專利名稱：五環(huán)三萜類化合物在制備糖原磷酸化酶抑制劑中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及五環(huán)三萜類化合物在制備糖原磷酸化酶抑制劑中的應(yīng)用，包括制備抗糖尿病藥物上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
糖原是體內(nèi)糖的貯存形式，主要存在于肌肉和肝臟中。肌糖原降解可為肌肉自身收縮供給能量，肝糖原降解主要維持血糖濃度。
糖原的降解涉及糖原磷酸化酶(glycogen phosphorylase)。該酶催化糖原的磷酸解，產(chǎn)生的葡萄糖-1-磷酸在磷酸葡萄糖變位酶催化下轉(zhuǎn)變成葡萄糖-6-磷酸，后者或是進(jìn)入糖酵解反應(yīng)，或是在葡萄糖-6-磷酸酶催化下生成葡萄糖，進(jìn)入血液，為其它組織提供葡萄糖。由于糖原磷酸化酶是與糖代謝相關(guān)的能量代謝中的一個(gè)非常重要的因子，因此，對(duì)它的藥理性抑制有可能用于治療與糖原代謝異常(糖原過(guò)度降解)相關(guān)的病變，如糖尿病、心肌缺血損傷和腫瘤等。
糖尿病已成為嚴(yán)重威脅人類健康的常見病、多發(fā)病，其病理因素有很多，如肥胖所導(dǎo)致的胰島素抵抗等。糖尿病患者的肝臟葡萄糖生成的顯著增加是導(dǎo)致高血糖的另一個(gè)重要原因，尤其是對(duì)于那些由于焦慮和不良生活習(xí)慣(抽煙、酗酒等)所引起的高血糖癥患者和禁食后高血糖癥病人。因此，抑制肝臟葡萄糖生成已成為研制新型抗糖尿病藥物的重要靶標(biāo)之一(Kurukulasuriya，R.et.al.Current Medicinal Chemistry，2003，10，99)。目前，在臨床上使用的能夠抑制肝臟葡萄糖生成的藥物非常有限。對(duì)糖尿病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的研究表明，通過(guò)抑制肝臟糖原磷酸化酶，可有效地抑制肝臟糖原的過(guò)度降解，從而降低了肝臟葡萄糖生成以達(dá)到降低血糖功效。糖原磷酸化酶抑制劑用于治療2型糖尿病已受到了廣泛關(guān)注(Somsak，L.et.al.Current Pharmaceutical Design，2003，9，1177)。輝瑞和默克等制藥公司已展開了對(duì)此類藥物的研發(fā)工作，其中輝瑞公司的研發(fā)藥物(CP-368296)已進(jìn)入了II期臨床用以治療2型糖尿病，但該藥的缺點(diǎn)如選擇性差且生物利用度低等，限制了其在臨床上的應(yīng)用。
已報(bào)道的糖原磷酸化酶抑制劑包括葡萄糖衍生物(Somsak等，Current PharmaceuticalDesign，2003，9，1177-1189)、咖啡因及其它嘌呤衍生物(Kasvinsky等，Journal ofBiological Chemistry，1978，2533343-3351和9102-9106)、二氫吡啶衍生物BAY-R3401(Bergans等，Diabetes，2000，491419-1426)、羥基吡咯烷衍生物DAB(Mackay等，Diabetes，Obesity and Metabolism，2003，5397-407)、芳香二羧酸衍生物(Lu等，Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters，2003，134125-4128)和吲哚酰胺衍生物CP-368296(國(guó)際專利申請(qǐng)WO 96/39384)等。有關(guān)糖原磷酸化酶抑制劑的專利申請(qǐng)還包括WO 00/123347、WO 95/24391、WO 97/09040、WO 98/40353、WO 98/50359和WO 97/37901等。
五環(huán)三萜類化合物在植物界中的分布極為廣泛，是許多中草藥的主要有效成分。五環(huán)三萜類化合物按烷烴結(jié)構(gòu)骨架的不同主要可分為齊墩果烷型、熊果烷型和羽扇豆烷型等。迄今為止，發(fā)明人尚未見任何關(guān)于五環(huán)三萜類化合物具有糖原磷酸化酶抑制活性的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是研究五環(huán)三萜類化合物作為新型的糖原磷酸化酶抑制劑；尤其是研究五環(huán)三萜類糖原磷酸化酶抑制劑在制備抗糖尿病藥物上的應(yīng)用。
為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案。
下述式I和式II所示的五環(huán)三萜化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽或酯在制備抑制糖原磷酸化酶藥物中的應(yīng)用， 式I中，R1代表氫或羥基；R2代表氫、1～10個(gè)碳的直鏈或支鏈烷基、芐基；R3和R4分別代表氫或甲基，并且R3和R4不同時(shí)為氫；式II中，R5代表CH3、CH2OH、COOR6，這里R6代表氫、1～10個(gè)碳的直鏈或支鏈烷基、芐基。
所述五環(huán)三萜化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽或酯，式I中優(yōu)選，R2代表氫、1～6個(gè)碳的直鏈或支鏈烷基、芐基；式II中優(yōu)選，R6代表氫、1～6個(gè)碳的直鏈或支鏈烷基、芐基。
式I中更優(yōu)選，R2代表甲基、乙基、異丙基；式II中更優(yōu)選，R6代表甲基、乙基、異丙基。
前述五環(huán)三萜化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽或酯，其中式I所代表的化合物包括山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸、熊果酸及它們藥學(xué)上可接受的鹽或酯；式II所代表的化合物包括白樺脂醇、白樺脂酸、羽扇豆醇及它們藥學(xué)上可接受的鹽或酯。其中優(yōu)選式I所代表的化合物包括山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸、熊果酸及它們的甲酯、乙酯或芐酯；式II所代表的化合物包括白樺脂醇、白樺脂酸、羽扇豆醇及白樺脂酸的甲酯、乙酯或芐酯。
所述五環(huán)三萜化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽或酯在制備抑制糖原磷酸化酶藥物中的應(yīng)用，包括在制備抗糖尿病藥物上的應(yīng)用。
一種具有糖原磷酸化酶抑制作用的藥物組合物，含有前述五環(huán)三萜類化合物及其鹽或酯和藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的藥物組合物中，五環(huán)三萜類化合物選自山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸、熊果酸、白樺脂醇、白樺脂酸、羽扇豆醇或其藥學(xué)上可接受的鹽或酯。所述五環(huán)三萜類化合物可優(yōu)選山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸、熊果酸、白樺脂醇、白樺脂酸、羽扇豆醇或其藥學(xué)上可接受的甲酯、乙酯或芐酯。
本發(fā)明的藥物組合物，其抑制糖原磷酸化酶作用包括抗糖尿病作用。
上述五環(huán)三萜化合物的制備方法包括植物化學(xué)提取方法和半合成制備方法，并且，某些天然的五環(huán)三萜化合物已經(jīng)有大量的商品化供應(yīng)。例如，山楂酸主要存在于紅棗、油橄欖、山楂、石榴和鼠尾草中，國(guó)際專利申請(qǐng)WO 02/12159和WO 98/04331報(bào)道了從油橄欖中提取山楂酸的方法?？屏_索酸分布于大花紫薇(巴拿巴)、夏枯草、枇杷葉、沙棘葉、粗葉懸鉤子、紫蘇葉、番木瓜和厚皮香等植物中，美國(guó)專利申請(qǐng)US 2003/0165581報(bào)道了從夏枯草中提取制備科羅索酸的方法。本申請(qǐng)發(fā)明人的中國(guó)專利申請(qǐng)200410064929.7則采用如下反應(yīng)示意式1所示路線半合成制備了山楂酸、科羅索酸及其相關(guān)衍生物。
反應(yīng)示意式1 1b R3＝H，R4＝CH32b R3＝H，R4＝CH3 3a R3＝CH3，R4＝H科羅索酸R3＝CH3，R4＝H3b R3＝H，R4＝CH3山楂酸 R3＝H，R4＝CH3白樺脂醇在白樺樹的外皮中的含量非常高，可高達(dá)白樺樹外皮干重的20-30％。如反應(yīng)示意式2所示，本申請(qǐng)發(fā)明人把從白樺樹外皮中提取的白樺脂醇經(jīng)兩步反應(yīng)轉(zhuǎn)化為白樺脂酸(Kim等，Synthetic Communication，1997，271607-1612)。
反應(yīng)示意式2 齊墩果酸主要存在于女貞子、甜菜、楤木、木瓜等中草藥中，目前臨床上所用的齊墩果酸即是由女貞子中提取的，有商品化大量供應(yīng)(供應(yīng)廠商包括成都超人植化開發(fā)有限公司、云南云藥實(shí)驗(yàn)室有限公司、昆明同持醫(yī)藥研究有限公司、陜西省太白青峰公司天然植物藥提取廠和云南玉溪萬(wàn)方天然藥物有限公司等)，且價(jià)格低廉。熊果酸存在于女貞子和山茱萸等植物中，可通過(guò)植物化學(xué)提取獲得，并有商品化大量供應(yīng)(供應(yīng)廠商包括云南云藥實(shí)驗(yàn)室有限公司、陜西慧科植物開發(fā)有限公司和陜西新生植物開發(fā)有限公司等)。
除了上述化合物外，如通式I和II所示的其它五環(huán)三萜化合物可參照文獻(xiàn)方法(Honda等，Journal of Natural Product，1997，601174-1177；Lee等，Journal of Natural Product，1998，611343-1347)制備。
本發(fā)明對(duì)一系列天然的和合成的五環(huán)三萜化合物進(jìn)行了糖原磷酸化酶抑制活性的高通量篩選實(shí)驗(yàn)，結(jié)果首次發(fā)現(xiàn)了一些五環(huán)三萜化合物對(duì)糖原磷酸化酶具有顯著的抑制作用。本發(fā)明進(jìn)一步對(duì)部分五環(huán)三萜化合物進(jìn)行了糖尿病小鼠降血糖活性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，所試化合物對(duì)腎上腺素誘發(fā)的高血糖小鼠具有顯著的抑制血糖升高活性。
具體實(shí)施例方式
五環(huán)三萜類化合物的制備試劑及測(cè)試方法紅外光譜用NieoletImpact 410型IR光譜儀測(cè)定，KBr壓片；1HNMR和13CNMR用ACF-300(500)BRUK型核磁共振儀測(cè)定；MS用HP1100型質(zhì)譜儀測(cè)定。熊果酸(純度約95％)購(gòu)于陜西慧科植物開發(fā)有限公司；齊墩果酸(純度約97％)購(gòu)于成都超人植化開發(fā)有限公司；白樺樹外皮采自內(nèi)蒙古；其它試劑和溶劑均為市售化學(xué)純或分析純產(chǎn)品，除特別說(shuō)明外，未經(jīng)處理直接使用。
實(shí)施例1山楂酸及其芐酯的制備齊墩果酸(10.0g)懸浮于100mL無(wú)水DMF中，于100℃加熱使完全溶解，靜置稍冷后加入K2CO3(6.04g)和氯芐(3.0mL)。此混和物于100℃加熱并攪拌直至原料消失(約需3小時(shí))。冷卻后抽濾，固體以DMF洗滌3次，每次15mL。母液倒入500mL水中，邊倒邊搖使析出的固體分散，靜置待固體完全析出后，抽濾收集固體，以水充分洗滌。干燥后得白色的齊墩果酸芐酯粗產(chǎn)物11.51g(粗產(chǎn)率96％)。該粗產(chǎn)物可直接用于下一步反應(yīng)。1HNMR(CDCl3，500MHz)δ0.62，0.78，0.88，0.90，0.92，0.98，1.13(each，3H，s)，2.91(1H，dd，J＝4.4，13.9Hz，H-18)，3.20(1H，dd，J＝4.5，11.2Hz，H-3α)，5.07(2H，dd，J＝12.5，22.4Hz，CH2-Ar)，5.28(1H，t，J＝3.6Hz，H-12)，7.33(5H，m，H-Ar).
將上述齊墩果酸芐酯(10.0g)溶解于60ml無(wú)水CH2Cl2中，于冰水浴冷卻下加入PCC(6.8g)。冰水浴冷卻下攪拌，放熱趨緩后撤去冰水浴，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。此深褐色物通過(guò)硅藻土過(guò)濾，漏斗中殘留物以CH2Cl2充分洗滌。母液蒸去溶劑后得棕黃色固體。以乙醇重結(jié)晶得白色固體9.1g(收率91.0％)。3-羰基齊墩果酸芐酯1HNMR(CDCl3，500MHz)δ0.62，0.90，0.92，1.01，1.04，1.08，1.13(each，3H，s)，2.36 and 2.51(2H，m，H-2)，2.92(1H，dd，J＝4.3，13.8Hz，H-18)，5.07(2H，dd，J＝12.5，21.6Hz，CH2-Ar)，5.30(1H，t，J＝3.6Hz，H-12)，7.33(5H，m，H-Ar).
將上述3-羰基齊墩果酸芐酯(4.0g)溶于80mL醋酸異丙烯酯中，小心加入約0.5mL濃硫酸，加熱回流12小時(shí)。冷卻后，向此溶液中小心加入固體NaHCO3直至無(wú)氣泡產(chǎn)生，過(guò)濾，濾液經(jīng)濃縮蒸除過(guò)量的醋酸異丙烯酯，殘留物以乙醇重結(jié)晶得2-烯-3-乙酰氧基齊墩果酸芐酯3.81g(收率88％)。1HNMR(CDCl3，500MHz)δ0.66，0.91，0.92，0.93，1.00，1.02，1.13(each，3H，s，)，2.15(3H，s，CH3C＝O)，2.93(1H，dd，J＝4.3，13.7Hz，H-18)，5.08(2H，dd，J＝12.5，23.5Hz，CH2-Ar)，5.15(1H，dd，J＝1.9，6.6Hz，H-2)，5.33(1H，t，J＝3.6Hz，H-12)，7.36(5H，m，H-Ar).
將上述2-烯-3-乙酰氧基齊墩果酸芐酯(2.81g)以50mL絕對(duì)無(wú)水四氫呋喃溶解，以冰水浴冷卻，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下30分鐘內(nèi)滴加40mL硼烷四氫呋喃溶液(1.0M)。冰水浴冷卻下反應(yīng)3小時(shí)，再于室溫下攪拌過(guò)夜。冰水浴冷卻下向此溶液中小心滴加10％NaOH水溶液40mL，攪拌10分鐘后在冰水浴冷卻下加入30％H2O2溶液30mL，此乳濁液于冰水浴冷卻下攪拌30分鐘后再于室溫下攪拌直至無(wú)氣體產(chǎn)生。此乳濁液中加入100mL乙酸乙酯，劇烈攪拌后過(guò)濾，從濾液中分出乙酸乙酯層，水層再以乙酸乙酯萃取3次，每次50mL。合并的有機(jī)層以無(wú)水Na2SO4干燥，蒸去有機(jī)溶劑后得淡黃色固體。硅膠柱層析(梯度洗脫，石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1→5∶1→2∶1)得白色粉未狀山楂酸芐酯1.1g(41％)。1HNMR(CDCl3，500MHz)δ0.60，0.82，0.90，0.92，0.95，1.02，1.12(each，3H，s)，2.91(1H，dd，J＝4.1，13.8Hz，H-18)，3.00(1H，d，J＝9.5Hz，H-3α)，3.67(1H，ddd，J＝4.5，9.6，11.2Hz，H-2β)，5.07(2H，dd，J＝12.6，16.7Hz，CH2-Ar)，5.29(1H，t，J＝3.5Hz，H-12)，7.35(5H，m，H-Ar).
向上述山楂酸芐酯(1.06g)中加入10mL四氫呋喃，加10％Pd/C(0.15g)，室溫常壓氫化過(guò)夜，原料反應(yīng)完全后，以四氫呋喃稀釋反應(yīng)物，過(guò)濾除去Pd/C，濾液蒸去溶劑后得粉狀固體，加入適量正己烷將少量附著的顏色除去，過(guò)濾后得白色粉未狀純品山楂酸0.77g(產(chǎn)率87％)。mp 269-271℃。IR(KBr，cm-1)3414，2943，1695，1460，1051.1HNMR(pyridine-d5，300MHz)δ0.93，0.98，0.99，1.01，1.06，1.25，1.26(each，3H，s)，3.28(1H，dd，J＝3.9，13.6Hz，H-18)，3.37(1H，d，J＝9.3Hz，H-3α)，4.07(1H，ddd，J＝4.2，9.3，11.0Hz，H-2β)，5.46(1H，brs，H-18).13CNMR(pyridine-d5，300MHz)δ16.9(C-24)，17.5(C-25)，17.7(C-26)，18.9(C-6)，23.7(C-16)，23.8(C-30)，23.9(C-30)，26.2(C-27)，28.3(C-15)，29.3(C-23)，31.0(C-20)，33.2(C-7)，33.3(2C，C-22，C-29)，34.3(C-21)，38.5(C-10)，39.8(C-4)，42.0(C-19)，42.2(C-14)，46.7(C-17)，47.8(C-1)，48.2(2C，C-8，C-9)，55.9(C-5)，68.6(C-2)，83.8(C-3)，122.5(C-12)，144.9(C-13)，180.2(C-28)．上述光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)值一致(Taniguchi等，Phytochemistry，2002，59，315-323；鞠建華等，中國(guó)藥學(xué)雜志，2003年，38，752)。
實(shí)施例2熊果酸芐酯、科羅索酸及其芐酯的制備熊果酸(10.0g)懸浮于100mL無(wú)水DMF中，于100℃加熱使完全溶解，靜置稍冷后加入K2CO3(6.04g)和芐基氯(3.0mL)。此混和物于100℃加熱并攪拌直至原料消失(約需3小時(shí))。冷卻后抽濾，固體以DMF洗滌3次，每次15mL。母液倒入500mL水中，邊倒邊搖使析出的固體分散，靜置待固體完全析出后，抽濾收集固體，以水充分洗滌。干燥后得白色的熊果酸芐酯粗產(chǎn)物11.54g(粗產(chǎn)率96.4％)。1HNMR(CDCl3，300MHz)δ0.67，0.81，0.92，0.97，1.01，1.10(each，3H，s)，0.88(3H，d，J＝6.4Hz)，2.30(1H，d，J＝11.3Hz，H-18)，3.24(1H，dd，J＝4.6，10.8Hz，H-3α)，5.09(2H，dd，J＝12.5，37.9Hz，CH2-Ar)，5.26(1H，t，J＝3.4Hz，H-12)，7.36(5H，m，H-Ar).
將上述熊果酸芐酯粗產(chǎn)品(10.0g)溶解于65ml無(wú)水CH2Cl2中，于冰水浴冷卻下加入吡啶氯鉻酸鹽(PCC)(6.7g)。冰水浴冷卻下攪拌，放熱趨緩后撤去冰水浴，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。此深褐色物通過(guò)硅藻土過(guò)濾，漏斗中殘留物以CH2Cl2充分洗滌。母液蒸去溶劑后得棕黃色固體。以乙醇重結(jié)晶得3-羰基熊果酸芐酯白色固體8.96g(收率90％)。1HNMR(CDCl3，300MHz)δ0.71，0.97，1.05，1.07(each，3H，s)，0.88(3H，d，J＝6.4Hz)，1.11(6H，s)，2.31(1H，d，J＝11.3Hz，H-18)，2.55(2H，m，H-2)，5.08(2H，dd，J＝12.5，37.3Hz，CH2-Ar)，5.28(1H，t，J＝3.5Hz，H-12)，7.36(5H，m，H-Ar).
將上述3-羰基熊果酸芐酯(4.0g)溶于80mL醋酸異丙烯酯中，小心加入約0.5mL濃硫酸，加熱回流10小時(shí)。冷卻后，向此溶液中小心加入固體NaHCO3直至無(wú)氣泡產(chǎn)生，過(guò)濾，蒸除過(guò)量的醋酸乙烯酯，殘留物經(jīng)柱層析(梯度洗脫，石油醚∶乙酸乙酯＝50∶1→20∶1)分離得2-烯-3-乙酰氧基熊果酸芐酯無(wú)色油狀物3.9g(產(chǎn)率90.5％)。1HNMR(CDCl3，500MHz)δ0.68，0.91，1.007，1.015，1.08(each，3H，s)，0.86(3H，d，J＝6.5Hz，H-30)，0.93(3H，d，J＝6.3Hz，H-29)，2.14(3H，s，CH3C＝O)，2.28(1H，d，J＝11.2Hz，H-18)，5.04(2H，dd，J＝12.4，6.28Hz，CH2-Ar)，5.1 5(1H，dd，J＝1.8，6.5Hz，H-2)，5.26(1H，t，J＝3.5Hz，H-12)，7.34(5H，m，H-Ar).13CNMR(CDCl3，500MHz)δ15.6，16.8，16.9，19.3，19.5，21.0，21.1，23.2，23.3，24.2，27.89，27.93，30.7，32.4，36.1，36.6，37.4，38.8，39.1，39.4，39.8，42.1，45.9，48.1，52.6，53.0，65.9，112.0，125.7，136.3，137.9，152.1，169.7，177.2.
將上述2-烯-3-乙酰氧基熊果酸芐酯(3.9g)溶于10mL絕對(duì)無(wú)水四氫呋喃，以冰水浴冷卻，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下30分鐘內(nèi)滴加40mL硼烷四氫呋喃溶液(1.0M)。冰水浴冷卻下反應(yīng)3小時(shí)，再于室溫下攪拌過(guò)夜。冰水浴冷卻下小心滴加10％NaOH水溶液40mL，攪拌10分鐘后在冰水浴冷卻下加入30％H2O2溶液30mL，此乳濁液于冰水浴冷卻下攪拌30分鐘后再于室溫下攪拌2小時(shí)。向此乳濁液中加入100mL乙酸乙酯，劇烈攪拌后過(guò)濾，從濾液中分出乙酸乙酯層，水層再以乙酸乙酯萃取3次，每次50mL。合并的有機(jī)層以無(wú)水Na2SO4干燥，蒸去有機(jī)溶劑后得無(wú)色油狀物約4.5g。硅膠柱層析(梯度洗脫，石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1→2∶1)得科羅索酸芐酯1.5g(產(chǎn)率40％)。1HNMR(CDCl3，500MHz)δ0.63，0.81，0.96，1.03，1.07(each，3H，s，H-23 to H-27)，0.85(3H，d，J＝6.4Hz，H-30)，0.94(3H，d，J＝6.3Hz，H-29)，2.27(1H，d，J＝11.3Hz，H-18)，3.00(1H，d，J＝9.4Hz，H-3α)，3.69(1H，ddd，J＝4.3，9.4，11.0Hz，H-2β)，5.04(2H，dd，J＝12.5，57.2Hz，CH2-Ar)，5.24(1H，t，J＝3.3Hz，H-12)，7.35(5H，m，H-Ar).13CNMR(CDCl3，500MHz)16.7，16.8，16.9，17.0，18.3，21.1，23.3，23.6，24.2，27.9，28.6，30.6，32.9，36.6，38.2，38.8，39.07，39.1，39.6，42.1，46.6，47.5，48.1，52.8，55.3，66.0，69.0，83.9 125.5，136.3，138.2，177.3.
將上述科羅索酸芐酯(1.16g)溶于50mL四氫呋喃，加10％Pd/C(0.2g)，室溫常壓氫化過(guò)夜，原料反應(yīng)完全后，以四氫呋喃稀釋反應(yīng)物，過(guò)濾除去Pd/C，濾液蒸去溶劑后得粉狀固體，加入適量正己烷將少量附著的顏色除去，過(guò)濾后得白色粉未狀科羅索酸0.95g(97.6％)。mp 253-255℃；文獻(xiàn)值mp 251-254℃(鞠建華等，中國(guó)藥學(xué)雜志，2003年，38，752)。IR(KBr，cm-1)3414，2945，1695，1456，1049.1HNMR(pyridine-d5，300MHz)δ0.94(3H，s，H-29)，0.96(3H，s，H-30)，0.97(3H，s，H-25)，1.02(3H，s，H-24)，1.05(3H，s，H-26)，1.19(3H，s，H-27)，1.25(3H，s，H-23)，2.60(1H，d，J＝11.3Hz，H-18)，3.36(1H，d，J＝9.4Hz，H-3α)，4.06(1H，ddd，J＝4.3，9.4，11.1Hz，H-2 β)，5.44(1H，t，J＝3.3Hz，H-12).13CNMR(pyridine-d5，300MHz)δ17.0(C-25)，17.5(2C，C-26，C-30)，17.7(C-24)，18.9(C-6)，21.4(C-29)，23.8(C-11)，23.9(C-27)，24.9(C-16)，28.7(C-15)，29.4(C-23)，31.1(C-21)，33.5(C-7)，37.5(C-22)，38.5(C-10)，39.4(C-19)，39.5(C-20)，39.8(C-4)，40.1(C-8)，42.6(C-14)，48.0(C-1)，48.1(C-17)，53.6(C-18)，60.0(C-5)，68.6(C-2)，83.8(C-3)，125.5(C-12)，139.3(C-13)，179.9(C-28).上述光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)值一致(Taniguchi等，Phytochemistry，2002，59，315-323；鞠建華等，中國(guó)藥學(xué)雜志，2003年，38，752)。
實(shí)施例3齊墩果酸甲酯的制備齊墩果酸(5.0g)溶解于50mL無(wú)水DMF中，加入K2CO3(3.0g)和MeI(0.82mL)，室溫?cái)嚢?.5小時(shí)。加水稀釋后，以乙酸乙酯提取，合并的乙酸乙酯層依次以1mol/L鹽酸水溶液、飽和氯化鈉水溶液洗滌后，以無(wú)水硫酸鈉干燥。蒸除溶劑后得齊墩果酸甲酯的淡黃色粗品5.36g。取0.25g粗品經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑，石油醚∶乙酸乙酯＝6∶1)得純的齊墩果酸甲酯0.23g。1HNMR(CDCl3，500MHz)δ0.75，0.80，0.92，0.93，0.95，1.01，1.15(each，3H，s，)，2.88(1H，dd，J＝4.3，11.8Hz，H-18)，3.23(1H，m，H-3)，3.64(3H，s，-COOCH3)，5.30(1H，t，J＝3.5Hz，H-12).
實(shí)施例4熊果酸甲酯的制備熊果酸(1.0g)懸浮于10mL無(wú)水DMF中，加入K2CO3(0.6g)和MeI(0.15mL)，室溫?cái)嚢?小時(shí)。加水稀釋后，以乙酸乙酯提取，合并的乙酸乙酯層依次以1％鹽酸水溶液、飽和氯化鈉水溶液洗滌后，以無(wú)水硫酸鈉干燥。蒸除溶劑后得熊果酸甲酯的白色粗品1.06g.取0.13g粗品經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑，石油醚∶乙酸乙酯＝6∶1)得純的熊果酸甲酯0.12g．1HNMR(CD Cl3，500MHz)δ0.75，0.80，0.93，1.00，1.08(each，3H，s)，0.87(3H，d，J＝6.5Hz)，0.95(3H，d，J＝6.2Hz)，2.24(1H，d，J＝10.5Hz，H-18)，3.22(1H，dd，J＝5.0，11.1Hz，H-3α)，3.61(3H，s，-COOCH3)，5.25(1H，t，J＝3.6Hz，H-12).
實(shí)施例5科羅索酸甲酯的制備科羅索酸(0.2g)懸浮于5mL無(wú)水DMF中，加入K2CO3(0.2g)和MeI(0.1mL)，室溫?cái)嚢?小時(shí)。加水稀釋后，以乙酸乙酯提取，合并的乙酸乙酯層依次以1％鹽酸水溶液、飽和氯化鈉水溶液洗滌后，以無(wú)水硫酸鈉干燥。蒸除溶劑后得科羅索酸甲酯的粗品。硅膠柱層析(梯度洗脫，石油醚∶乙酸乙酯＝15∶1→3∶1)得科羅索酸甲酯白色固體0.18g.1HNMR(CDCl3，500MHz)δ0.77，0.85，1.02，1.06，1.10(each，3H，s)，0.88(3H，d，J＝6.5Hz，H-30)，0.96(3H，d，J＝6.1Hz，H-29)，2.26(1H，d，J＝11.2Hz，H-18)，3.02(1H，d，J＝9.5Hz，H-3α)，3.62(3H，s，-COOCH3)，3.72(1H，ddd，J＝4.5，9.5，11.0Hz，H-2β)，5.27(1H，t，J＝3.6Hz，H-12).
實(shí)施例6山楂酸甲酯的制備山楂酸(0.25g)懸浮于5mL無(wú)水DMF中，加入K2CO3(0.25g)和MeI(0.15mL)，室溫?cái)嚢?小時(shí)。加水稀釋后，以乙酸乙酯提取，合并的乙酸乙酯層依次以1％鹽酸水溶液、飽和氯化鈉水溶液洗滌后，以無(wú)水硫酸鈉干燥。蒸除溶劑后得山楂酸甲酯的粗品。硅膠柱層析(梯度洗脫，石油醚∶乙酸乙酯＝15∶1→3∶1)得山楂酸甲酯白色固體0.21g.1HNMR(CDCl3，500MHz)0.74，0.85，0.92，0.95，1.00，1.05，1.15(each，3H，s)，2.89(1H，dd，J＝4.4，14.0Hz，H-18)，3.00(1H，d，J＝9.5Hz，H-3α)，3.64(3H，s，-COOCH3)，3.71(1H，ddd，J＝4.4，9.5，11.1Hz，H-2β)，5.27(1H，t，J＝3.6Hz，H-12).
實(shí)施例7糖原磷酸化酶抑制活性的篩選實(shí)驗(yàn)測(cè)試原理糖原在細(xì)胞內(nèi)的分解，是由糖原磷酸化酶(GPa)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。此酶作用于糖原的非還原端，可將一個(gè)葡萄糖殘基分解下來(lái)，并將它轉(zhuǎn)移到無(wú)機(jī)磷酸鹽上去。于是在長(zhǎng)鏈縮短的同時(shí)，生成G-1-P，同時(shí)游離出新的末端，使磷酸化酶又可以起作用。此反應(yīng)為可逆反應(yīng)。在逆反應(yīng)中，即糖原合成方向上，G-1-P作為底物，每加入糖原中一個(gè)葡萄糖會(huì)釋放一個(gè)磷酸根，在酸性條件下，磷酸根與鉬酸銨和孔雀綠的混合液發(fā)生反應(yīng)，通過(guò)測(cè)定溶液反應(yīng)顏色的變化，反映磷酸根的釋放量，從而間接反映磷酸化酶的活性。
儀器與試劑酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-RAD公司)；數(shù)顯示水浴鍋(國(guó)華電器有限公司)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；臺(tái)式離心機(jī)(上海手術(shù)器械廠)；高壓滅菌鍋(上海醫(yī)用核子儀器廠)；752分光光度計(jì)；96孔板(美國(guó)COSTAR公司)；rabbit肌糖原磷酸化酶(GPa)、葡萄糖-1-磷酸(G-1-P)、糖原(Glycogen)、孔雀綠(美國(guó)SIGMA公司)；咖啡因(caffeine)(上海試劑二廠)；Hepes、EGTA、EDTA(南京生興生物技術(shù)有限公司)；四水合鉬酸銨(合肥工業(yè)大學(xué)化學(xué)試劑廠)；Glycylglycine(美國(guó)Amersco公司)；NaF(上?；瘜W(xué)試劑有限公司)。
試劑的配制1)顯色液的配制稱量鉬酸銨5g，溶解于500ml 1M HCl中，用攪拌器攪拌，至全部溶解后在加入孔雀綠190mg，繼續(xù)攪拌至全部溶解，并用錫箔紙避光；2)緩沖液的配制①精密稱量Hepes 0.5958g，溶于5ml H2O中，用10M NaOH調(diào)PH至7.2，配制成終濃度為0.5M的Hepes；②精密稱量KCl 0.3728g，溶于5ml H2O中，配制成終濃度為1M的KCl；③精密稱量MgCl20.0255g，溶于1ml H2O中，配制成終濃度為125mM的MgCl2；④精密稱量EGTA 0.0476g，溶于5ml H2O中，用10M NaOH調(diào)PH至7.0，配制成終濃度為25mM的EGTA；⑤精密稱量G-1-P 0.0152g，溶于10ml H2O中，配制成終濃度為5mM的G-1-P；⑥精密稱量glycogen 10mg，溶于1ml H2O中，配制成終濃度為10mg/ml的glycogen；3)陽(yáng)性藥caffeine溶液的配制將caffeine溶于10ml H2O配制0.5、5、50和500μM的溶液；4)配制GPa溶液取1μl的GPa加入到100μl反應(yīng)體系中，終濃度為250ng/100μl；5)待測(cè)試化合物溶液的配制將待測(cè)試化合物溶于DMSO配制成濃度為10mM溶液，取2μl化合物溶液加入到反應(yīng)體系中，終濃度為20μM.
測(cè)定rabbit肌糖原磷酸化酶活性的量效曲線通過(guò)讀取不同濃度的GPa加入顯色液后的在655nm下的OD值，來(lái)測(cè)定其量效曲線。由量效曲線可選擇GPa的量為250ng.
測(cè)定rabbit的肌糖原磷酸化酶的caffeine抑制曲線所測(cè)得的caffeine的IC50為57.54257μM，與文獻(xiàn)報(bào)道的IC50基本一致。
實(shí)驗(yàn)步驟1)設(shè)計(jì)PC(陽(yáng)性對(duì)照)、Blank(空白對(duì)照)、陽(yáng)性藥(咖啡因)；2)加反應(yīng)buffer52μl；3)加測(cè)試化合物至終濃度；4)加酶1μl，終濃度為250ng/100μl；5)加顯色液150μl；6)20～25攝氏度條件下反應(yīng)20分鐘；7)在波長(zhǎng)655nm條件下比色；8)數(shù)據(jù)的讀取及抑制率的計(jì)算抑制率＝[陽(yáng)性對(duì)照-待測(cè)樣品]/[陽(yáng)性對(duì)照-空白對(duì)照]。
測(cè)試結(jié)果表1列出了部分五環(huán)三萜化合物對(duì)rabbit肌糖原磷酸化酶的抑制活性數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示，科羅索酸、熊果酸、齊墩果酸、山楂酸、白樺脂酸、白樺脂醇及上述化合物的酯類衍生物等對(duì)糖原磷酸化酶具有顯著的抑制活性。
表1 五環(huán)三萜化合物對(duì)兔肌糖原磷酸化酶的抑制活性

實(shí)施例8對(duì)腎上腺素誘發(fā)的高血糖小鼠抑制血糖升高活性實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑昆明種小白鼠，體重20-23g，雌雄各半，由江寧青龍山動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)提供，許可證號(hào)SCXK(蘇)2002-0018，受試前在本室適應(yīng)三天。腎上腺素注射液，武漢制藥集團(tuán)股份有限公司。
方法取健康昆明種小白鼠，10只/組，隨機(jī)均分以下各試驗(yàn)組溶媒對(duì)照組(0.5％CMC)，格列美脲組(10mg·kg-1)和待測(cè)化合物組(劑量分別為40和100mg·kg-1)。按實(shí)驗(yàn)分組連續(xù)給藥7天，末次給藥前禁食過(guò)夜，在試驗(yàn)當(dāng)日給藥同時(shí)皮下注射腎上腺素150μg·kg-分別在各組小鼠給藥前和給藥后不同時(shí)間經(jīng)小鼠眼眶靜脈叢取血，葡萄糖氧化酶法測(cè)定血糖值。
結(jié)果表2和表3列出了科羅索酸、熊果酸、山楂酸和齊墩果酸對(duì)腎上腺素誘導(dǎo)的小鼠高血糖模型的抑制血糖升高活性數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示，科羅索酸、熊果酸、山楂酸和齊墩果酸對(duì)腎上腺素誘導(dǎo)的小鼠血糖升高均有顯著的抑制活性。
表2、實(shí)驗(yàn)化合物對(duì)腎上腺素誘導(dǎo)的小鼠高血糖模型的抑制血糖升高mean±SD，n＝10.*P＜0.05，**P＜0.01，vs control

表3、實(shí)驗(yàn)化合物對(duì)腎上腺素誘導(dǎo)的小鼠高血糖模型的抑制血糖升高mean±SD，n＝9.*P＜0.05，**P＜0.01，vs control。

權(quán)利要求
1.下述式I和式II所示的五環(huán)三萜化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽或酯在制備抑制糖原磷酸化酶藥物中的應(yīng)用， 式I中，R1代表氫或羥基；R2代表氫、1～10個(gè)碳的直鏈或支鏈烷基、芐基；R3和R4分別代表氫或甲基，并且R3和R4不同時(shí)為氫；式II中，R5代表CH3、CH2OH、COOR6，這里R6代表氫、1～10個(gè)碳的直鏈或支鏈烷基、芐基。
2.權(quán)利要求1的五環(huán)三萜化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽或酯，其特征在于式I中，R2代表氫、1～6個(gè)碳的直鏈或支鏈烷基、芐基式II中，R6代表氫、1～6個(gè)碳的直鏈或支鏈烷基、芐基。
3.權(quán)利要求1的五環(huán)三萜化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽或酯，其特征在于式I中，R2代表甲基、乙基、異丙基；式II中，R6代表甲基、乙基、異丙基。
4.權(quán)利要求1的五環(huán)三萜化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽或酯，其特征在于式I所代表的化合物包括山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸、熊果酸及它們藥學(xué)上可接受的鹽或酯；式II所代表的化合物包括白樺脂醇、白樺脂酸、羽扇豆醇及它們藥學(xué)上可接受的鹽或酯。
5.權(quán)利要求4的五環(huán)三萜化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽或酯，其特征在于式I所代表的化合物包括山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸、熊果酸及它們的甲酯、乙酯或芐酯；式II所代表的化合物包括白樺脂醇、白樺脂酸、羽扇豆醇及白樺脂酸的甲酯、乙酯或芐酯。
6.權(quán)利要求1所述五環(huán)三萜化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽或酯在制備抑制糖原磷酸化酶藥物中的應(yīng)用，包括在制備抗糖尿病藥物上的應(yīng)用。
7.具有糖原磷酸化酶抑制作用的藥物組合物，含有權(quán)利要求1所述五環(huán)三萜類化合物及其鹽或酯和藥學(xué)上可接受的載體。
8.權(quán)利要求7的藥物組合物，所述五環(huán)三萜類化合物選自山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸、熊果酸、白樺脂醇、白樺脂酸、羽扇豆醇或其藥學(xué)上可接受的鹽或酯。
9.權(quán)利要求8的藥物組合物，所述五環(huán)三萜類化合物選自山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸、熊果酸、白樺脂醇、白樺脂酸、羽扇豆醇或其藥學(xué)上可接受的甲酯、乙酯或芐酯。
10.權(quán)利要求7的藥物組合物，所述抑制糖原磷酸化酶作用包括抗糖尿病作用。
全文摘要
五環(huán)三萜類化合物在制備抑制糖原磷酸化酶藥物中的應(yīng)用，包括含山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸、熊果酸、白樺脂醇、白樺脂酸、羽扇豆醇或其藥學(xué)上可接受的鹽或酯的藥物組合物在制備治療糖尿病藥中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1682740SQ20051003809
公開日2005年10月19日 申請(qǐng)日期2005年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月11日
發(fā)明者孫宏斌, 溫小安, 柳軍, 張陸勇, 王善治, 倪沛洲 申請(qǐng)人:中國(guó)藥科大學(xué)