維蛋白原溶液中使產(chǎn)生凝固。在室溫下在30秒內(nèi)形成纖維蛋白凝膠。當(dāng)纖維蛋白凝膠化后，向6孔板的每孔中加入6ml添加有20％FCS(Gibco)、10mM Hepes(Gibco)和1mM L-谷酰胺(Gibco)的MEM培養(yǎng)液，并將合適濃度的受試化合物加入該培養(yǎng)液中。大鼠主動(dòng)脈環(huán)測定中血管生成的定量每日在倒置顯微鏡下檢查培養(yǎng)物并記分。用微脈管生長曲線代表微脈管的生長。由于微脈管網(wǎng)絡(luò)的空間復(fù)雜性，通常有200-250個(gè)以上的微脈管形成(Nicosia等人，1990)。對微脈管進(jìn)行計(jì)數(shù)的觀測者的誤差范圍較高，因此，所形成的微脈管分為0(無脈管)到10(最多的脈管數(shù))級打分。結(jié)果Ⅰ．CAM測定
已評估了更高濃度(50μg/cam)的BRI2995和BRI6112:BRI2995使50％胚胎死亡。存活的胚胎顯示脈管密度的抑制為73％。BRI6112在這一濃度未發(fā)現(xiàn)毒性。但僅觀測到對脈管密度的輕微抑制(-16％)。
試驗(yàn)中用TNP-470(50μ/cam)和戊聚糖多硫酸酯(PPS)(50μg)這兩種用于臨床試驗(yàn)的化合物作為對照化合物。它們使脈管密度分別降低了21％±16和42％±28。不過PPS在這一濃度導(dǎo)致80％胚胎死亡。Ⅱ．大鼠主動(dòng)脈測定BRI2995,BRI2996和BRI2999在20μg/ml和100μg/ml的濃度下(幾乎)完全抑制了微脈管的形成。
BRI6196在20μg/ml和100μg/ml濃度下近似完全抑制，且在4μg/ml也有抑制作用。
BRI2923和BRI6039在100μg/ml濃度下減少了微脈管的生長。
參考文獻(xiàn)1．Folkman J.(1985)生物化學(xué)雜志267:10931-10934。2．Harris-Hooker S.A.等人(1983)細(xì)胞生理學(xué)雜志114:302-310。3．Hasegawa A.等人(1986)糖類化學(xué)雜志5(1):11-19。4．Maragoudakis M.E.等人(1988)組織細(xì)胞20:531-539。5．Nicosia R.F.和Ottinetti A.(1990)細(xì)胞生物學(xué)研究(Cell Dev.Bio.)26:119-128。6．Sabesan S.(1994)生物有機(jī)與醫(yī)藥化學(xué)快報(bào)4(20):2457-2460。
權(quán)利要求
1．預(yù)防性或治療性抑制人或非人動(dòng)物患者血管生成的方法，它包含給予該患者有效量的選自下列的化合物ⅰ．具有多個(gè)側(cè)鏈基團(tuán)的直鏈非糖類聚合物，其中所述側(cè)鏈基團(tuán)中至少有一個(gè)具有鍵合或連接其上的含有陰離子或陽離子的部分；和ⅱ．具有多個(gè)端基的樹狀聚合物，其中所述端基中至少有一個(gè)具有鍵合或連接其上的含有陰離子或陽離子的部分。
2．按照權(quán)利要求1的方法，其中所述化合物為通式Ⅰ的直鏈多離子
R是形成直鏈聚合物骨架的非糖類單體單元；X是非必需的單體單元R的側(cè)鏈基團(tuán)上的連接基；和A是含有陰離子的部分。
3．按照權(quán)利要求2的方法，其中所述直鏈聚合物的分子量分布的中值范圍是1,000-1,000,000。
4．按照權(quán)利要求3的方法，其中所述直鏈聚合物的分子量分布的中值范圍是10,000-600,000。
5．按照權(quán)利要求2的方法，其中在所述直鏈聚合物中所述單體單元R是胺或酰胺部分。
6．按照權(quán)利要求5的方法，其中在所述直鏈聚合物中所述單體單元R是賴氨酸或其他氨基酸部分。
7．按照權(quán)利要求2的方法，其中在所述直鏈聚合物中所述連接基X，當(dāng)存在時(shí)，是選自下列組成的官能連接基酯，酰胺，醚，硫醚，胺，脲，硫脲，甲氨酸酯和碳酸酯。
8．按照權(quán)利要求2的方法，其中在所述直鏈聚合物中所述連接基X，當(dāng)存在時(shí)，是選自下列組成的間隔基可選為取代的或分支的烷基鏈；可選被取代的烷氧基、聚烷氧基、烷硫基或聚烷硫基鏈，可選被取代的鏈烯基、多鏈烯基、炔基或多炔基鏈，和式-(CH2)n-2-(CH2)n-基團(tuán)，其中C是-CH2-,-CH=CH-,-C≡C-,-O-或-S-，而n是1-15的整數(shù)。
9．按照權(quán)利要求1的方法，其中所述化合物是樹狀化合物，它包含一個(gè)共價(jià)鍵合到至少兩個(gè)樹狀分支上的多價(jià)核心，并通過至少兩個(gè)生長支擴(kuò)展。
10．按照權(quán)利要求9的方法，其中所述樹狀聚合物是基于氨核心的聚酰氨基胺樹狀聚合物。
11．按照權(quán)利要求9的方法，其中所述樹狀聚合物是基于乙二胺核心的聚酰氨基胺樹狀聚合物。
12．按照權(quán)利要求9的方法，其中所述樹狀聚合物是基于二苯甲基胺或其他合適核心的聚賴氨酸樹狀聚合物。
13．按照權(quán)利要求9的方法，其中所述化合物是通式Ⅱ的多離子樹狀聚合物
其中I是起始核心；Z是內(nèi)部分支單元；n是整數(shù)，它表示生成的樹狀聚合物的數(shù)目；和A是含有陰離子的部分，它可以通過非必需的連接基X連接到內(nèi)部分支單元Z上。
14．按照權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)所述的方法，其中在所述化合物中所述含有陰離子或陽離子的部分通過酰胺或硫脲鍵而鍵合到直鏈聚合物或樹狀聚合物的胺、巰基、羥基或其他活性官能側(cè)鏈或端基上。
15．按照權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)所述的方法，其中在所述化合物中所述含有陰離子的部分選自下列成員含有磺酸的部分，含有羧酸的部分(包括含有神經(jīng)氨酸和唾液酸的部分和含有修飾的神經(jīng)氨酸和唾液酸的部分)，含有硼酸的部分，以及含有磷酸和膦酸的部分(包括含有酯化磷酸和膦酸的部分)。
16．按照權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)所述的方法，其中在所述化合物中鍵合到直鏈聚合物或樹狀聚合物的氨基或其他活性官能側(cè)鏈或端基上的部分選自以下基團(tuán)，其中n為0或正整數(shù)
-ArXP(=O)(OR)2X=O,CH2,CHF,CF2R=烷基，芳基H,Na-ArXP(=O)(OR1)(NR2R3)X=O,CH2,CHF,CF2R1=烷基，芳基H,Na R2,R3=烷基，芳基-Ar[P(=O)(OR)2]nR=烷基，芳基H,Na n=1-3-Ar[B(OH)2]nn=1-3-Ar[COOH]nn=1-3
17．按照權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述化合物選自下列成員Ⅰ．以4-磺苯基硫脲結(jié)尾的聚-L-賴氨酸；ⅱ．以3,6-二磺萘基硫脲結(jié)尾的聚-L-賴氨酸；ⅲ．以(8-辛酰氨基)-5-乙酰氨基-3,5-二脫氧-2-硫代-D-甘油基-α-D-半乳糖-2-nonulo吡喃糖苷酸結(jié)尾的聚-L-賴氨酸；ⅳ．以3,5-二羧苯基硫脲結(jié)尾的聚-L-賴氨酸；ⅴ．以4-(膦酰甲基)苯基硫脲結(jié)尾的聚-L-賴氨酸；ⅵ．以1-膦酰氧苯基-4-硫脲結(jié)尾的聚-L-賴氨酸；和ⅶ．以苯甲酰氨基-4-硼酸結(jié)尾的聚-L-賴氨酸。
18．按照權(quán)利要求1或權(quán)利要求9的方法，其中所述化合物選自下列成員Ⅰ．以烷基磺酸結(jié)尾的樹狀聚合物；ⅱ．以磺乙酰胺結(jié)尾的樹狀聚合物；ⅲ．以磺基琥珀酰胺酸結(jié)尾的樹狀聚合物；ⅳ．以N-(2-磺乙基)琥珀酰胺結(jié)尾的樹狀聚合物；ⅴ．以4-磺苯基硫脲結(jié)尾的樹狀聚合物；ⅵ．以3,6-二磺萘基硫脲結(jié)尾的樹狀聚合物；ⅶ．以4-磺萘基硫脲結(jié)尾的樹狀聚合物；ⅷ．以3,5-二磺苯基硫脲結(jié)尾的樹狀聚合物；ⅸ．以3,6,8-三磺萘基硫脲結(jié)尾的樹狀聚合物；ⅹ．以4-(磺甲基)苯甲酰胺結(jié)尾的樹狀聚合物；ⅹⅰ．以4-磺基苯甲酰胺結(jié)尾的樹狀聚合物；ⅹⅱ．以N-(4-磺苯基)丙酰胺結(jié)尾的樹狀聚合物；ⅹⅲ．以4-磺苯基脲結(jié)尾的樹狀聚合物；ⅹⅳ．以N,N,N-三甲基甘氨酰胺結(jié)尾的樹狀聚合物；ⅹⅴ．以4-三甲銨苯甲酰胺結(jié)尾的樹狀聚合物；ⅹⅵ．以4-(三甲銨甲基)苯甲酰胺結(jié)尾的樹狀聚合物；ⅹⅶ．以N-(2-乙酰氧基乙基)-N,N-(二甲銨)甲基羧酰胺結(jié)尾的樹狀聚合物；ⅹⅷ．以胍基結(jié)尾的樹狀聚合物；ⅹ?、?-([1,4,8,11-四氮雜環(huán)十四烷]甲基)苯甲酰胺結(jié)尾的樹狀聚合物；ⅹⅹ．以4-羧基-3-羥基-芐胺結(jié)尾的樹狀聚合物；ⅹⅹⅰ．以4-羧苯基酰胺結(jié)尾的樹狀聚合物；ⅹⅹⅱ．以3,5-二羧苯基酰胺結(jié)尾的樹狀聚合物；ⅹⅹⅲ．以4-膦酰氧基苯基硫脲結(jié)尾的樹狀聚合物；ⅹⅹⅳ．以4-(膦酰甲基)苯基硫脲結(jié)尾的樹狀聚合物；ⅹⅹⅴ．以乙基-4-(膦酰甲基)苯基硫脲結(jié)尾的樹狀聚合物；ⅹⅹⅵ．以(8-辛酰氨基)-5-乙酰氨基-3,5-二脫氧-2-硫代-D-甘油基-α-D-半乳糖-2-nonulo吡喃糖苷酸結(jié)尾的樹狀聚合物；ⅹⅹⅷ．以(11-十一酰氨基)-5-乙酰氨基-3,5-二脫氧-2-硫代-D-甘油基-α-D-半乳糖-2-nonulo吡喃糖苷酸結(jié)尾的樹狀聚合物；ⅹⅹⅷ．以(乙酰氨基)-5-乙酰氨基-3,5-二脫氧-2-硫代-D-甘油基-α-D-半乳糖-2-nonulo吡喃糖苷酸結(jié)尾的樹狀聚合物；ⅹⅹ?、?4-丁酰氨基)-5-乙酰氨基-3,5-二脫氧-2-硫代-D-甘油基-α-D-半乳糖-2-nonulo吡喃糖苷酸結(jié)尾的樹狀聚合物；ⅹⅹⅹ．以(4-甲基苯甲酰氨基)-5-乙酰氨基-3,5-二脫氧-2-硫代-D-甘油基-α-D-半乳糖-2-nonulo吡喃糖苷酸結(jié)尾的樹狀聚合物；ⅹⅹⅹ?。?8-辛酰氨基)-4-疊氮基-5-乙酰氨基-3,4,5-三脫氧-2-硫代-D-甘油基-α-D-半乳糖-2-nonulo吡喃糖苷酸結(jié)尾的樹狀聚合物；ⅹⅹⅹⅱ．以(8-辛酰氨基)-4-氨基-5-乙酰氨基-3,4,5-三脫氧-2-硫代-D-甘油基-α-D-半乳糖-2-nonulo吡喃糖苷酸結(jié)尾的樹狀聚合物；ⅹⅹⅹⅲ．以4-苯甲酰氨基硼酸結(jié)尾的樹狀聚合物；ⅹⅹⅹⅳ．以3,5-二羧苯基硫脲結(jié)尾的樹狀聚合物；ⅹⅹⅹⅴ．以4-膦酰苯基硫脲結(jié)尾的樹狀聚合物；ⅹⅹⅹⅵ．以4,6-二膦酰萘基硫脲結(jié)尾的樹狀聚合物；ⅹⅹⅹⅶ．以熒光素硫脲結(jié)尾的樹狀聚合物；和ⅹⅹⅹⅷ．以(苯基-3-硼酸)硫脲結(jié)尾的樹狀聚合物。
19．按照權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)所述的方法，其中所述治療包含抑制病人的血管生成，慢性炎癥、糖尿病性視網(wǎng)膜病、銀屑病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及涉及新血管的生長的其他疾病的治療，通過抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖而預(yù)防再狹窄，通過激活儲存在胞外基質(zhì)中的活性生長因子的釋放而促進(jìn)傷口愈合，以及通過抑制血管生成而抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。
20．用于預(yù)防性或治療性抑制人或非人動(dòng)物血管生成的藥物或獸醫(yī)組合物，它包含如權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)所定義的陰離子或陽離子直鏈聚合物或樹狀聚合物，以及至少一種藥學(xué)上或獸醫(yī)可接受的載體或稀釋劑。
21．如權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)所定義的陰離子或陽離子直鏈聚合物或樹狀聚合物在人或非人動(dòng)物的血管生成的預(yù)防性或治療性抑制中，或在用于人或非人動(dòng)物的血管生成的預(yù)防性或治療性抑制的藥劑的制備中的應(yīng)用。
22．一種化合物，它包含具有多個(gè)端基的樹狀聚合物，其中所述端基中至少有一個(gè)具有鍵合或連接其上的含有陰離子的部分，所述含有陰離子的部分選自下列成員Ⅰ．含有神經(jīng)氨酸和唾液酸的部分，而不是2-硫代唾液酸；ⅱ．含有修飾的神經(jīng)氨酸和唾液酸的部分；ⅲ．含有硼酸的部分；和ⅳ．含有磷酸和膦酸的部分，包括含有酯化磷酸和膦酸的部分。
23．按照權(quán)利要求22的化合物，其中所述樹狀聚合物包含一個(gè)共價(jià)鍵合到至少兩個(gè)樹狀分支上的多價(jià)核心，并通過至少兩個(gè)生長支擴(kuò)展。
24．按照權(quán)利要求22或23的化合物，其中所述樹狀聚合物是基于氨核心的聚酰氨基胺樹狀聚合物。
25．按照權(quán)利要求22或23的化合物，其中所述樹狀聚合物是基于乙二胺核心的聚酰氨基胺樹狀聚合物。
26．按照權(quán)利要求22或23的化合物，其中所述樹狀聚合物是基于二苯甲基胺或其他合適核心的聚賴氨酸樹狀聚合物。
27．按照權(quán)利要求22-28任一項(xiàng)所述的化合物，其中所述含有陰離子的部分通過酰胺或硫脲鍵而鍵合到所述樹狀聚合物的末端胺、巰基、羥基或其他活性官能端基上。
28．按照權(quán)利要求22的化合物，它選自下列成員Ⅰ．以4-膦酰氧基苯基硫脲結(jié)尾的樹狀聚合物；ⅱ．以4-(膦酰甲基)苯基硫脲結(jié)尾的樹狀聚合物；ⅲ．以乙基-4-(膦酰甲基)苯基硫脲結(jié)尾的樹狀聚合物；ⅳ．以(8-辛酰氨基)-5-乙酰氨基-3,5-二脫氧-2-硫代-D-甘油基-α-D-半乳糖-2-nonulo吡喃糖苷酸結(jié)尾的樹狀聚合物；ⅴ．以(11-十一酰氨基)-5-乙酰氨基-3,5-二脫氧-2-硫代-D-甘油基-α-D-半乳糖-2-nonulo吡喃糖苷酸結(jié)尾的樹狀聚合物；ⅵ．以(乙酰氨基)-5-乙酰氨基-3,5-二脫氧-2-硫代-D-甘油基-α-D-半乳糖-2-nonulo吡喃糖苷酸結(jié)尾的樹狀聚合物；ⅶ．以(4-丁酰氨基)-5-乙酰氨基-3,5-二脫氧-2-硫代-D-甘油基-α-D-半乳糖-2-nonulo吡喃糖苷酸結(jié)尾的樹狀聚合物；ⅷ．以(4-甲基苯甲酰氨基)-5-乙酰氨基-3,5-二脫氧-2-硫代-D-甘油基-α-D-半乳糖-2-nonulo吡喃糖苷酸結(jié)尾的樹狀聚合物；ⅸ．以(8-辛酰氨基)-4-疊氮基-5-乙酰氨基-3,4,5-三脫氧-2-硫代-D-甘油基-α-D-半乳糖-2-nonulo吡喃糖苷酸結(jié)尾的樹狀聚合物；ⅹ．以(8-辛酰氨基)-4-氨基-5-乙酰氨基-3,4,5-三脫氧-2-硫代-D-甘油基-α-D-半乳糖-2-nonulo吡喃糖苷酸結(jié)尾的樹狀聚合物；ⅹ?。?-苯甲?；鹚峤Y(jié)尾的樹狀聚合物；ⅹⅱ．以4-膦酰苯基硫脲結(jié)尾的樹狀聚合物；ⅹⅲ．以4,6-二膦酰萘基硫脲結(jié)尾的樹狀聚合物；和ⅹⅳ．以(苯基-3-硼酸)-硫脲結(jié)尾的樹狀聚合物。
全文摘要
預(yù)防性或治療性抑制人或非人類動(dòng)物患者血管生成的方法,它包括給予該患者有效量的化合物,其選自:(i)有多個(gè)側(cè)鏈基團(tuán)的直鏈非糖類聚合物,其中至少有一個(gè)側(cè)鏈基團(tuán)具有鍵合或連接其上的含有陰離子或陽離子的部分;和(ii)具有多個(gè)端基的樹狀聚合物,其中至少有一個(gè)端基具有鍵合或連接其上的含有陰離子或陽離子的部分。
文檔編號A61P17/02GK1225654SQ97196452
公開日1999年8月11日 申請日期1997年7月17日 優(yōu)先權(quán)日1996年7月17日
發(fā)明者B·R·瑪蘇斯, G·浩蘭 申請人:生物分子研究所