專利名稱：血根堿制備腫瘤放射治療增敏藥物的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于放療增敏藥物領(lǐng)域，涉及血根堿的一種新用途，具體涉及血根堿制備 腫瘤放射治療增敏藥物的應用。
背景技術(shù)：
宮頸癌是全球婦女惡性腫瘤中僅次于乳腺癌的第二位常見腫瘤。目前全球?qū)m頸癌 每年新增病例49萬人，死亡病例27萬人，其中80%來自于發(fā)展中國家，中國就占到三分之 一。宮頸癌是我國高發(fā)的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，在許多城市宮頸癌發(fā)病率在腫瘤中排在 第一位，雖總體發(fā)病率比20年前有所下降，但卻呈現(xiàn)出十分明顯的低齡化趨勢。現(xiàn)在臨床 上的宮頸癌患者中，40至50歲人群占了約60%。其次就是30至40歲人群，所占比例超過 30%。宮頸癌治療原則是既要提高患者的生存率，又要改善其生存質(zhì)量。治療的趨勢是 采用多種手段的綜合治療。目前，用于宮頸癌治療的主要手段包括手術(shù)、放射治療(放療)、 化學藥物治療(化療)、生物治療、內(nèi)分泌治療、中醫(yī)中藥治療、熱療和射頻消融治療等。而 宮頸癌的放療目前是宮頸癌的基本治療方法之一。放療包括外照射及腔內(nèi)照射兩部分，各 期宮頸癌均可放療，但I期及II a期以手術(shù)治療為主。II b期及以后各期則以放療為主。早 期病例以腔內(nèi)放療為主，體外放療為輔；中期病例內(nèi)外各半；晚期病例則以體外放療為主， 腔內(nèi)放療為輔。腔內(nèi)放療的目的是控制局部病灶；體外放療則用以治療盆腔淋巴結(jié)及宮頸 旁組織等處的病灶。由于高分化鱗癌、腺癌、粘液腺癌等宮頸腺癌對放療不敏感，尋找新的 抗宮頸癌藥物以及增加宮頸癌細胞對放療敏感性的放療增敏藥研究是當今宮頸癌化療和 放療的熱門課題和主要的研究方向。IfiI 卞艮 M (sanguinarine, SAN, 3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2, 5-diphenyl-tetrazolium bromide)來源于罌粟科植物博落回的果實，早期的研究發(fā)現(xiàn)血 根堿具有抗炎、抗菌、抗氧化并對中樞神經(jīng)有麻醉作用，最近的研究表明血根堿在人類上皮 癌(A431)，前列腺癌(LNCaP)，人黑色素瘤(M4Beu)，結(jié)腸腺癌(DLD-I)，肺癌非小細胞癌 (A549)等細胞株中均有抑制腫瘤細胞生長和轉(zhuǎn)移、誘導細胞凋亡和引起細胞周期阻滯等作 用，但同等劑量對正常的人上皮細胞(NEEKs)則未見任何影響，表明血根堿可能具有選擇 性抗腫瘤的功效。目前，國外缺乏對血根堿在宮頸癌中作用的系統(tǒng)研究，國內(nèi)此項工作尚未開展，并 且國內(nèi)外未見關(guān)于血根堿放療增敏方面的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供血根堿的一種新用途，即血根堿制備腫瘤放射治療增敏藥物的應用。為達到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是血根堿在制備腫瘤放射治療增敏藥 物中的應用。
本發(fā)明同時要求保護一種放療增敏藥物，所述放療增敏藥物的活性成分包括血根 堿。本發(fā)明還提供了一種應用血根堿增強腫瘤細胞對放療敏感性的方法，放療前用血 根堿處理腫瘤細胞，然后進行放療。上述技術(shù)方案中，用血根堿處理腫瘤細胞具體地用低劑量0. 5 1. 5 μ mol/L的血 根堿處理腫瘤細胞4 48h。上述技術(shù)方案中，所述放射治療增敏藥物可通過注射、噴射、滲透、吸收、物理或化 學介導的方法導入機體如肌肉、皮內(nèi)、皮下、靜脈、粘膜組織；或是被其他物質(zhì)混合或包裹后 導入機體。以血根堿為活性成分的放射治療增敏藥物，需要的時候，所述放射治療增敏藥物 還包括一種以上(包括一種)藥學上可接受的添加劑，所述添加劑包括藥學領(lǐng)域常規(guī)的稀 釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑寸。所述放射治療增敏藥物可以制備成注射液、片劑、粉劑、顆粒劑、膠囊、口服液、膏 劑、霜劑等形式。上述各種劑型的藥物均可按照藥學領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。血根堿聯(lián)合放射治療的結(jié)果表明血根堿通過抑制宮頸癌細胞周期進程，從而增 加腫瘤細胞對放射治療的敏感性；同時，現(xiàn)已知腫瘤細胞主要是由于細胞周期破壞而導致 了細胞的失控性生長，因此，本發(fā)明所述血根堿以及所述包括血根堿的放射治療增敏藥物 在包括宮頸癌在內(nèi)的不同腫瘤放射治療前給藥可以提高腫瘤放射治療增敏性，從而提高放 射治療的治療效果。由于上述技術(shù)方案運用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點本發(fā)明所述血根堿以及包括血根堿的所述放射治療增敏劑具有抑制癌細胞周期 進程，增加腫瘤細胞對放射治療的敏感性的作用，因此，可以降低腫瘤病人的放射治療所需 的輻射照射劑量，降低放射治療所帶來的毒副作用，從而提高病人的生存質(zhì)量。


圖1為實施例二中血根堿處理后對受到照射的Hela細胞周期的影響曲線圖，其 中，G0/G1期與對照組相比，*p 0. 05 ；**ρ0· 01 ;#ρ 0. 05，##ρ0. 01 ；G2/M期與對照組相比 aP 0. 05 ;aap0. 01 ；與 3Gy、6Gy 和 9Gy 相比，b ρ 0. 05，bb ρ0· 01 ；S 期與對照組相比 +ρ0· 05 ； ++p0. 01 ；與 3Gy、6Gy 和 9Gy 相比，、0. 05，一p0. 01 ；Sub-Gl 與對照組相比 ep0. 05 ;ccp0. 01 ； 與 3Gy、6Gy 和 9Gy 相比，d ρ 0. 05，dd ρ0· 01 ；圖2為實施例三中血根堿對宮頸癌C33A細胞放射治療的影響曲線圖；圖3為實施例三中血根堿對宮頸癌HeLa細胞放射治療的影響曲線圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步描述材料人類宮頸癌細胞株HeLa、C33A購于美國細胞收藏中心(ATCC)，并由本實 驗室保存和培養(yǎng)；D-MEM培養(yǎng)基干粉，小牛血清，胰酶粉末購自Gibco公司。HEPES購自 Sigma(美國)；各種規(guī)格培養(yǎng)皿、96孔板、6孔板、各種規(guī)格離心管購自Fisher公司。噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMS0)、瓊脂糖、溴乙錠、溴酚蘭、吐溫-20(Tween-20)均為上海生物 技術(shù)科技有限公司。實施例一(1)細胞培養(yǎng)宮頸癌HeLa細胞培養(yǎng)于含10%小牛血清，谷氨酸胺及100萬U/L青 霉素和鏈霉素的D-EME培養(yǎng)基。細胞置于5% C02，37°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2-3天傳代1次， 取對數(shù)生長期細胞用于實驗。(2)用0. 25%的胰酶消化對數(shù)生長期的細胞，制備單細胞懸液，將5 X104/ml的 HeLa細胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔接種200 μ 1。在37°C、含5% CO2和飽和濕度條件培養(yǎng) 24小時后，加入濃度分別為0、0. 5、1、24Π3μπι01/1的血根堿，每一濃度設6個復孔。然后 在細胞繼續(xù)培養(yǎng)12、24、36、48和60小時后，加入20 μ L濃度為5mg/ml的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 小時后輕輕吸掉培養(yǎng)基。加入150 μ L的DMSO振蕩溶解10分鐘。在酶標儀上選取570nm 主波長和630nm參考波長測定吸光值，對照組細胞存活率設為100%，其余各組細胞存活率 =(各濃度組吸光值/對照組吸光值)X 100%。結(jié)果如表1所示MTT比色法顯示宮頸癌HeLa細胞經(jīng)血根堿處理24小時后細胞 生長出現(xiàn)明顯抑制，并顯現(xiàn)劑量依賴性和時間依賴性。表1.血根堿處理后的宮頸癌HeLa細胞的存活率呈濃度和劑量依賴 實施例二 按照實施例一中的方法培養(yǎng)細胞，然后將宮頸癌HeLa細胞接種于IOOmm培養(yǎng)瓶， 待貼壁后(待細胞長至60-70%左右)分別加入濃度為lymol/L血根堿處理24小時后，照 射細胞，所照劑量為3、6、9Gy收集各組細胞，采用1，800g離心速度離心5分鐘。棄去上清， 用Ix PBS緩沖液洗滌細胞1次，1，SOOg離心5分鐘，并收集細胞沉淀。細胞放置在冰上預 冷的70%乙醇固定4小時，離心后，以Ix PBS洗滌細胞兩次。離心后，懸浮細胞于500 μ L 含 300 μ g/mLRNase A 和 10 μ g/mL proteinase K(美國 Sigma Aldrich 公司)的 PI 溶液 中(10 μ g/mL)，30分鐘后，經(jīng)孔徑為53 μ m的尼龍濾網(wǎng)過濾，F(xiàn)ACS-Calibur流式細胞儀上 檢測分析。結(jié)果如圖1所示，血根堿處理誘導了劑量依賴性的G2/M期細胞周期阻滯，降低了 S 期細胞比例。但對G2/M期比例并沒有產(chǎn)生明顯影響。這些實驗結(jié)果說明血根堿可以誘導 宮頸癌細胞周期阻滯。隨著照射劑量的增加，宮頸癌HeLa細胞G0/G和S期比例下降，同時 出現(xiàn)明顯的G2/M期細胞阻滯?，F(xiàn)已知腫瘤細胞主要是由于細胞周期破壞而導致了細胞的 失控性生長，細胞周期阻滯是宮頸癌許多化療藥物和放射治療的重要作用機理之一。
實施例三按照實施例一中的方法培養(yǎng)細胞C33A，然后用0. 5 μ M血根堿處理24小時的細胞 接受不同劑量(0 IOGy)的χ-輻射照射，然后接種到IOOmm培養(yǎng)皿。連續(xù)培養(yǎng)三周后， 采用甲醇固定，加姬姆薩液染色30分鐘，流水洗凈，最后觀察和記錄含有> 50細胞的克隆 個數(shù)。采用克隆形成率(PE)=(對照組克隆數(shù)/實驗組細胞數(shù))X 100%公式計算克隆形 成率，采用存活分數(shù)=實驗組克隆形成率/對照組克隆形成率公式計算存活分數(shù)；其中，照射條件細胞置于直線加速器下，射線性質(zhì)為高能6兆伏X-線，照射野為 IOcmX 10cm，源皮距為100cm，劑量率為200cGy/min。照射時培養(yǎng)皿面上覆蓋1. 5cm厚等效 蠟板以調(diào)整照射劑量。圖2結(jié)果所示，與沒有血根堿24小時預處理細胞相比，不同的X _射線輻照在 0. 5 μ M血根堿(該濃度細胞存活率在90%以上，即為無毒性劑量)24小時預處理的C33A 細胞中導致更多的細胞死亡，IC5tl(殺死50%細胞的劑量)和IC9tl(殺死90%細胞的劑量) 在單獨χ -射線照射的C33A細胞分別為1. 2Gy和4. 2Gy，而IC50和IC90在血根堿24小時 預處理加χ -射線照射的C33A細胞則為0. 6Gy和2. OGy,即顯現(xiàn)兩倍以上的差異。按照上述方法，在另外一宮頸癌細胞HeLa，使用血根堿和發(fā)射治療聯(lián)合處理宮頸 癌細胞HeLa，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血根堿的放射治療增敏效果更加明顯(圖3)，IC50和IC9tl在單獨 X-射線照射的細胞分別為1. IGy和5. 6Gy，而IC5tl和IC9tl在血根堿24小時預處理加χ-射 線照射的HeLa細胞則為0. 4Gy和2. 4Gy，即顯現(xiàn)2. 5倍以上的差異。這些試驗結(jié)果表明血 根堿可增加宮頸癌細胞對χ-線輻射照射的放射敏感性。
權(quán)利要求
血根堿在制備腫瘤放射治療增敏藥物中的應用。
2.一種放療增敏藥物，其特征在于，所述放療增敏藥物的活性成分包括血根堿。
全文摘要
本發(fā)明屬于放療增敏藥物領(lǐng)域，涉及血根堿的一種新用途，具體涉及血根堿制備腫瘤放射治療增敏藥物的應用，本發(fā)明所述血根堿以及包括血根堿的所述放射治療增敏劑具有抑制癌細胞周期進程，增加腫瘤細胞對放射治療的敏感性的作用，因此，可以降低腫瘤病人的放射治療所需的輻射照射劑量，降低放射治療所帶來的毒副作用，從而提高病人的生存質(zhì)量。
文檔編號A61K31/4741GK101904849SQ20101025689
公開日2010年12月8日 申請日期2010年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月19日
發(fā)明者徐加英, 樊賽軍 申請人:蘇州大學